CA2在鼻咽癌中的检测、治疗的应用的制作方法

本发明涉及CA2在鼻咽癌中的检测、治疗的应用。

背景技术：

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma, NPC）是一种病灶位于鼻咽部的恶性肿瘤，一旦发病即表现为快速进展，并具高度的侵袭和转移特性，并伴有头痛、耳鸣、听力或视力下降。同时，鼻咽癌发病极具区域性，高发于中国南部地区、东南亚、中东及非洲南部，其在广东省的发病率高达10~30人每十万人每年。随着病程的发展，患者的5年生存率急速下降，如临床I期病人的5年生存率达90%，而临床IV期的晚期病人，5年生存率则仅剩58%。因此，若不及早发现并治疗，鼻咽癌将对患者生命造成极大威胁。

然而，鼻咽癌的早期诊断一直是个难题，主要是因为鼻咽癌病灶隐蔽，病症不明显，难以发现，医院检出的鼻咽癌大多数已是晚期。此外，由于缺乏兼顾灵敏度高及特异性好的血清学诊断标志物，使鼻咽癌难以成为医院常规检查项目。目前，鼻咽癌的诊断方法主要依赖于借助鼻内窥镜的组织活检，具有一定的侵入性。另外，由于鼻咽癌与EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）感染高度相关，临床上也使用EB病毒的核酸或蛋白作为辅助诊断指标或筛查指标，如EBV capsid antigen IgA (VCA-IgA), early antigen Ig A (EA-IgA), nuclear antigen (EBNA1) IgA, circulating EBV DNA等。但由于EB病毒感染在人群中较为常见，上述指标并不能作为确证的诊断指标。虽然在科学研究中也发现一些直接来源于患者本身且具潜在诊断意义的生物标志物，但并未应用至临床，如Bmi-1， HMGB1，KLHDC4等。鼻咽癌的治疗以常规的放化疗为主，虽然取得一定的效果（治疗后3年正常生存率达80%），但目前尚未存在特效药。而且，不同癌症之间差异很大，主要体现在不同癌症的细胞内生物进程不一样，各种蛋白表达量也不一样。某些蛋白在某种癌症中高表达，在另一种癌症中可能表达量很低。所以，某一癌症的标志物或特效药的效果并不能在其它癌症中得到预测，更不能移植到另一癌症中使用。因此，临床上亟需直接来源于患者本身的、特异性好的用于鼻咽癌诊断的单一生物标志物。

本发明公开的人类碳酸酐酶2（Carbonic anhydrase 2，CA2）由于其在鼻咽癌中特异性地高表达，并且在其他癌症中，例如结直肠癌、肾细胞癌、肝细胞癌中表达量下调，因此可以作为鼻咽癌特异性的标志物应用于鼻咽癌的检测、治疗中。

技术实现要素：

本发明公开了CA2在鼻咽癌中的检测、治疗的应用。

本发明采取的方案是：

CA2定量试剂在制备鼻咽癌诊断试剂中的应用。

优选的，所述诊断试剂的检测样品中含有CA2蛋白的抗体。

优选的，诊断试剂所能检测的样本是组织、血液、血清。

一种判断鼻咽癌的标准，其特征在于，当CA2的表达水平超过正常人2.5倍以上时，判断患有鼻咽癌。

CA2作为鼻咽癌检测、治疗靶点的应用。

一种肿瘤治疗药剂，其特征在于，药剂中含有CA2的拮抗剂。

本发明的有益效果是：

本发明公开了CA2在鼻咽癌中的表达量有明显的上升的特点，这说明CA2具有成为鼻咽癌辅助诊断标记物的潜能。同时也说明了，CA2抑制剂在制备治疗鼻咽癌的药物组合物上极具临床应用价值，为鼻咽癌的有效治疗提供了新的思路。

附图说明

图1为组织芯片免疫组化测定结果。

图2为蛋白免疫印迹测定结果。

具体实施方式

通过下面具体实验例对本发明作进一步的详细描述，便于理解本发明的技术方案，但本发明的实施方式不限于此。

实验例1：Super-SILAC MS

将9例鼻咽癌和9例正常对照的鼻咽组织样品分别切碎，加入1% SDS裂解液，液氮研磨，超声处理，17,000 × g离心 30 min去沉淀。癌症组及正常组中各样品分别取等量蛋白混合。两组混合蛋白样品分别与super-SILAC标记蛋白按质量比1:1混合，进行下一步的超滤管酶解。每组样品在8 M尿素及50 mM DTT中变性，加入100 mM IAA烷基化，然后转移至超滤管中用8 M尿素及50 mM碳酸氢铵洗。接着按质量比1:30加入胰酶孵育8 h。离心收集酶解后的肽段，用TripleTOF® 5600 MS (AB SCIEX) 进行shotgun模式质谱分析。用ProteinPilot® (AB SCIEX) 软件搜库（UniProt人类全蛋白数据库）后得到蛋白定量结果。其中，癌症组CA2蛋白与标记蛋白表达量之比为27.58，正常组与标记蛋白表达量之比为10.31，CA2的相对表达量（癌症组/对照组）是2.67。

实验例2：SWATH-MS

将5例鼻咽癌和6例正常对照的鼻咽组织样品分别切碎，加入1% SDS裂解液，液氮研磨，超声处理，17,000 × g离心 30 min去沉淀后，进行下一步的超滤管酶解。每组样品在8 M尿素及50 mM DTT中变性，加入100 mM IAA烷基化，然后转移至超滤管中用8 M尿素及50 mM碳酸氢铵洗。接着按质量比1:30加入胰酶孵育8 h。离心收集酶解后的肽段，用TripleTOF® 5600 MS (AB SCIEX) 进行SWATH模式质谱分析。用ProteinPilot® (AB SCIEX) 软件搜库（UniProt人类全蛋白数据库）及PeakView® (AB SCIEX) 软件分析后得到每例样品蛋白非标记定量结果。其中，癌症组定量值分别为390256.1，560929.5，266646.4，1934358.4，78910.2，均值为646220.1；正常组定量值分别为135438.6，245280.5，47071.3，123667.2，110478.4，16571.5，均值为113084.6。CA2的平均相对表达量（癌症组/对照组）是5.71。

实验例3：免疫组化

对含有52例鼻咽癌组织切片样本及13例正常对照组织切片样本的组织芯片用the SuperPicture™ 3rd Gen IHC Detection Kit (ThermoFisher)进行免疫组化。用Carbonic anhydrase 2抗体（1:100稀释，义翘神州）进行孵育，然后用DAB染色，苏木精（Hematoxylin）复染。染色结果以Histologic Score（染色强度分值×染色细胞所占比例）表示。对染色结果进行分析，结果如图1所示，CA2的表达量在癌症组中的中值为44.38，在正常组中的中值为0。CA2的表达量在癌症组和正常组中差异显著（Kolmogorov–Smirnov test, two-tailed，P < 0.01），在癌症组中比在正常组中明显升高。同时，CA2在receiver operating characteristic (ROC)分析中呈现较高的诊断功效（The Area Under Curve (AUC) = 0.94）。

实验例4：蛋白免疫印迹

将鼻咽癌和正常对照的鼻咽组织样品分别切碎，加入1% SDS裂解液，液氮研磨，离心去沉淀后，超声处理，测定蛋白浓度。各样品各取10μg蛋白加入10% SDS聚丙烯酰氨凝胶中进行电泳。将分离开的蛋白全部转印至PVDF膜上。对用脱脂牛奶封闭后的PVDF膜加入兔抗Carbonic anhydrase 2抗体（1:2000稀释，武汉三鹰），4℃孵育过夜。用含0.2%吐温20的TBS洗膜3次，每次5 min。然后加入羊抗兔二抗（1:2000稀释，Bioworld），室温孵育1 h。用含0.2%吐温20的TBS洗膜3次，每次5 min。之后加入发光液显影，拍照。显色条带强度用灰度值表示。鼻咽癌组（NPC）的灰度值为41516.75，正常组（Normal）的灰度值为4121.78。鼻咽癌组中CA2的表达量是正常组中的10.07倍，表明CA2在癌症组中高表达（见图2）。