本发明属于纳米生物技术领域，具体涉及一种超低场纳米磁探针及其制备方法与应用。
背景技术：
超低场光学原子磁力仪可对弱磁场进行检测。光学原子磁力仪的应用主要包括检测材料的超低场剩磁性能和通过利用超低场磁探针来标记细胞、细菌及生物大分子，进而具有磁传感、磁成像和生物力谱等生物领域的应用。然而，生物领域的应用关键之一就在于超低场磁探针的制备。超低场磁探针是应用于超低场磁传感、磁标记、磁成像的重要媒介，其对于提高超低场磁检测、磁标记、磁成像的灵敏度、适用范围等具有重要的作用。目前使用的超低场磁探针均是微米级的，而且成分为磁性纳米粒子和聚合物的组装体，需要首先合成磁性纳米粒子，然后再来合成磁性聚合物微球，耗时、费力。同时，这些超低场磁探针在溶液中会沉淀，这些都大大影响了其在超低场磁检测、磁标记、磁成像中的应用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种超低场磁探针。
本发明所提供的超低场磁探针，为，磁纳米颗粒。
所述磁纳米颗粒为表面亲水性配体修饰的磁性纳米粒子。
所述磁性纳米粒子的粒径可为1-100nm，具体可为10-40nm。
所述磁性纳米粒子为：铁氧磁性纳米粒子或掺杂的铁氧磁性纳米粒子，其中掺杂的铁氧磁性纳米粒子中的掺杂剂可为锌、钴和锰中的至少一种。
所述亲水性配体可选自下述至少一种：3,4-二羟基苯基丙酸(DHCA)、2,3-二巯基丁二酸和双羧基修饰的PEG。
上述超低场磁探针是按照包括下述步骤的方法制备得到的：
1)制备磁性纳米粒子；
2)在所述磁性纳米粒子的表面进行亲水性配体修饰，得到表面亲水性配体修饰的磁性纳米粒子，即超低场磁探针。
上述方法步骤1)中，所述磁性纳米粒子可通过高温有机液相回流法制备得到。
具体地，所述磁性纳米粒子可通过下述方法进行制备：在惰性气体保护下，以铁源为原料，在油酸、油胺、十八烯的体系中进行回流反应，得到磁性纳米粒子。
所述铁源具体可为乙酰丙酮铁和/或油酸铁。
所述铁源也可为铁源与锌源、钴源和锰源中的至少一种的混合物。
所述油酸也可为癸酸、油酸钠、油酸钾中的至少一种。
所述十八烯也可为十八烯、二苄醚、角鲨烷、三正辛胺中的至少一种。
所述铁源与油酸、油胺及十八烯的摩尔配比依次为1:1-4:1-4:0.0625-0.25。
所述回流反应的时间为30min-2h。
上述方法步骤2)中，所述进行亲水性配体修饰的操作为：在惰性气体保护下，加热条件下，将步骤1)中制得的磁性纳米粒子的溶液逐滴加入到亲水性配体的溶液中，反应，将反应体系冷却到室温，加入碱性溶液，离心，收集沉淀，得到表面亲水性配体修饰的磁性纳米粒子。
所述磁性纳米粒子的溶液中磁性纳米粒子与所述亲水性配体的溶液中的亲水性配体的质量比为1:2-5，具体可为20mg：50mg。
所述反应的温度为5-80℃，具体可为50℃，时间为3-12h，具体可为3h。
上述超低场磁探针在下述1)-3)中的至少一种中的应用也属于本发明的保护范围：
1)细胞磁成像；
2)细菌检测；
3)制备基于光学原子磁力仪的磁免疫试剂盒。
本发明提供一种简单高效、低成本的无需再组装，可进行大批量制备的、单分散性好的、生物兼容性好的、磁性能优良的纳米级别的超低场磁探针。本发明制备的超低场磁探针有多重应用，首先可以被细胞内吞，再利用光学原子磁力仪对细胞样品进行非接触扫描成像，也就是说本发明制备的超低场磁探针可能具有细胞磁成像应用；其次，本次发明的超低场磁探针与细菌共孵育，同样可光学原子磁力仪检测到磁信号，进而可用于细菌检测；最后，由于超低场磁探针本身也兼备了易被抗体，适配体、DNA及RNA等生物大分子修饰，因此可能被用于磁免疫捕获，磁分离及利用光学原子磁力仪进行磁信号检测，也就可用超低场磁探针来制备基于光学原子磁力仪的磁免疫试剂盒。
与现有探针和制备技术相比，本发明具有以下优点和积极效果：
1.本发明的制备方法无需进行高分子材料的制备，简单高效、低成本。
2.本发明所制备的超低场磁探针是纳米级别的，单分散性好，不沉淀。
3.本发明所制备的超低场磁探针成分单一简单。
4.本发明所涉及材料均可购买，同时方法新颖，工艺简单、设备常见，操控性好，功能强大，并且可以一次制备大量的超低场磁探针。
5.本发明所制备的超低场磁探针尺寸小，在室温下具有超顺磁性。
6本发明所制备的超低场磁探针表现出较好的超低场剩磁信号强度。
7.本发明所制备的超低场磁探针可以进行细胞标记，进行生物磁成像方面研究。
8.本发明所制备的超低场磁探针可以进行细菌检测，用于生物磁传感。
9.本发明所制备的超低场磁探针兼备了易被抗体、适配体、DNA及RNA等生物大分子修饰，因此可能被用于磁免疫捕获，磁分离及利用光学原子磁力仪进行磁信号检测，也就可用超低场磁探针来制备基于光学原子磁力仪的磁免疫试剂盒。
鉴于此，本发明设计一种简单高效、低成本的合成法，可制备大批量合成的、单分散性好的、磁性能优良的纳米级别的超低场磁探针具有重要的科学意义和巨大的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中步骤1所制备的磁性纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)图。
图2a为本发明实施例1中步骤2所制备的超低场磁探针的透射电子显微镜(TEM)图，图2b为亲水配体改性前后的相容性实验对比效果图。
图3为本发明实施例2所制备的超低场磁探针的透射电子显微镜(TEM)照片。
图4为本发明实施例3所制备的磁性纳米粒子的动态光散射(DLS)测水动力学粒径的柱状图。
图5为本发明实施例4所制备的超低场磁探针的透射电子显微镜(TEM)图。
图6为本发明实施例5所制备的磁性纳米粒子的振动样品磁强计(VSM)图谱。
图7为本发明实施例6所制备的超低场磁探针的剩磁信号-质量曲线。
图8为本发明实施例7中超低场磁探针的A549细胞毒理性测试。
图9为本发明实施例8中超低场磁探针被A549细胞内吞后，在光学原子磁力仪的检测下的剩磁信号稳定性。
图10为本发明实施例9中超低场磁探针与金黄色葡萄球菌共培养后，在光学显微镜下拍摄的细菌图片。
图11为本发明实施例9中超低场磁探针与金黄色葡萄球菌共培养后，样品在光学原子磁力仪下检测到的磁信号强度。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所采用的油酸铁通过下述方法进行制备：
配制乙醇、蒸馏水与环己烷的混合溶剂，其中三者的体积比为乙醇：蒸馏水：环己烷＝8:6:14，将40mmol六水合氯化三铁(纯度98％)、120mmol油酸和280mL的混合溶剂加入到250mL的三口瓶。1600rpm/min磁力搅拌混合均匀，氮气保护，升温至70℃并在70℃下反应4h。移除热源，冷却到室温，反应母液移至分液漏斗中，加入30mL蒸馏水，取油相，再用分液漏斗萃取两次，取油相部分于干净烧杯中，常温真空使得溶剂蒸发完全，得到蜡状固体，即产物油酸铁。
实施例1
1、将2mmol乙酰丙酮铁、6mmol油酸、6mmol油胺和20ml十八烯加入到150ml的三口瓶，1600rpm/min磁力搅拌混合均匀，80℃抽真空30min，之后充入氮气，然后升温到200℃，保持30min，再升温到300℃，回流30min，移除热源，冷却到室温，然后加入适量的乙醇，6000r/min离心分离10min，取沉淀，然后加入适量的环己烷，使产物溶解，6000r/min再次离心分离10min，取上层液体，重复乙醇沉淀/环己烷分散的过程3次，最后将所制备的磁性纳米粒子直接用于下一步实验，或者分散在环己烷保存于样品瓶并放置于4℃的冰箱中。
2、在一个100ml的四口烧瓶(19*14×3)中加入100mgDHCA(3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid)和12ml的THF，四口烧瓶的四个口分别连接热电偶、冷凝管、弯管塞和分液漏斗，分液漏斗中加入40mg磁性纳米粒子和2ml的THF，在系统中充入氮气，流速尽量慢(流速过快会带走溶剂)，普通加热套，加热到50℃，然后打开分液漏斗的活塞，使磁纳米粒子的THF溶液逐滴加入到四口烧瓶中，50℃条件下反应3h，然后冷却到室温，加入1000ul的NaOH(0.5M)，然后将产物分装于两个离心管中，3000rpm/min离心10min，去除液体取沉淀，然后往两支离心管中各加入2ml的去离子水，超声30min，最后将产物倒入样品瓶中，置于4℃的冰箱中。即完成了超低场磁探针的制备过程。
由该实施例1中步骤1所制备的磁性纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)图片如图1所示，步骤2所制备的超低场磁探针的透射电子显微镜(TEM)图片如图2中a)所示，亲水配体改性后(制备的超低场磁探针，图2b中左离心管)与亲水配体改性前(制备的磁性纳米粒子，图2b中右离心管)的实验对比效果图片如图2中b)所示。
由图1和图2可知：所制备的超低场磁探针具备良好的单分散性且具备良好的水溶性。
实施例2
将2mmol乙酰丙酮铁、6mmol油酸、6mmol油胺和20ml十八烯加入到150ml的三口瓶，1600rpm/min磁力搅拌混合均匀，80℃抽真空30min，之后充入氮气，然后升温到200℃，保持2h，再升温到300℃，回流1h，移除热源，冷却到室温，然后加入适量的乙醇，6000r/min离心分离10min，取沉淀，然后加入适量的环己烷，使产物溶解，6000r/min再次离心分离10min，取上层液体，重复乙醇沉淀/环己烷分散的过程3次，最后将所制备的磁性纳米粒子直接用于下一步实验。
随后，在一个50ml的四口烧瓶(19*14×3)中加入50mgDHCA(3,4-dihydroxyhydrocinnamic acid)和6ml的THF，四口烧瓶的四个口分别连接热电偶、冷凝管、弯管塞和分液漏斗，分液漏斗中加入20mg磁性纳米颗粒和1ml的THF，在系统中冲入氮气，流速尽量慢(流速过快会带走溶剂)，普通加热套，加热到50℃，然后打开分液漏斗的活塞，使MNPs逐滴加入到四口烧瓶中，50℃条件下反应3h，然后冷却到室温，加入500ul的NaOH(0.5M)，然后将产物分装于两个离心管中，3000rpm/min离心10min，去除液体取沉淀，然后往两支离心管中各加入1ml的去离子水，超声30min，最后将产物倒入样品瓶中，置于4℃的冰箱中。即完成了超低场磁探针的制备过程。
由该实施例2制备的超低场磁探针的透射电子显微镜(TEM)图片如图3所示。
由图3可知：在对实施例1稍加更改的实验条件下，所制备的超低场磁探针仍具有均一的尺寸及形貌。
实施例3
将2mmol乙酰丙酮铁、6mmol油酸、6mmol油胺和20ml十八烯加入到150ml的三口瓶，1600rpm/min磁力搅拌混合均匀，80℃抽真空30min，之后充入氮气，然后升温到200℃，保持15min，再升温到300℃，回流1h，移除热源，冷却到室温，然后加入适量的乙醇，6000r/min离心分离10min，取沉淀，然后加入适量的环己烷，使产物溶解，6000r/min再次离心分离10min，取上层液体，重复乙醇沉淀/环己烷分散的过程3次，最后将所制备的磁性纳米粒子分散在环己烷中保存于样品瓶中并放置于4℃的冰箱中。
由该实施例制备的磁性纳米粒子的动态光散射(DLS)测水动力学粒径的柱状图如图4所示。
由图4可知：所制备的磁性纳米粒子尺寸分布窄，单分散性良好。
实施例4
1、锌锰元素掺杂的铁氧磁性纳米粒子的制备
将1.33mmol乙酰丙酮铁、6mmol油酸、6mmol油胺、0.27mmol氯化锌、0.4mmol氯化锰和20ml十八烯加入到50ml的三口瓶，1600rpm/min磁力搅拌混合均匀，80℃抽真空30min，之后充入氮气，然后升温到300℃，回流60min，移除热源，冷却到室温，然后加入适量的乙醇，6000r/min离心分离10min，取沉淀，然后加入适量的环己烷，使产物溶解，6000r/min再次离心分离10min，取上层液体，重复乙醇沉淀/环己烷分散的过程3次，最后将所制备的磁性纳米粒子((Zn0.4Mn0.6)Fe2O4)的环己烷胶体溶液倒入一个20ml的样品瓶中，放置于4℃的冰箱中。
2、2，3-二巯基丁二酸修饰的锌锰元素掺杂的铁氧磁性纳米粒子的制备
取10mL上述制备的(Zn0.4Mn0.6)Fe2O4纳米粒子的环己烷胶体溶液和40mL乙醇于离心管中，6000rmp离心10min，去除上层溶液，得沉淀。将沉淀真空干燥，得锌锰元素掺杂的铁氧磁性纳米粒子固体。称取10mg的固体纳米颗粒溶于1mL甲苯中，得溶液A。此外，将10mg的2，3-二巯基丁二酸溶于1mL的二甲基亚砜中，得溶液B。将溶液A和B混合，离心分离，取黑色沉淀，干燥，再将黑色固体分散在1mL的去离子水中，4℃保存。
由该实施例制备的锌锰元素掺杂制备的铁氧磁性纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)图片如图5所示。
由图5可知：锌锰元素掺杂制备的铁氧磁性纳米粒子，尺寸均一，单分散性良好。
实施例5
将2mmol乙酰丙酮铁、6mmol油酸、6mmol油胺和20ml十八烯加入到150ml的三口瓶，1600rpm/min磁力搅拌混合均匀，80℃抽真空30min，之后充入氮气，然后升温到200℃，保持15min，再升温到300℃，回流2h，移除热源，冷却到室温，然后加入适量的乙醇，6000r/min离心分离10min，取沉淀，然后加入适量的环己烷，使产物溶解，6000r/min再次离心分离10min，取上层液体，重复乙醇沉淀/环己烷分散的过程3次，最后将所制备的磁性纳米粒子分散在环己烷中保存于样品瓶中并放置于4℃的冰箱中。
由该实施例所制备的磁性纳米粒子的振动样品磁强计(VSM)的图片如图6所示。
由图6可知：所制备的磁性纳米粒子具有较好的饱和磁化强度。
实施例6
将实施例1中制备的超低场磁探针分别称量不同的质量(0～10微克之间)于干净的玻璃载物片上，永铁磁在距载物片2cm远处磁化2min，再拿走磁铁。把磁化后的样品分别用光学原子磁力仪测量磁信号，得到超低场磁探针的质量与磁信号的关系图。
所述超低场磁探针的质量与在光学原子磁力仪测到的磁信号的关系图如图7所示。
由图7可知：实施例1所制备的超低场磁探针具有很好的剩磁-质量线性依赖关系。
实施例7
首先将A549细胞接种于96孔板(1×105)中，采用完全培养基(10％胎牛血清，1％双抗)在5％的二氧化碳环境中培养17h。等细胞贴壁且状态良好，倒掉完全培养基，加入无血清培养基(200μL),同时加入一定量的实施例1所制备的超低场磁探针，使得探针终浓度为0，5，20，50μg/mL。在同样的条件下培养24h。然后弃去带有探针的培养基，然后细胞采用PBS清洗三次。加入完全培养基(200μL)的同时加入20μL的CCK-8试剂，在5％的二氧化碳环境中培养2h。直接用酶标仪检测溶液在405nm处的紫外吸收值。通过与空白试验(相同体积的PBS)对比，计算纳米探针的细胞毒性。
超低场磁探针的A549细胞毒理性测试的结果如图8所示。
由图8可知：所述超低场磁探针在较高孵育浓度及较长孵育时间下，对细胞没有毒性。
实施例8
将A549细胞接种于磁力仪专用的微型培养器(1×104)，采用完全培养基(10％胎牛血清，1％双抗)在5％的二氧化碳环境中培养17h。等细胞贴壁且状态良好，倒掉完全培养基，加入无血清培养基(200μL),同时加入实施例1中所制备的超低场磁探针(20μg/mL)继续在相同条件下培养4h。然后弃去细胞培养基，用PBS清洗3次。加入完全培养基后，用永铁磁铁在距载物片2cm处磁化带有探针的细胞2min。用光学原子磁力仪测定磁化后的探针在细胞中的剩磁信号，同时记录相对于时间变化的信号的强度值。从而判断探针在细胞内磁化后2h的剩磁信号的稳定性。
超低场磁探针活细胞内剩磁信号的稳定性如图9所示。
由图9可知：所制备的超低场磁探针具有很好的信号稳定性。
实施例9
将金黄色葡萄球菌(S.aureus)在TBS培养基中培养4h，待S.aureus培养至对数期，将其接种于磁力仪专用的微型培养器(1×105)中，光学显微镜下观察细菌生长状况，将细菌在PBS缓冲液中与5μg/mL实施例1中所制备的超低场磁探针孵育1h。用永铁磁铁在距载物片2cm处磁化带有探针的细菌2min。用光学原子磁力仪测定磁化后的探针在细胞中的剩磁信号。
由该实施例得到的细菌的光学显微镜图片如图10所示。
由图10可知：培养的细菌生长状况良好。
由该实施例得到的细菌孵育超低场磁探针后，利用光学原子磁力仪测得的剩磁信号如图11所示。
由图11可知：所制备的超低场磁探针可以对细菌进行标记并在光学原子磁力仪下检测到较高的剩磁信号。