一种基于非线性光斑调制的超分辨显微成像方法和装置与流程

本发明属于超分辨领域，尤其涉及一种利用非线性荧光饱和原理在远场实现超衍射极限的分辨率的超分辨显微方法和装置。

背景技术：

由于具有无损伤、非接触等优点，光学显微镜是一种被广泛应用于化学、生物、材料科学中的观测工具。但是传统的远场光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制，光束经显微物镜聚焦后所成光斑的尺寸用半高全宽表示为其中λ为显微镜的工作波长，NA为所用显微物镜的数值孔径。

为了能够观察到更加精细的结构，在远场荧光显微镜的基础上，科研工作者们已经提出了很多种实用的超分辨显微成像方法。所有连续光照明模式的超分辨方法都可以被分为两大类：结构光照明，以SIM为代表；点扫描光照明，以STED为代表。但是这些方法都有各自的缺点，如点扫描光照明模式下需要很高的光功率，而结构光照明模式需要多次记录，且这些方法的系统都很复杂。

在线性的荧光激发过程中，样品发射的荧光强度是与激发光强度成正比的；而当激发光强不断增加，激发态的荧光分子数目就会达到饱和，正比关系不再成立且荧光的点扩散函数也会改变，可以用于得到更精细的结构信息。

技术实现要素：

本发明提供了一种超分辨显微成像方法和装置，可以利用非线性光斑调制和荧光饱和原理在远场实现超衍射极限的分辨率。该种方法和装置具有成像速度快、装置简单、分辨率高等特点，可以很好地应用于荧光样品的检测之中。

一种基于非线性光斑调制的超分辨显微成像方法，包括以下步骤：

1)将激光器发出的激光光束进行准直；

2)对光束进行调制形成非均匀光斑照明，并增大光强直至饱和产生非线性荧光辐射；

3)将调制后的光束通过二维扫描振镜系统和显微物镜聚焦到样品表面，实现对样品的二维扫描；

4)在二维扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光；

5)通过系统的光学传递函数和反卷积算法，根据所得到的样品信号图像反向计算出样品的分布，系统的光学传递函数为点扩散函数的傅里叶变换，点扩散函数为：

其中，为系统出瞳上点的球坐标，i为虚数单位，为离焦面很近的点的柱坐标，C是归一化常数，Ω为出瞳，表示激发光光强，[p_x；p_y；p_z]是代表激发光偏振方向的单位向量，是位相板造成的相位延迟，k和n分别为自由空间中的波矢与折射率，为坐标转换系数。

待测样品上的x，y轴方向由二维扫描方向决定。

本发明中，用反卷积算法恢复样品信息得到超分辨图像，反卷积算法可以是迭代盲反卷积算法、Lucy-Richardson反卷积算法、最大似然估计反卷积算法等常用算法。

本发明还提供了一种基于非线性光斑调制的超分辨显微成像装置，包括光源、承载待测样品的样品台，所述光源与样品台之间依次设有：

用于将光源发出的光束改变为线偏振光的起偏器；

用于使线偏振光源变为圆偏振光的1/4波片；

用于改变所述光源发出光束各部分相位形成空心光斑的涡旋位相板；

用于反射激发光、透射荧光信号的二色镜；

用于对光线进行光路偏转的二维扫描振镜系统；

依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光束进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜；

用于将激发光聚焦到样品表面上的显微物镜；

并设有用于控制所述扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。

本发明中通过探测系统接收样品发出的信号光，该探测系统包括：

布置在涡旋位相板和扫描振镜系统之间的二色镜；

用于将信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；

用于对信号光进行空间滤波的空间滤波器，位于所述显微物镜的焦平面附近，所述空间滤波器可以采用针孔或多模光纤，若采用针孔，所用针孔的直径应小于一个艾里斑直径；

用于探测信号光的光强信号的点光源探测器雪崩二极管APD。

作为优选，所述光源与起偏器之间依次设有用于对所述激光光束进行滤波的单模光纤和准直的准直透镜。

本发明中所述涡旋位相板具有调制函数其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

所述显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

本发明原理如下：

显微系统的分辨率受光学系统衍射的影响，可在空间域上和频率域上进行说明。在空间域上，平行入射的照明光束经显微物镜聚焦后在待测样品上所成的光斑是一个具有一定尺寸的衍射斑，在衍射斑照射范围内的样品均会发出相应的信号光，从而使得这一范围内样品的细节无法被分辨，由此限制了显微系统的分辨率。在频率域上，由于整个系统的孔径是有限的，因此在频率上相当于一个低通滤波器，承载样品细节信息的高频信号不能通过，由此限制了显微系统的分辨率。因此，要突破光学衍射极限的限制，提高显微系统的分辨率，如何使更多的高频信号通过系统被探测器接收便成为了关键。

在本发明方法中，通过对照明光斑的调制得到非均匀点照明，同时调整光源输出功率以增加光强非线性荧光饱和效应，非均匀的照明光斑和非线性荧光饱和效应共同作用使得更多样品的高频信息能够被探测到。在本发明装置中，涡旋位相板的相位调制函数为由德拜积分计算可得，调制后光束经显微物镜聚焦后在样品上所成光斑为一个面包圈型的空心光斑。增加光强使空心光斑饱和，照射在样品上激发出饱和非线性的荧光，饱和光产生的高阶非线性效应使得激发出的荧光中的高频成分更多。再加上空心光斑非均匀性产生的移频作用，这些高频成分被移到系统的截止频率内，能够通过系统并被探测到，这是实心光斑照明不能做到的。信号中各频率成分的相对强度分布由系统的光学传递函数来表示。但照明光斑是空心光斑，探测得到的图像中的高频信息是非可视化的，低频信息强度也很强，不能直接反应样品的原始分布。此时需要通过反卷积算法，根据线性成像过程和探测到的图像，增强高频信息的强度同时反向推导出样品的图像。

因此，与常规光学显微方法相比，本发明使更多高频样品信号通过系统被探测到，结合反卷积算法，从而可以实现超衍射极限的分辨率，得到高分辨率的图像。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)首次提出了通过非线性光斑调制增加高频信息的显微方法；

(2)提出了探测到的混乱含高频信息的图像可以通过反卷积算法推导出样品的原始分布；

(3)装置简单，操作方便。

附图说明

图1为本实施例的超分辨显微装置的结构示意图；

图2为本实施例中普通实心光斑、饱和实心光斑、普通空心光斑、饱和空心光斑激发荧光信号的频谱归一化分布曲线；

图3为本实施例中普通实心光斑、饱和实心光斑、普通空心光斑、饱和空心光斑激发荧光信号经过滤波后被探测器接收到的信号频谱归一化分布曲线，即各情况下系统的光学传递函数。

图4为本实施例中样品为荧光生物样品时饱和空心光斑激发后反卷积得到的图像与相同条件下共聚焦显微镜得到的图像的对比。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示，本实施例的超分辨显微装置，包括：激光器1，单模光纤2，准直透镜3，起偏器4，1/4波片5，涡旋位相板6，二色镜7，扫描振镜8，扫描透镜9，场镜10，显微物镜11，样品台12，聚焦透镜13，针孔14，探测器雪崩二极管APD15。

其中，单模光纤2、准直透镜3、起偏器4，1/4波片5，涡旋位相板6，二色镜7依次位于激光器1出射光束的光轴之上。

其中，扫描振镜8位于经二色镜7反射后光束的光轴之上。

其中，扫描透镜9，场镜10，显微物镜11，样品台12依次位于扫描振镜8出射光束的光轴之上。

其中，聚焦透镜13、针孔14、探测器雪崩二极管APD15依次位于经二色镜7后透射光束的光轴之上；所述针孔14位于聚焦透镜13的焦平面处。

其中，控制器与扫描振镜8相连，用于扫描振镜系统的扫描。

上述装置中，显微物镜11的数值孔径NA＝1.4；所用针孔14的直径为0.6个艾里斑直径。

采用图1所示的装置进行超分辨显微的方法如下：

从激光器1发出的激光光束，首先被导入单模光纤2，从单模光纤2出射的激光光束，经过准直透镜3完成准直。经过准直后的光束入射到起偏器4变为线偏振光，经过1/4波片5变为圆偏振光，再通过涡旋位相板6变为空心光斑。

涡旋位相板6的相位调制函数为：其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

因此，经涡旋位相板6进行相位调制之后，出射光束的电矢量强度可由下式表示：

其中，为入射到涡旋位相板6上的光束在处的电矢量强度，为经过涡旋位相板6相位调制后的出射光束在处的电矢量强度，i为虚数单位。

调制后的光经二色镜7反射后入射到扫描振镜8上，经扫描振镜8出射的光束依次被扫描透镜9聚焦、场镜10准直，之后经显微物镜11投射到位于样品台12上的待测样品之上。

入射光在显微物镜11的焦点附近所成的光场分布可由德拜积分确定，具体如下：

式中，是以显微物镜11的焦点位置为原点的柱坐标系下的坐标，代表了处的电矢量强度，i为虚数单位，C为归一化常数，θ为光束孔径角，φ为光束垂直Z轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，A₁(θ,φ)是入射光的振幅分布，A₂(θ,φ)表征了显微物镜15的结构，[p_x；p_y；p_z]则表示了入射光的偏振信息，k＝2π/λ，n为介质折射率。

由上式计算可以发现，此时入射光经显微物镜11聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个面包圈型空心光斑。

待测样品被激发出的信号光被显微物镜11收集，之后依次通过场镜10、扫描透镜9、扫描振镜8，通过二色镜透射7。之后信号光经聚焦透镜13聚焦并通过针孔14进行空间滤波，最终被探测器15接收。

通过控制器调节扫描振镜8，实现对于待测样品的二维扫描。

普通实心光斑、饱和实心光斑、普通空心光斑与饱和空心光斑激发出的荧光信号频谱分布如图2所示，插入图为局部放大图，kc为普通实心光斑照明时系统的截止频率。当光强增大到饱和后非线性荧光效应产生后，实心光斑能够激发出超过截止频率的高频信号。相比于实心光斑，饱和空心光斑中高频信号成分的相对强度增强了更多，但相对强度降低了。

而激发出的荧光信号只有能被探测器接收的部分才是有效信号，普通实心光斑、饱和实心光斑、普通空心光斑、饱和空心光斑激发荧光信号经过滤波后被探测器接收到的信号频谱归一化分布曲线，即系统的光学传递函数如图3所示。图2中由实心光斑饱和效应激发的高频率旁瓣在图3中被针孔滤除，而由空心光斑饱和效应激发的高频率旁瓣不会被针孔滤除，能够被探测器接受到。显然该方法使探测器能够接收到的高频信息增加了，再通过反卷积算法提高高频信号的相对强度恢复图像，由此可以得到超衍射极限的超分辨显微图像。

图4为相同实验条件下用饱和空心光斑加反卷积和用共聚焦方法对荧光生物样品成像得到的对比图像。图a中样品为Vero PFA，图b中样品为VeroMeOH，两图中图片的上半部分是光强为1.2μW时共聚焦方法得到的图像，下半部分是光强为30μW时本方法得到的图像。通过对比可以看出在共聚焦方法下模糊的颗粒状和线状的细节在本方法中变清晰了，证明本方法对分辨率有明显的提高。