双蓝染色法的制作方法

本发明涉及植物标本染色技术，尤其涉及植物寄生型真菌标本的一种双蓝染色法。

背景技术：

当前有关植物寄生型真菌标本染色多使用棉兰染色的方法，如申请号为201510021839.8所述的一种病叶的切片棉兰染色方法，真菌菌丝显蓝色，少量寄主植物细胞中的蛋白质也染为蓝色，镜检时，能观察到真菌组织清晰的轮廓，尤其可观察到蓝色的菌丝，但附属丝显色不佳，也不能清晰地将真菌与寄主植物细胞区分。

而在真菌分类时，闭囊壳和附属丝的形状、数量、有无分支等等都是分类的重要依据，如何能将植物寄生型真菌标本与寄主植物细胞区分开的同时更为清晰明了的观察到真菌组织的菌丝、闭囊壳和附属丝，对于寄生在植物上的真菌分类有着重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种双蓝染色法，专门针对植物寄生型真菌标本的染色，能区分真菌组织和寄主植物细胞的同时，清晰明了的观察到菌丝和附属丝，层次感强。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种双蓝染色法，将生物学样品先与考马斯亮蓝染液在将所述生物学样品的细胞结构染色的条件下接触，且后与乳酸酚棉兰染液在将所述生物学样品的细胞结构染色的条件下接触。

最优的，将生物学样品与考马斯亮蓝染液在将所述生物学样品的细胞结构染色的条件下接触后，使用考马斯亮蓝脱色液与生物学样品接触，即将没有和所述生物学样品细胞结构结合的考马斯亮蓝染液洗脱；将生物学样品与乳酸酚棉兰染液在将所述生物学样品的细胞结构染色的条件下接触后，使用乳酸酚棉兰脱色液与生物学样品接触，即将没有和所述生物学样品细胞结构结合的乳酸酚棉兰染液洗脱。

最优的，所述将生物学样品先与考马斯亮蓝染液在将所述生物学样品的细胞结构染色的条件下接触步骤之前，将生物学样品与固定液接触。

最优的，所述固定液中包括甘油。

最优的，所述考马斯亮蓝染液中包括考马斯亮蓝G-250。

最优的，所述固定液包括1体积份的福尔马林、1体积份的冰醋酸、18体积份的70%酒精、1体积份的甘油；所述考马斯亮蓝染液包括9体积份的甲醇、2体积份的冰乙酸、9体积份的蒸馏水、终浓度为2.5g/L的考马斯亮蓝G-250；所述考马斯亮蓝脱色液包括1体积份的乙醇、2体积份的冰乙酸、17体积份的蒸馏水；所述乳酸酚棉兰染液包括1体积份的乳酸、2体积份的甘油、1体积份的蒸馏水、终浓度为1g/mL的苯酚、终浓度为5.25mg/mL的甲基蓝；所述乳酸酚棉兰脱色液包括浓度为95%的乙醇。

最优的，所述福尔马林中甲醛含量为38%；所述乳酸酚棉兰染液的制作步骤为：将苯酚溶于蒸馏水中，加热溶解后，再加入乳酸和甘油并搅拌，最后加入棉兰搅拌至溶解完全。

最优的，双蓝染色法包括以下步骤：取材：切取被真菌寄生的植物部位放置与载玻片上，得到生物学样品；

固定：将生物学样品置于固定液中，去除多余的固定液后，得到固定后的生物学样品；

考马斯亮蓝染色：将固定后的生物学样品上滴加考马斯亮蓝染液进行染色，去除多余的考马斯亮蓝染液后，得到考马斯亮蓝染色后的生物学样品；

考马斯亮蓝脱色：将考马斯亮蓝染色后的生物学样品上滴加考马斯亮蓝脱色液进行脱色，去除多余的考马斯亮蓝脱色液后，得到考马斯亮蓝脱色后的生物学样品；

乳酸酚棉兰染色：将考马斯亮蓝脱色后的生物学样品上滴加乳酸酚棉兰染液进行染色，去除多余的乳酸酚棉兰染液后，得到乳酸酚棉兰染色后的生物学样品；

乳酸酚棉兰脱色：将乳酸酚棉兰染色后的生物学样品上滴加乳酸酚棉兰脱色液进行脱色，去除多余的乳酸酚棉兰脱色液后，得到乳酸酚棉兰脱色后的生物学样品；

封片：将乳酸酚棉兰脱色后的生物学样品晾干后滴加中性胶封片。

最优的，所述考马斯亮蓝染色步骤中，生物学样品与考马斯亮蓝染液接触的时间为5～7分钟；所述考马斯亮蓝脱色步骤中，生物学样品与考马斯亮蓝脱色液接触的时间为5～7分钟；所述乳酸酚棉兰染色步骤中，生物学样品与乳酸酚棉兰染液接触的时间为2～4分钟；所述乳酸酚棉兰脱色步骤中，重复滴加乳酸酚棉兰脱色液进行脱色并去除多余的乳酸酚棉兰脱色液至生物学样品浮色被洗脱为止。

最优的，所述取材步骤中，切取植物被寄生部位表层细胞，且尽量少的植物组织，以便于制片和显微观察。

由上述技术方案可知，本发明提供的双蓝染色法，先将植物叶片中的蛋白质用考马斯亮蓝染色，形成的蛋白质-色素结合物呈现青色，而寄生在植物上的真菌的闭囊壳和附属丝的细胞壁的主要化学成分为壳多糖，不与考马斯亮蓝结合；然后使用乳酸酚棉兰染液将真菌菌丝和附属丝等染成深蓝色，部分产孢结构显棕褐色，最终得到的结果是寄主植物细胞呈现青色或亮蓝色，菌丝体呈现深蓝色，产孢结构的外层细胞如果以硬壁细胞为主，则显棕褐色，闭囊壳及附属丝为棕褐色，尤其使较细的附属丝影像更加清晰，具有非常好的层次感。

附图说明

附图1是被景天白粉菌（Erysiphe sedi）寄生的植株叶片仅使用考马斯亮蓝染色得到的生物学样品的显微成像（10×10）图。

附图2是被景天白粉菌（Erysiphe sedi）寄生的植株叶片仅使用乳酸酚棉兰染色得到的生物学样品的显微成像（10×10）图。

附图3是被景天白粉菌（Erysiphe sedi）寄生的植株叶片先使用乳酸酚棉兰染色后使用考马斯亮蓝染色得到的生物学样品的显微成像（10×10）图。

附图4是被景天白粉菌（Erysiphe sedi）寄生的植株叶片双蓝染色法得到的生物学样品的显微成像（10×10）图。

具体实施方式

结合本发明的附图，对发明实施例的技术方案做进一步的详细阐述。

本发明提供的双蓝染色法的具体操作步骤：

步骤1，取材：切取被景天白粉菌（Erysiphe sedi）寄生的植株叶片放置于载玻片上，切取植物被寄生部位的表层细胞，且尽量少的植物组织，以便于制片和显微观察，得到生物学样品。

步骤2，固定：将生物学样品置于固定液中，固定液包括1体积份的福尔马林、1体积份的冰醋酸、18体积份的70%酒精、1体积份的甘油，具体为，含甲醛38%的福尔马林5 ml，冰醋酸5ml，浓度为70%的酒精90 ml，甘油5 ml，上述原料混合配成固定液，用吸水纸吸附去除多余的固定液后，得到固定后的生物学样品；固定液使生物学样品中的酶失活的同时使生物学样品即植物细胞和真菌菌丝保持良好形态。

步骤3，考马斯亮蓝染色：将固定后的生物学样品上滴加考马斯亮蓝染液进行染色，生物学样品与考马斯亮蓝染液接触的时间为5～7分钟，最佳为5分钟，考马斯亮蓝染液包括9体积份的甲醇、2体积份的冰乙酸、9体积份的蒸馏水、终浓度为2.5g/L的考马斯亮蓝G-250，具体为，甲醇45ml，蒸馏水45ml，冰乙酸10ml，考马斯亮蓝G-250 0.25g，上述原料混合配成考马斯亮蓝染液，用吸水纸吸附去除多余的考马斯亮蓝染液后，得到考马斯亮蓝染色后的生物学样品。

考马斯亮蓝染液为弱酸性，其中的考马斯亮蓝G-250与植物叶片细胞中的蛋白质通过范德华力结合，形成的蛋白质-色素结合物呈现青色，便于观察，考马斯亮蓝染液进行染色为第一次蓝色染色。白粉菌寄生于植物叶片表面细胞，其闭囊壳和附属丝细胞壁的主要化学成分为壳多糖，不与考马斯亮蓝结合。

考马斯亮蓝G-250主要用于蛋白质染色，考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。考马斯亮蓝G-250光吸收值与蛋白质含量成正比，蛋白质与考马斯亮蓝G-250通过范德华力结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

步骤4，考马斯亮蓝脱色：将考马斯亮蓝染色后的生物学样品上滴加考马斯亮蓝脱色液进行脱色，生物学样品与考马斯亮蓝脱色液接触的时间为5～7分钟，最佳为5分钟，考马斯亮蓝脱色液包括1体积份的乙醇、2体积份的冰乙酸、17体积份的蒸馏水，具体为，乙醇50ml，冰乙酸100ml，蒸馏水850ml，上述原料混合配成考马斯亮蓝脱色液，用吸水纸吸附去除多余的考马斯亮蓝脱色液后，得到考马斯亮蓝脱色后的生物学样品；考马斯亮蓝脱色液呈弱酸性，其作用是将未与蛋白质结合的考马斯亮蓝染液洗脱下，以使蛋白质与染色剂结合的显色更为清晰。

步骤5，乳酸酚棉兰染色：将考马斯亮蓝脱色后的生物学样品上滴加乳酸酚棉兰染液进行染色，生物学样品与乳酸酚棉兰染液接触的时间为2～4分钟，最佳为2分钟，乳酸酚棉兰染液包括1体积份的乳酸、2体积份的甘油、1体积份的蒸馏水、终浓度为1g/mL的苯酚、终浓度为5.25mg/mL的棉兰，具体为，苯酚（又叫石炭酸）10g溶于10mL蒸馏水中，加热溶解后，再加入10mL乳酸和20mL甘油并搅拌，最后加入棉兰（又叫甲基蓝）0.21g搅拌至溶解完全，配置成乳酸酚棉兰染液，用吸水纸吸附去除多余的乳酸酚棉兰染液后，得到乳酸酚棉兰染色后的生物学样品。

乳酸酚棉兰染液，又称棉兰染液、乳酸石炭酸棉兰染液，呈弱酸性，主要用于真菌染色。乳酸和苯酚具有杀菌作用，既能杀死真菌孢子防止实验室感染，又能很好的固定标本；该染液含甘油，不容易蒸发，便于在较长的时间内保持标本的湿润，保持菌丝特征和孢子的原本形态；棉兰容易吸附于真菌菌丝上，可将真菌菌丝染成深蓝色，部分产孢结构显棕褐色，便于观察细微结构。

步骤6，乳酸酚棉兰脱色：将乳酸酚棉兰染色后的生物学样品上滴加乳酸酚棉兰脱色液进行脱色，乳酸酚棉兰脱色液为浓度为95%的乙醇，重复滴加乳酸酚棉兰脱色液进行脱色并用吸水纸吸附去除多余的乳酸酚棉兰脱色液至生物学样品浮色被洗脱为止，脱去染液的浮色，从而使着色部分更清晰，得到乳酸酚棉兰脱色后的生物学样品。

步骤7，封片：将乳酸酚棉兰脱色后的生物学样品晾干后滴加中性胶封片。

最终得到的结果如附图4所示，寄主植物细胞呈现青色或亮蓝色，菌丝体呈现深蓝色，产孢结构如果以硬壁细胞为主，则显棕褐色，闭囊壳及附属丝为棕褐色，尤其使较细的附属丝影像更加清晰，具有非常好的层次感。

考马斯亮蓝G-250染液和棉兰染液均为弱酸性，在一定pH范围内，都可与蛋白质结合。由于真菌细胞壁的主要成分为多糖，故考马斯亮蓝不易使菌丝及其相关结构着色。双蓝染色法基于先使用考马斯亮蓝G-250染液使寄主植物细胞中的蛋白质染为青色，即蛋白质与染料结合的位点已被占用；再使用棉兰染液，使菌体组织呈现深蓝色（菌丝）和棕褐色（闭囊壳和附属丝），不同的颜色凸显了结构差异，使影像更具层次感，可获得良好的观察效果。

单纯使用考马斯亮蓝染液进行单染，即完成上述步骤1至步骤4和步骤7，结果如附图1所示，只能使寄主植物细胞中的蛋白质染为青色或亮蓝色，而真菌组织基本不着色。对较大的真菌组织如闭囊壳，青色背景可衬托其轮廓，但较细小的部分如菌丝和附属丝，由于基本不着色，故无法进行观察或仅能看到模糊影像。

单纯使用乳酸酚棉兰染液进行单染，即完成上述步骤1、步骤2、步骤5至步骤7，结果如附图2所示，真菌菌丝显蓝色，同时背景中少量寄主植物细胞中的蛋白质染为蓝色（该蓝色较暗，不如考马斯亮蓝染色为青色或亮蓝色的亮）。镜检时，能观察到真菌组织清晰的轮廓，尤其可观察到蓝色的菌丝，但附属丝显色不佳，也不能清晰地区分出寄主植物细胞。

先使用乳酸酚棉兰染液，再使用考马斯亮蓝染液，即按照步骤1、步骤2、步骤5、步骤6、步骤3、步骤4、步骤7的顺序完成操作，结果如附图3所示，将使植物组织中的蛋白质和真菌组织都染成蓝色，虽经脱色，但与蛋白质结合的棉兰不能被洗脱，导致背景中寄主植物细胞中的蛋白质与真菌组织均呈现蓝色，图像对比度较低，镜检时无法看到菌丝体和附属丝，只能看到难以着色的闭囊壳的轮廓。

综上所述，将生物学样品先与考马斯亮蓝染液在将所述生物学样品的细胞结构染色的条件下接触，且后与乳酸酚棉兰染液在将所述生物学样品的细胞结构染色的条件下接触，这种双蓝染色法能达到最佳的染色效果。