本发明涉及环境污染物毒性检测领域，具体地说涉及一种时间毒性微板分析方法。
背景技术：
随着现代工业的不断发展，环境污染日趋严重，其中以化学品的污染尤为突出，水环境是各类污染物最终汇集地点。因此，水环境不仅面临着由传统污染物引起的水体富营养化和耗氧有机污染，而且还面临着有毒有害污染物、尤其是重金属和持久性有机物污染的严峻挑战。为了保护水资源和遏制由污染物引起水质持续恶化的趋势，污染控制与生态风险评价管理必须势在必行。
化学分析手段可对水环境中污染物进行定性与定量分析，却不能直接反映污染物对环境和生物的影响(Lee and Allen，1998)。污染物对生物体的毒性，并非完全取决于其环境含量，一些变化的环境因素如pH值、氧化还原状态等在很大程度上影响污染物生物效应。化学分析数据并不能从整体上反映水质的优劣，或反映污染物对生物体和生态系统的影响。
生物毒性测试法可以弥补化学分析法在评价污染物毒性中的不足之处。生物评价标准中规定利用敏感生物测试污染物的毒性效应。绿藻作为生态系统种的初级生产者和水生食物链的基本环节，对维持生态系统的平衡起着重要作用。绿藻个体小、繁殖快、对毒物敏感、易于分离培养以及可直接观察细胞水平上的中毒症状，常被用于测定污染物的毒性。藻毒性测试已成为一种广泛应用的生物监测与标准方法，如国际标准化组织ISO(8692-2012)、经济合作与发展组织OECD(2004)、美国环保署USEPA(1996)以及中国国家环境保护总局均将藻类生长抑制毒性试验作为标准毒性测试方法(2008)。常用的藻类有蛋白核小球藻、羊角月藻、杜氏盐藻、三角褐指藻和斜生栅藻等。蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)属于绿藻门，色球藻目，小球藻属，是游离单细胞藻，直径3～5微米，球形或椭圆形，繁殖快，可以在较短时间内考察污染物对藻类世代和种群水平上的影响，便于培养和试验；此外，藻液分布均匀不易沉降，其与污染物的接触更充分。大量实验表明，藻毒性实验结果与其它指示生物对化合物毒性评价结果有良好的相关性，甚至更灵敏(黄正和王家玲，1995)。
国内许多研究采用蛋白核小球藻作为污染物毒性测试的受试生物，如利用蛋白核小球藻测定金属纳米颗粒物的毒性作用(汪静等，2011)，研究十六烷基溴化铵等表面活性剂、商品氯氰菊酯农药、二氯甲烷和二氯乙烷以及药物等对蛋白核小球藻的生长抑制效应(聂湘平等，2007；吴石金等.，2010；王朝晖等，2012；郑香娇和周作明，2012)，测试水中砷铬铅镉汞的急性毒性(周世明等，2008).
此前的蛋白核小球藻毒性测试多采用三角玻璃瓶法，该方法的缺点：测试仪器不能同时测定大量平行样品，而且试液用量大，不仅费时、费力而且浪费试剂，而且只获得某一暴露时间终点如72小时或96小时的半数效应浓度EC50值。袁静等(2011)建立了以酶标仪为检测仪器和96孔板为载体的藻毒性微板分析法，暴露时间为96h，能多次平行测定样品毒性，使之具有统计有效性。利用这一测试体系，研究了有多个化合物及其混合物的毒性，包括重金属、农药和离子液体等化合物，获得了大量化合物的完整浓度-效应毒性信息。上述研究表明，微板毒性分析测试法具有操作简单、灵敏度高、重复性好及环境友好等优点。
然而，越来越多的研究表明，环境污染物的毒性不仅与暴露的剂量有关，时间也是一个重要的因素。如Newman等(1996)首次提出利用实时分析方法测试污染物的生态毒性，并指出同时考虑浓度与时间两个因素可提高生态风险评估的可信性。Zhu等(2009)采用(Concentration-Time-Effect Surface，CTES)CTES研究6种三嗪类除草剂对发光菌Q67的毒性，发现其毒性随着时间的延长而逐渐增加。但不同的毒物，其毒性增加的幅度不同。Hatano等(2010)研究发现发现重金属对生物配体的毒性具有很强的时间依赖性。还有的研究发现部分污染物不仅具有时间依赖毒性，同时不同暴露时间的浓度-效应曲线还具有不同的形状。如Wang等(2011)研究发现离子液体[emim]BF4对发光菌Q67的毒性效应随着时间的延长，由抑制发光效应逐渐转变为刺激发光效应。上述初步研究结果表明，不同类型和不同结构的污染物可能具有不同的时间毒性规律和作用机制。因此，污染物毒性的检测不仅要关注其在某一特定时间对暴露生物的效应，更应该着眼于其对暴露生物随着时间而变化的动态效应。
要探索与揭示不同类型环境污染物对暴露生物随时间而变化的动态效应规律与作用机制，就必须对这些物质进行系统的时间毒性分析。要获取可靠的时间毒性数据，首先必须有可靠的时间毒性分析方法，而目前关于蛋白核小球藻毒性测试方法多是传统的三角瓶法，且这些方法基本都是基于某一个或两个暴露时间点的，尚缺少系统的多个不同时间测定点的毒性测试方法，不能直接应用来进行时间毒性测试。因此，建立基于绿藻蛋白核小球藻的环境污染物时间毒性微板分析法具有紧迫性。时间毒性微板分析法不仅有助于全面的了解污染物的毒性效应，而且能更深入的了解污染物的毒理作用机制与途径，更能体现实际环境中污染物暴露的现象和信息。
技术实现要素：
1.发明要解决的技术问题：
针对传统污染物绿藻毒性检测方法的不足及环境中新兴污染物浓度低、持续作用等特点，本发明在传统毒性检测方法基础上强调时间因素对毒性的影响，建立时间毒性微板分析方法，可以有效的检测在环境中含量低、存在时间长且对受试生物有特定作用位点的污染物的毒性。
2.技术方案
采用的技术方案如下：
一种时间毒性微板分析方法，包括培养基的配制、微板设计、微板加样、污染物时间毒性测定，其特征在于，所述的培养基配方：0.3g NaNO3、0.08g K2HPO4 3H2O、0.08g MgSO4 7H2O、0.04g CaCl2 2H2O、0.25g KH2PO4、0.05g NaCl、0.01mL FeCl3 6H2O、1.54mL EDTA-Fe、55mL土壤浸出液、1.45mL A5溶液和942mL蒸馏水。
所述的EDTA-Fe配方为：2g Na2EDTA、66mg FeCl3 6H2O、50mL 0.2M HCl和50mL H2O。
所述的A5溶液配方为：250mg H3BO3、192mg MnCl2 4H2O、32mg ZnSO4 7H2O、17.5mg CuSO4 5H2O、3.5mg(NH4)6 Mo7O24 4H2O和100mL H2O。
所述的微板设计，步骤为首先将48孔微板周边的18个微孔加入100μL蒸馏水，在剩余30个微孔中选取第1、2、4及7列共24个微孔作为空白对照，剩余24个微孔按一定稀释因子等比设计8个浓度梯度，每孔加入100μL待测溶液，每浓度3个平行，重复三板。
所述的微板加样，步骤为先将蛋白核小球藻在培养基中20±1℃条件下培养至对数生长期，加样时，将已培养至对数期的藻溶液加入空白孔和处理孔中，确保每个微孔最终总体积为100μL，并确保混合后藻密度约为2.0×108个/mL，在波长690nm处的吸光度OD690值在0.10～0.30之间。
所述的污染物时间毒性测定，步骤为根据权利要求4微板设计及权利要求5微板加样方式完成加样操作的微板放置光照培养箱中，并于20±1℃培养，0、6、12、18、24小时后测定绿藻的吸光度值，求出相对抑制率，计算每个暴露时间节点的生长抑制率，进行浓度-效应曲线拟合，计算效应浓度、置信区间。
3.有益效果
与常规96小时的微板毒性分析法测定数据对比，发现这些化合物及其混合物的浓度-效应曲线(CRC)随着时间的延长，毒性在逐渐增加，但增加的速率不同。混合物的毒性相互作用规律也随着混合物的组分和暴露时间发生很大的变化，有的混合物随着暴露时间的延长，协同或拮抗作用逐渐增强，而有的混合物毒性相互作用随着时间甚至发生了作用类型的变化如从协同逐渐转变为拮抗或从拮抗逐渐转变为协同。显然，本发明可以更为合理的评价污染物的毒性和揭示环境污染物毒性作用规律与机制。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明.
一种时间毒性微板分析方法，包括培养基的配制、微板设计、微板加样、污染物时间毒性测定，其特征在于，所述的培养基配方：0.3g NaNO3、0.08g K2HPO4(3H2O、0.08g MgSO4(7H2O、0.04g CaCl2(2H2O、0.25g KH2PO4、0.05g NaCl、0.01mL FeCl3(6H2O、1.54mL EDTA-Fe、55mL土壤浸出液、1.45mLA5溶液和942mL蒸馏水。
所述的EDTA-Fe配方为：2g Na2EDTA、66mg FeCl3(6H2O、50mL 0.2M HCl和50mL H2O。
所述的A5溶液配方为：250mg H3BO3、192mg MnCl2(4H2O、32mg ZnSO4(7H2O、17.5mg CuSO4(5H2O、3.5mg(NH4)6(Mo7O24(4H2O和100mL H2O。
所述的微板设计，步骤为首先将48孔微板周边的18个微孔加入100μL蒸馏水，在剩余30个微孔中选取第1、2、4及7列共24个微孔作为空白对照，剩余24个微孔按一定稀释因子等比设计8个浓度梯度，每孔加入100μL待测溶液，每浓度3个平行，重复三板。
所述的微板加样，步骤为先将蛋白核小球藻在培养基中20±1℃条件下培养至对数生长期，加样时，将已培养至对数期的藻溶液加入空白孔和处理孔中，确保每个微孔最终总体积为100μL，并确保混合后藻密度约为2.0×108个/mL，在波长690nm处的吸光度OD690值在0.10～0.30之间。
所述的污染物时间毒性测定，步骤为根据权利要求4微板设计及权利要求5微板加样方式完成加样操作的微板放置光照培养箱中，并于20±1℃培养，0、6、12、18、24小时后测定绿藻的吸光度值，求出相对抑制率，计算每个暴露时间节点的生长抑制率，进行浓度-效应曲线拟合，计算效应浓度、置信区间。