检测雌二醇和/或苯甲酸雌二醇的方法及其所用酶联免疫试剂盒与流程

本发明涉及酶联免疫检测领域中检测雌二醇和/或苯甲酸雌二醇的方法及其所用酶联免疫试剂盒。
背景技术：
：雌酮、雌二醇、雌三醇是动物体内存在的天然雌激素，其中雌二醇(Estradiol,E2)作为动物繁殖相关最具活性的天然性激素之一，具有促进雌性未成年动物性器官的形成、第二性征的发育和促进母畜发情等功能，而且在促进机体生长和提高生产性能等方面作用显著。雌二醇及其衍生物(苯甲酸雌二醇)在畜牧业生产中被广泛应用，然而如果违规用药或者未按照休药期生产动物性食品，容易造成畜禽产品--肉、蛋、奶中雌二醇的残留，进而通过食物链危害人们健康。近年来儿童性早熟、妇女乳腺癌，男性精子畸形率增加等健康问题呈上升趋势，在某种程度上均与动物源性食品中雌二醇等促生长、生产性激素的残留有关。雌二醇等激素类药物诱发的食品安全问题越发尖锐，为保证动物性食品卫生安全，我国农业部公告第176号文件明确规定在饲料及饮用水中严禁加入雌二醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇等激素类药物；以及在农业部公告193号文件《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中规定，所有食用动物禁止使用苯甲酸雌二醇(标志残留物为雌二醇)、甲基睾丸酮、苯丙酸诺龙等性激素类药物[5]，因此检测可食性畜产品中的雌二醇残留是确保食品安全的重要措施。目前激素类药物残留检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC/MS/MS)和气相色谱-质谱联用方法(GC-MS)等分析方法。上述仪器方法虽然灵敏度高，但需要精密的仪器，没有反复的提取和净化过程难以达到精确的检测目的，因此在生产实践中难以普及。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何快速、灵敏、低成本、特异性、高通量地检测雌二醇和/或苯甲酸雌二醇。为了解决以上技术问题，本发明提供了检测雌二醇或苯甲酸雌二醇的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的检测雌二醇或苯甲酸雌二醇的酶联免疫试剂盒，包括雌二醇包被原和雌二醇特异性抗体；所述雌二醇包被原是雌二醇半抗原与载体蛋白1的偶联物；所述雌二醇特异性抗体为以所述雌二醇半抗原与载体蛋白2的偶联物为免疫原得到的多克隆抗体或单克隆抗体；所述载体蛋白1和所述载体蛋白2是相同或不同的载体蛋白；所述雌二醇半抗原为式1的化合物：上述酶联免疫试剂盒中，采用碳二亚胺法制备所述雌二醇包被原和所述雌二醇半抗原与载体蛋白2的偶联物。上述酶联免疫试剂盒中，所述雌二醇半抗原与载体蛋白2的偶联物的偶联比为11.8:1。上述酶联免疫试剂盒中，所述载体蛋白1和所述载体蛋白2可为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清白蛋白、甲状腺球蛋白或兔血清白蛋白；具体的，所述载体蛋白1可为鸡卵白蛋白，所述载体蛋白2可为牛血清白蛋白。上述酶联免疫试剂盒中，所述雌二醇特异性抗体可为兔源、鼠源、马源、羊源、猪源、兔源或豚鼠源抗体。所述多克隆抗体具体可为兔多克隆抗体。上述酶联免疫试剂盒还可包括进行酶联免疫检测所需的包被缓冲液、洗涤液、封闭液、二抗稀释液和/或雌二醇标准溶液。上述酶联免疫试剂盒中，所述封闭液含有体积百分含量为10％的小牛血清。上述酶联免疫试剂盒中，所述二抗稀释液含有体积百分含量为5％的小牛血清。上述酶联免疫试剂盒还可包括用于固定所述雌二醇包被原的固相载体。上述酶联免疫试剂盒中，可作为所述固相载体的物质很多，如聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该固相载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。为了解决以上技术问题，本发明提供了检测雌二醇和/或苯甲酸雌二醇的方法。本发明所提供的检测雌二醇和/或苯甲酸雌二醇的方法，包括利用上述酶联免疫试剂盒检测待测样品中的雌二醇和/或苯甲酸雌二醇的含量。上述方法包括：1)抗原包被：将所述雌二醇包被原固定在所述固相载体表面，形成固相抗原；2)洗涤：用洗涤液进行洗涤；3)封闭：用封闭液进行封闭；4)加待测样品：加入所述雌二醇特异性抗体和待测样品，在4℃反应1h；5)加酶标二抗：加入用二抗稀释液稀释的酶标二抗，进行反应；6)显色：进行显色反应；7)终止反应，测定待测样品中的雌二醇和/或苯甲酸雌二醇的含量。上述方法中，所述抗原包被中，所述雌二醇包被原以0.9μg/ml的浓度包被固相载体。上述方法中，所述封闭液可含有体积百分含量为10％的小牛血清。上述方法中，所述二抗稀释液含有体积百分含量为5％的小牛血清。上述方法中，所述显色反应时间为9分钟。上述方法中，所述待测样品为离体的样品，如动物性食品。上述方法或上述酶联免疫试剂盒在检测雌二醇和/或苯甲酸雌二醇中的应用也属于本发明的保护范围。本发明通过烷化反应利用溴乙酸引入活性基团羧基将雌二醇(E2)改造为雌二醇-3-羧甲基醚(E2-3-CME)，采用碳二亚胺法偶联载体蛋白(BSA或OVA)合成人工抗原，免疫实验兔制备获得高效价、特异性强的雌二醇多克隆抗体。间接竞争ELISA(icELISA)类似物交叉反应试验结果表明，本发明所制备获得的雌二醇多克隆抗体与雌三醇、炔雌醚、戊酸雌二醇、己烯雌酚、壬基酚的交叉反应率均小于0.1％，而与苯甲酸雌二醇、雌酮、炔雌醇的交叉反应率分别达150％、3.11％、1.52％。经过优化反应体系中诸多反应条件，如包被抗原浓度、洗涤液离子强度、一抗反应温度和底物TMB显色时间等反应条件，利用本发明所制备获得的雌二醇多克隆抗体和雌二醇包被原建立了间接竞争ELISA法(icELISA)，其IC50为0.129ng/ml，IC20-IC80线性范围为0.0279ng/ml-0.597ng/ml。本发明的检测雌二醇和/或苯甲酸雌二醇的方法不仅能大批量检测样品，且具有操作简单、价格低廉、检测迅速、特异性强、高通量等优点，本发明应用于畜产品雌二醇残留检测。附图说明图1为雌二醇半抗原改造过程。图2为碳二亚胺法偶联BSA或OVA合成人工抗原。图3为雌二醇半抗原改造产物质谱鉴定图。图4为人工抗原BSA-E2紫外扫描鉴定。其中，从上至下的三个曲线依次为E2、BSA和BSA-E2。图5为人工抗原OVA-E2紫外扫描鉴定。其中，从上至下的三个曲线依次为E2、OVA和OVA-E2。图6为人工抗原BSA-E2的MALDI-TOF检测质谱图。其中A为BSA，B为BSA-E2。图7为icELISA测定雌二醇的标准曲线。其中，横坐标为雌二醇溶液浓度(ng/ml)。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、间接竞争ELISA法检测雌二醇1.实验材料1.1仪器：美国Thermo公司MultiskanGO型全波长酶标仪、Eppendorf高速冷冻离心机(型号5810R)、Thermo公司二氧化碳培养箱等。1.2试剂：雌二醇、雌三醇、戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇等标准品购自中国药品生物制品检定所；雌酮、己烯雌酚、炔雌醚等标准品购自中国食品药品检定研究院；炔雌醇、壬基酚购自德国Dr.EhrenstorferGmbH公司；牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)、二甲基亚砜(DMSO)、弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FICA)、酪蛋白(casein)、Proclin300、TritonX-100和Tween-20均购自Sigma公司；HRP标记羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；N,N二甲基甲酰胺(DMF)、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、NaCl、KCl、KH2PO4、Na2SO4、Na2HCO3、NaHCO3、二氯甲烷、甲醇和蔗糖购自国药集团化学试剂有限公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；TMB单组份显色液购自北京Solarbio生物科技有限公司。本实施例中的相关溶液如下：浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液的配制：8.5gNaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.59gNaH2PO4·2H2O，1L去离子水。包被缓冲液：0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Na2CO31.59g/L和NaHCO32.93g/L。洗涤液:下述实施例中涉及三种洗涤液，分别命名为0.1％吐温洗涤液、0.5％吐温洗涤液和1.0％吐温洗涤液。这三种洗涤液的区别仅在于吐温的含量。每1升三种洗涤液均按照如下方法配制：在浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温20和叠氮化钠，得到三种洗涤液。0.1％吐温洗涤液、0.5％吐温洗涤液和1.0％吐温洗涤液中，叠氮化钠的含量均为5g/L，吐温20的含量分别为1mL/L、5mL/L和10mL/L。浓度为0.02M，pH值为7.4的PBS缓冲液的配制：17gNaCl、0.4gKCl、5.8gNa2HPO4·12H2O、1.18gNaH2PO4·2H2O，1L去离子水。封闭液：在浓度为0.02M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加入蔗糖、酪蛋白和小牛血清，得到小牛血清含量不同的三种封闭液，分别命名为10％小牛血清封闭液、5％小牛血清封闭液和1％小牛血清封闭液。这三种封闭液中蔗糖的含量均为5g/100mL，酪蛋白的含量均为0.25g/100mL，小牛血清的含量不同，10％小牛血清封闭液中小牛血清含量为10％(体积百分含量)，5％小牛血清封闭液中小牛血清含量为5％(体积百分含量)，1％小牛血清封闭液中小牛血清含量为1％(体积百分含量)。二抗稀释液：在浓度为0.02M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加入小牛血清，得到小牛血清含量不同的五种二抗稀释液，分别命名为1％小牛血清二抗稀释液、3％小牛血清二抗稀释液、5％小牛血清二抗稀释液、7％小牛血清二抗稀释液和10％小牛血清二抗稀释液。1％小牛血清二抗稀释液中小牛血清含量为1％(体积百分含量)，3％小牛血清二抗稀释液中小牛血清含量为3％(体积百分含量)，5％小牛血清二抗稀释液中小牛血清含量为5％(体积百分含量)，7％小牛血清二抗稀释液中小牛血清含量为7％(体积百分含量)，10％小牛血清二抗稀释液中小牛血清含量为10％(体积百分含量)。1.3实验动物成年日本大耳白兔购自温州医科大学实验动物中心。2.试验方法2.1人工抗原(雌二醇包被原和雌二醇免疫原)的制备及鉴定本实验制备了雌二醇包被原OVA-E2和雌二醇免疫原BSA-E2。雌二醇包被原OVA-E2是雌二醇半抗原与载体蛋白1—OVA的偶联物(图2中的偶联产物)；雌二醇免疫原BSA-E2为所述雌二醇半抗原与载体蛋白2—BSA的偶联物(图2中的偶联产物)；所述雌二醇半抗原为式1的化合物(雌二醇-3-羧甲基醚(E2-3-CME))：具体方法如下：2.1.1改造雌二醇得到雌二醇半抗原雌二醇本身无活性基团不具备偶联条件，因此需要进行分子改造。利用烷化反应通过溴乙酸将雌二醇分子引入活性羧基，结构修饰过程如图1所示。具体方法如下：本试验利用雌二醇与溴乙酸的亲核取代反应，而引入活性羧基，结构修饰过程如图1所示。具体方法如下：(1)将雌二醇(1eq1g)与氢氧化钠(18eq2.65g)溶于二甲亚砜(100ml)，30℃下搅拌至溶解；(2)将溴乙酸(2eq1g)加到反应液中，在40℃下反应过夜；(3)将反应液倒入冰水(100ml)中，稀盐酸调pH至6，乙酸乙酯(三次共100ml)萃取3次；(4)将萃取液以饱和食盐水(50ml)洗涤1次，无水硫酸钠干燥；(5)将乙酸乙酯层蒸干后，用柱层析法(二氯甲烷:甲醇＝20:1)分离，即得到雌二醇改造产物(E2改造产物)。改造产物利用质谱法检测改造效果。对改造产物进行质谱鉴定，结果如图3所示。E2分子量为272，引入活性羧基后分子量变为330，再加上Na+分子量达到353，因此改造产物的分子量为353，由质谱扫描结果可知，出现的353的分子离子峰即为目标产物峰。表明雌二醇半抗原改造成功，改造产物的结构为上述式1所示的雌二醇半抗原，可用于下一步载体蛋白的偶联。2.1.2碳二亚胺法合成人工抗原雌二醇包被原OVA-E2和雌二醇免疫原BSA-E2分别以EDC和DCC两种碳二亚胺作为失水剂，以NHS作为连接基(spacer)与载体蛋白(BSA/OVA)偶联合成雌二醇人工抗原，偶联过程如图2所示。操作步骤如下：(1)称取15mg雌二醇改造产物溶于2mlDMF中；(2)向其中加入15mgNHS与15mgEDC，室温搅拌反应2h；(3)将40mgBSA溶解于6.0ml溶解液(由5.6ml浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液和0.4mlDMF组成)；(4)将(2)中的溶液缓慢地逐滴滴加到(3)中，待药物与蛋白混合均匀后，冰水浴搅拌4h；(5)以浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液为透析液，于4℃条件下透析，每隔8小时换液一次，透析72h；(6)透析完毕，6000rpm离心除去沉淀物，取上清分装，于-20℃保存，得到雌二醇免疫原BSA-E2。(7)以同样方式制备E2偶联OVA蛋白得到雌二醇包被原OVA-E2，作检测原。2.1.3人工抗原的分析和鉴定(1)分别以BSA和OVA作为对照，利用SDS-PAGE蛋白电泳初步分析偶联产物的偶联效果；在200-340nm波长范围内利用紫外光谱吸收法紫外扫描，吸收光谱图用于分析偶联效果；以红外光谱和质谱法进行纯度鉴定和结构分析；设立10mMPBS(PH＝7.4)作为空白对照，对偶联产物进行光度测量，根据公式计算蛋白浓度。蛋白浓度(mg/ml)＝(1.55×OD280nm-0.757×OD260nm)×(10/0.5)紫外光谱扫描法初步鉴定合成的人工抗原，对比载体蛋白BSA(OVA)偶联产物最大吸收峰均产生偏移，雌二醇在230nm有最大紫外吸收峰，偶联BSA/OVA最大吸收峰偏移至210nm(图4和5)，说明雌二醇半抗原和载体蛋白偶联成功，得到雌二醇包被原OVA-E2和雌二醇免疫原BSA-E2，其结构为图2中的偶联产物。(2)采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOF-MS)对合成的人工抗原雌二醇包被原OVA-E2和雌二醇免疫原BSA-E2进行测定，判断半抗原与蛋白是否偶联成功，并计算偶联比。E2人工抗原(BSA-E2)MALDI-TOF检测由中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室测定，检测结果如图6所示，BSA分子量测定为65809.07，人工抗原分子量测定为69709.26，BSA-E2中BSA和雌二醇半抗原的偶联比为11.8:1。说明雌二醇半抗原和OVA也偶联成功。2.2雌二醇特异性抗体的制备该雌二醇特异性抗体为以2.1制备的BSA-E2为免疫原免疫兔得到的多克隆抗体。具体方法如下：以成年日本大耳白兔作为免疫动物，免疫前耳缘静脉采血并分离血清作为阴性血清，以2.1制备的BSA-E2作为免疫抗原，将相应剂量的免疫原与等量佐剂乳化，免疫方式以及免疫程序如表1所示，第一次免疫(首免)30天后进行第二次免疫(二免)，之后每隔30天进行一次免疫直至第八次免疫(八免)，第八次免疫30天后进行第一次耳缘静脉加强免疫(第一次加强)，第一次加强免疫后14天进行第二次耳缘静脉加强免疫(第二次加强)，第二次加强免疫后14天进行第三次耳缘静脉加强免疫(第三次加强)，第三次加强免疫后14天，心脏大量采血获取血清得到雌二醇特异性抗体，该血清以下简称阳性血清。应用间接ELISA法检测血清抗体效价。其中，首免用的免疫佐剂为FCA，二免至八免用的免疫佐剂为FICA，第一次加强至第三次加强用的免疫佐剂为生理盐水(NS)。表1免疫方式以及免疫程序NS:生理盐水。免疫剂量以每只兔注射的免疫原的质量计。2.3优化前的icELISA实验方法2.3.1抗原包被浓度和血清稀释度摸索棋盘法确定间接ELISA法抗原包被浓度和血清稀释浓度。用包被缓冲液稀释2.1的雌二醇包被原OVA-E2(原液浓度为1.8mg/ml)至500倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、5000倍以及10000倍，以其8个稀释度分别包被酶标板。用包被缓冲液稀释将2.2制备的阳性血清稀释成20万倍、30万倍、40万倍、50万倍4个稀释度，同时采用兔阴性血清(1000倍稀释)作为对照，以上各包被浓度和不同阳性血清稀释度条件下，测定阳性血清(PC,positivecontrol)OD值/阴性血清(NC,negativecontrol)OD值，以PC/NC比值最大作为判定条件确定最佳包被浓度和血清稀释浓度。具体方法如下：(1)包被:用包被缓冲液稀释2.1的雌二醇包被原OVA-E2(原液浓度为1.8mg/ml)至雌二醇包被原OVA-E2的浓度为0.9μg/ml，得到包被原溶液，用该包被原溶液包被实验孔，100μL/孔加至酶标板，37℃孵育2h。(2)洗涤：倾去孔内包被原溶液，用0.5％吐温洗涤液洗涤3次，每次3min；拍干。(3)封闭：加入10％小牛血清封闭液，100ul/孔，37℃孵育1h。(4)加样：经过系列稀释的待测血清加入酶标孔中，100ul/孔，37℃孵育1h。(5)加酶标二抗：加入用10％小牛血清二抗稀释液进行1:5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG，100ul/孔，37℃50min。(6)显色：加入TMB，100ul/孔，反应10min。(7)终止：加入1M盐酸终止反应，100ul/孔。(8)测定：用酶标仪读取各孔OD450nm数值。棋盘滴定法确定抗原和血清最适工作浓度。结果如表2所示，包被原(经OD280nm检测浓度为1.8mg/ml)在1：2000稀释和血清稀释至30万倍时PC/NC比值最大，确定包被原最佳包被浓度为2000倍，血清工作浓度为稀释1：300000。表2间接ELISA检测不同稀释度的包被原和血清组合2.3.2基本的icELISA实验方法用包被缓冲液稀释雌二醇标准品制备成浓度分别为0ng/ml、0.312ng/ml、0.625ng/ml、1.250ng/ml、2.500ng/ml、5.000ng/ml、10.000ng/ml、20.000ng/ml和、40.000ng/ml的雌二醇标准品溶液。根据测定数据结果计算四参数逻辑方程，根据方程拟合标准曲线，计算IC50；以IC20-IC80作为线性检测范围。基本的icELISA实验方法如下：2.3.2.1包被：用包被缓冲液稀释2.1的雌二醇包被原OVA-E2(原液浓度为1.8mg/ml)至雌二醇包被原OVA-E2的浓度为0.9μg/ml，得到包被原溶液，用该包被原溶液包被实验孔，100μL/孔加至酶标板，37℃孵育2h。2.3.2.2洗涤：倾去孔内包被原溶液，用0.5％吐温洗涤液洗涤3次，每次3min；拍干。2.3.2.3封闭：加入10％小牛血清封闭液，100ul/孔，37℃孵育1h。2.3.2.4加样：2.3.2.4.1标准品孔用包被缓冲液稀释将2.2制备的阳性血清稀释30万倍，得到雌二醇特异性抗体稀释液。将50μL雌二醇特异性抗体稀释液与50μL上述一种浓度的雌二醇标准品溶液加到酶标板上，37℃反应1h，倾去孔内液体，然后用洗涤液洗涤3次，每次3min；2.3.2.4.2阴性对照孔与2.3.2.4.1的区别仅在于将雌二醇标准品溶液替换为等体积的高纯水，其它步骤不变。2.3.2.4.3空白对照孔与2.3.2.4.1的区别仅在于将添加的雌二醇特异性抗体稀释液替换为高纯水，其它步骤不变。2.3.2.5加酶标二抗：加入用10％小牛血清二抗稀释液进行1:5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG，100ul/孔，37℃50min。2.3.2.6显色：加入TMB，100ul/孔，反应10min。2.3.2.7终止：加入1M盐酸终止反应，100ul/孔。2.3.2.8测定：用酶标仪读取各孔OD450nm数值。以OD450nm值为纵坐标，以雌二醇标准品溶液浓度的1og10值为横坐标，绘制半对数标准曲线图。标准曲线具有完整的反S形状，并具有上平台和下平台，标准曲线的平行测定次数6次，实验重复性良好，相对标准偏差(变异系数)均在20％以内。根据标准曲线得出50％抑制量(IC50)。2.4优化的icELISA方法的建立2.4.1蛋白封闭条件优化将2.3.2中的2.3.2.3封闭分别设为如下三个封闭处理，其他实验操作与2.3.2完全相同：10％小牛血清封闭：加入10％小牛血清封闭液，100ul/孔，37℃孵育1h。5％小牛血清封闭：加入5％小牛血清封闭液，100ul/孔，37℃孵育1h。1％小牛血清封闭：加入1％小牛血清封闭液，100ul/孔，37℃孵育1h。比较IC50相对差异性，确定最佳封闭条件。结果如表3所示，经过试验比较封闭液中含1％、5％和10％小牛血清，随着血清百分比的增高含10％小牛血清的封闭液可以减少阴性血清非特异性蛋白和抗原的反应。表3不同封闭液icELISA的IC50比较试验标准品含量(ng/ml)1％小牛血清封闭液5％小牛血清封闭液10％小牛血清封闭液03.5273.5063.3160.3123.0192.6882.4590.6252.9072.5092.0331.2502.2931.9981.6992.5001.7151.5071.3075.0001.2311.1350.96210.0000.9240.8730.73620.0000.6310.4550.52340.0000.4830.4110.354阴性0.6170.3310.2152.4.2洗涤条件优化将2.3.2中的2.3.2.2洗涤分别设为如下三个洗涤处理，其他实验操作与2.3.2完全相同：0.1％吐温洗涤：倾去孔内包被原溶液，用0.1％吐温洗涤液洗涤3次，每次3min；拍干。0.5％吐温洗涤：倾去孔内包被原溶液，用0.5％吐温洗涤液洗涤3次，每次3min；拍干。1.0％吐温洗涤：倾去孔内包被原溶液，用1.0％吐温洗涤液洗涤3次，每次3min；拍干。比较IC50相对差异性，确定最佳洗涤条件。结果如表4所示，洗涤液中Tween-20含量在0.1-1％之间去除ELISA体系中非特异性蛋白效果不明显。表4不同洗涤液icELISA的IC50比较试验标准品含量(ng/ml)0.1％吐温洗涤液0.5％吐温洗涤液1％吐温洗涤液03.5613.4553.3340.3123.1542.6792.5970.6251.9151.6231.6011.2501.7341.5761.5232.5001.5271.2551.1325.0001.0630.9630.86510.0000.7380.6380.62420.0000.6360.4580.47640.0000.4230.3120.310阴性0.3260.3130.3162.4.3一抗反应条件优化将2.3.2中的2.3.2.4加样中的一抗反应条件由37℃反应1h分别替换为37℃反应1h和4℃反应1h这两个处理，其他操作与2.3.2完全相同。比较IC50相对差异性，确定最佳一抗反应条件。分别在4℃和37℃作为一抗孵育温度孵育1h，结果如表5，4℃孵育1h可以进一步降低兔阴性血清中非特异性蛋白和抗原相结合，检测反应灵敏度大幅提高。表5两种一抗反应条件icELISA的IC50比较试验2.4.4二抗封闭条件优化将2.3.2中的2.3.2.5加酶标二抗中的10％小牛血清二抗稀释液分别替换为7％小牛血清二抗稀释液、5％小牛血清二抗稀释液、3％小牛血清二抗稀释液和1％小牛血清二抗稀释液这4个处理，其他操作与2.3.2完全相同。比较IC50相对差异性，确定最二抗封闭条件。在以上优化条件下，使用含1％、3％、5％、7％小牛血清的二抗稀释液稀释二抗，结果如表6，含5％小牛血清的二抗稀释液可以使阳性、阴性血清OD值呈现在合理范围。表6不同二抗封闭条件icELISA的IC50比较试验2.4.5显色条件优化将2.3.2中的2.3.2.6显色中的反应10min分别替换为3min、6min、9min和12min这四个处理，其他操作与2.3.2完全相同。比较IC50相对差异性，确定最佳显色条件。通过比较不同的TMB显色时间，发现在3min到6min未反应充分，9min到12min反应充分发生，从而可以确定9min为最佳反应时间(表7)。表7不同显色条件icELISA的IC50比较试验2.4.6优化icELISA方法及其灵敏度用包被缓冲液稀释雌二醇标准品制备成浓度分别为0.000ng/ml、0.033ng/ml、0.100ng/ml、0.300ng/ml、0.900ng/ml、2.700ng/ml、8.100ng/ml的雌二醇标准品溶液。根据测定数据结果计算四参数逻辑方程，根据方程拟合标准曲线，计算IC50；以IC20-IC80作为线性检测范围。1)包被：用包被缓冲液稀释2.1的雌二醇包被原OVA-E2(原液浓度为1.8mg/ml)至雌二醇包被原OVA-E2的浓度为0.9μg/ml，得到包被原溶液，用该包被原溶液包被实验孔，100μL/孔加至酶标板，37℃孵育2h。2)洗涤：倾去孔内包被原溶液，用0.1％吐温洗涤液洗涤3次，每次3min；拍干。3)封闭：加入10％小牛血清封闭液，100ul/孔，37℃孵育1h。4)加样：A、标准品孔用包被缓冲液稀释将2.2制备的阳性血清稀释30万倍，得到雌二醇特异性抗体稀释液。将50μL雌二醇特异性抗体稀释液与50μL上述一种浓度的雌二醇标准品溶液加到酶标板上，4℃反应1h，倾去孔内液体，然后用洗涤液洗涤3次，每次3min；B、阴性对照孔与A的区别仅在于将雌二醇标准品溶液替换为等体积的高纯水，其它步骤不变。C、空白对照孔与A的区别仅在于将添加的雌二醇特异性抗体稀释液替换为高纯水，其它步骤不变。5)加酶标二抗：加入用5％小牛血清二抗稀释液进行1:5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG，100ul/孔，37℃50min。6)显色：加入TMB，100ul/孔，反应9min。7)终止：加入1M盐酸终止反应，100ul/孔。8)测定：用酶标仪读取各孔OD450nm数值。设定标准曲线以icELISA测定雌二醇IC50结果，计算得到四参数逻辑方程判定系数R2＝0.9952表示拟合优度高，依据方程拟合绘制E2多抗标准曲线如图7所示。计算可得IC50为0.129ng/ml，IC20-IC80线性范围为0.0279ng/ml-0.597ng/ml。2.4.7优化的icELISA方法的特异性检测通过测定雌二醇多抗与雌二醇类似物的交叉反应率，鉴定雌二醇多抗的特异性。雌二醇IC50(IC50(E2))的测定同2.4.6。将2.4.6的标准品由雌二醇分别替换为不同浓度的雌酮、雌三醇、苯甲酸雌二醇、炔雌醇、炔雌醚、戊酸雌二醇、己烯雌酚、壬基酚等8种类似物进行反应，绘制标准曲线，以雌二醇为参照标准，计算各类似物的IC50，竞争物的交叉反应率见公式：试验结果见表8，2.4.6的优化icELISA方法与苯甲酸雌二醇、雌酮、炔雌醇的交叉反应率分别达150％、3.11％、1.52％，而与雌三醇、炔雌醚、戊酸雌二醇、己烯雌酚、壬基酚的交叉反应率均小于0.1％。表明2.4.6的优化icELISA方法对雌二醇和苯甲酸雌二醇具有高度特异性。表82.4.6的优化icELISA方法与雌二醇类似物的交叉反应率综上，2.4.6的优化icELISA方法的雌二醇标准曲线IC50值为0.129ng/ml，线性检测范围为0.0279ng/ml-0.597ng/ml，与苯甲酸雌二醇交叉反应率达到150％，与雌三醇、炔雌醚、戊酸雌二醇、己烯雌酚、壬基酚的交叉反应率均小于0.1％。当前第1页1 2 3