一种单分子细胞检测方法及其应用和单分子细胞检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种单分子细胞检测方法及其应用和单分子细胞检测试剂盒。所述单分子细胞检测方法包括如下步骤：1)提供捕获探针和报告探针，所述捕获探针包括第一配体和修饰在所述第一配体上的生物素分子；所述报告探针包括第二配体和修饰在所述第二配体上的荧光分子；2)提供待测细胞，所述待测细胞的表面具有受体分子，所述第一配体和第二配体具有特异性结合所述受体分子的结构域；3)在结合缓冲液中加入所述报告探针、捕获探针和待测细胞，富集到探针-细胞-磁珠复合物；4)在步骤(3)所得的探针-细胞-磁珠复合物中加入洗脱缓冲液，加热，离心，取上清液进行单分子荧光检测。
【专利说明】一种单分子细胞检测方法及其应用和单分子细胞检测试剂 合 Sl
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞检测领域，具体涉及一种单分子细胞检测方法及其应用和单分子 细胞检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 癌症的检测方法对临床诊断非常重要。
[0003] 目前，以蛋白质和基因等作为生物标志物的分子识别方法在癌症检测中已有应 用，比如：利用免疫染色、质谱、荧光谱等能够检测细胞表面及血液中的特异性抗体；利用 核酸序列扩增的方法检测目标基因、基因变化和基因甲基化。然而，检测抗体的方法易出现 假阳性信号；检测基因等生物标志物的方法需要复杂的基因提取过程，并通常要结合核酸 序列扩增手段以放大信号。
[0004] 流式细胞仪能在细胞水平实现对癌症的检测，但是对细胞个数有一定的要求（通 常需要大于10万个细胞），因此，流式细胞仪对于含量极少的循环肿瘤细胞（CTCs)很难实 现有效检测。
[0005] 因此，有必要提供一种简便、快速、高灵敏度的细胞检测方法。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种单分子细胞检测方法及其应用和单分子细胞 检测试剂盒。
[0007] 第一方面，本发明提供了一种单分子细胞检测方法，包括如下步骤：
[0008] 1)提供捕获探针和报告探针，所述捕获探针包括第一配体和修饰在所述第一配体 上的生物素分子；所述报告探针包括第二配体和修饰在所述第二配体上的荧光分子；
[0009] 2)提供待测细胞，所述待测细胞的表面具有受体分子，所述第一配体和第二配体 具有特异性结合所述受体分子的结构域；
[0010] 3)在结合缓冲液中加入所述报告探针、捕获探针和待测细胞，混匀后孵育0. 5?2 小时，再离心去上清，然后加入链霉亲和素标记的磁珠，室温孵育20?60分钟时间后，磁分 离2?10分钟，富集到探针-细胞-磁珠复合物；
[0011] 4)在步骤（3)所得的探针-细胞-磁珠复合物中加入洗脱缓冲液，80?95°C下加 热2?10分钟，离心，取上清液进行单分子荧光检测。
[0012] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述第一配体为核酸适体DNA、核酸适体 RNA或抗体分子。
[0013] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述第二配体为核酸适体DNA、核酸适体 RNA或抗体分子。
[0014] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述第一配体与第二配体相同或不同。
[0015] 如本发明所述的，"具有特异性结合所述受体分子的结构域"是指配体分子具有能 与待测细胞表面受体特异性结合的核酸片段结构、多肽片段结构或抗体结构域。
[0016] 如本发明所述的，"核酸适体DNA、核酸适体RNA"是指能与待测细胞表面受体结合 的核酸片段。
[0017] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（1)中，所述核酸适体DNA包括如SEQ ID NO: 1?4所示的任一种核苷酸序列。
[0018] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（1)中，所述核酸适体DNA为但不限于人小细 胞肺癌细胞（NCI-H69)的核酸识体DNA、人B淋巴瘤细胞（Ramos)的核酸识体DNA、耐糖皮 质激素人淋巴瘤细胞（Toledo)的核酸识体DNA、人急性淋巴白血病细胞（CCRF-CEM)的核酸 识体DNA、人肝肿瘤细胞〇fepG2)的核酸识体DNA、人结肠癌细胞（HT-29)的核酸识体DNA、 人卵巢癌细胞（T0V-21G，卵巢透明细胞腺癌）的核酸识体DNA或人卵巢癌细胞（CAOVUP 巢浆液性腺癌）的核酸识体DNA。
[0019] 如本发明所述的，所述人小细胞肺癌细胞（NCI-H69)的核酸识体DNA包括如SEQ ID N0:5或6所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID N0:5为HCA12:5' -GTG GAT TGT TGT GTT CTG TTG GTT TTT GTG TTG TC-3，，所述SEQ ID NO:6为HCC03 :5，-TCC GTG CCA CTG GCC CCC GGT GCC CCG GTC CCC GG-3Z 。
[0020] 如本发明所述的，所述人B淋巴瘤细胞（Ramos)的核酸识体DNA包括如SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID N0:7为TD05:5' -AAC ACC GGG AGG ATA GTT CGG TGG CTG TTC AGG GTC TCC TCC CGG TG-3^ 。
[0021] 如本发明所述的，所述耐糖皮质激素人淋巴瘤细胞（Toledo)的核酸识体DNA包括 如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID N0:8为sgd5/Tl# -ATA CCA GCT TAT TCA ATT ATC GTG GGT CAC AGC AGC GGT TGT GAG GM GM AGG CGG ATA ACA GAT AAT AAG ΑΤΑ GTA AGT GCA ATC Τ-3^ ;
[0022] 如本发明所述的，所述人急性淋巴白血病细胞（CCRF-CEM)的核酸识体DNA包括如 SEQ ID Ν0:9所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID Ν0:9为sgcSA' -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3^ ;
[0023] 如本发明所述的，所述人肝肿瘤细胞（!fepG2)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO: 10或11所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO: 10为B-2 # -CAA CTC AAT AAG CTA GGT GGG TGG GGG ACA CTG CCC GGG GGT GGT TGG GT-3，（SEQ ID NO: 10);所述 SEQ ID NO:11为E-I :5，-CGA TGG CGG TGG GTG GGG GAC AAA TTT GGG GGG CGT TGG GTG TTT GTG GT-3，。
[0024] 如本发明所述的，所述人结肠癌细胞（HT-29)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO: 12或13所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO: 12为SYLl # -AGC GTC GAA TAC CAC TAC AGT TTG GCT CTG GGG GAT GTG GAG GGG GGT ATG GGT GGG AGT CTA ATG GAG CTC GTG GTC AG-3';所述SEQ ID NO: 13 为 SYL2 :5' -AGC GTC GM TAC CAC TAC AGA GCT CGG GGT TTT TTG GGG TTT TTT GGG GTT TTG GTG GGG CTA ATG GAG CTC GTG GTC AG-3^ 。
[0025] 如本发明所述的，所述人卵巢癌细胞（T0V-21G，卵巢透明细胞腺癌）的核酸识体 DNA包括如SEQ ID NO: 14或15所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO: 14为Tov2 : 5' -ATC CAG AGT GAC GCA GCA TAA TCT CTA CAG GCG CAT GTA ATA TAA TGA AGC CCA TCC ACC TGG ACA CGG TGG CTT A-3';所述 SEQ ID NO: 15 为 Tov3 :5' -ATC CAG AGT GAC GCA GCA CTC ACT CTG ACC TTG GAT CGT CAC ATT ACA TGG GAT CAT CAG TCG ACA CGG TGG CTT Ut 〇
[0026] 如本发明所述的，所述人卵巢癌细胞（CA0V-3,卵巢浆液性腺癌）的核酸识体DNA 包括如SEQ ID N0:16或17所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID N0:16为D0V4:5' -ACT CM CGA ACG CTG TGG AGG GCA TCA GAT TAG GAT TAG GAT CTA TAG GTT CGG ACA TCG TGA GGA CCA GGA GAG CA-3，；所述SEQ ID NO: 17为D0V6 :5，-ACT CAA CGA ACG CTG TGG AAT GTT GGG GTA GGT AGA AGG TGA AGG GGT TTC AGT TGA GGA CCA GGA GAG Ck-?,'.
[0027] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（I)中，所述核酸适体RNA包括但不限于人类 星形胶质细胞瘤细胞（U251，脑癌）的核酸识体RNA、人乳腺癌细胞（MCF7)的核酸识体RNA 或人前列腺癌细胞（LNCaP)的核酸识体RNA。
[0028] 如本发明所述的，所述人类星形胶质细胞瘤细胞（U251，脑癌）的核酸识体RNA包 括如SEQ ID N0:18所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID N0:18为E9P2-2:5' -UGC CCA CUA UGC GUG CCG AAA AAC AUU UCC CCC UCU ACC C-3， ·
[0029] 如本发明所述的，所述人乳腺癌细胞（MCF7)的核酸识体RNA包括如SEQ ID NO: 19 所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO: 19为A30 :5' -CAG CGA AAG UUG CGU AUG GGU CAC AUC GCA GGC ACA UGU CAU CUG GGC Gl。
[0030] 如本发明所述的，所述人前列腺癌细胞（LNCaP)的核酸识体RNA包括如SEQ ID N0:20或21所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID N0:20为A9 # -ACC GAA AAA GAC CUG ACU UCU AUA CUA A⑶ CUA CGU UCCIi ;所述SEQ ID N0:21 为AlO :5' -AUC AGC CAU GUU UAC ⑶C ACU CCU UGU CAA UCC UCA UCG Gl。
[0031] 如本发明所述的，"抗体分子"是指能与待测细胞表面受体结合的抗体。
[0032] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（1)中，所述抗体分子包括但不限于上皮细 胞粘附分子抗体（anti-EpCAM/⑶326)、白细胞共同抗原抗体（anti-⑶45)、表皮生长因子 抗体（anti-EGFR)、甲胎蛋白抗体（anti-AFP)、造血干细胞抗原⑶133抗体（anti-⑶133)、 乳腺癌HER2抗体（anti-HER2/neu)、MUCl粘蛋白抗体（anti-MUCl)或乳腺癌相关抗原 BRCAAl 抗体（anti-BRCAAl/RBBP 1L1)。
[0033] 本发明所述的捕获探针和报告探针，在配体类别的选择上，可以选择核酸适体 DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
[0034] 优选地，当不同待测细胞与某种抗体分子都能结合时，优选核酸适体DNA/RNA作 为配体，如EGFR分布于上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，anti-EGFR 能结合表皮鳞癌细胞（A431)、人结直肠癌细胞（DiFi)、前列腺癌细胞（DU145)、人乳腺癌细 胞（MDA-MB-468)、宫颈癌细胞（ME180)等。
[0035] 优选地，当指数富集的配基系统进化技术（SELEX)未筛选出核酸适体DNA/RNA、或 筛选出核酸适体DNA/RNA的亲和常数（Kd)值较大、或核酸适体DNA/RNA对几种细胞都有作 用时，优选抗体分子作为配体，如针对NCI-H69细胞筛选出的核酸适体DNA (HCH07:5 ^ -GCC GAT GTC AAC TTT TTC TAA CTC ACT GGT TTT GC-3')，能识别人小细胞肺癌细胞 (NCI-H69、NCI-H146、NCI-H128)、人肺腺癌细胞（NCI-H23)、肝癌细胞（MEA、BNL)。
[0036] 在本发明一实施例中，所述步骤（1)中，所述荧光分子为有机染料分子、无机荧光 纳米颗粒或发光蛋白质。
[0037] 在本发明一优选实施例中，所述有机染料分子包括但不限于Alexa Fluor488、 Alexa Fluor 640、FAM、R6G、R0X、FITC、cy3、cy5、PE 或 APC。
[0038] 在本发明一优选实施例中，所述无机荧光纳米颗粒包括但不限于QD525量子点、 QD605量子点或QD655量子点。
[0039] 在本发明一优选实施例中，发光蛋白质包括但不限于绿色荧光蛋白（GFP)、青色荧 光蛋白（CFP)或黄色荧光蛋白（YFP)。
[0040] 本发明提供的报告探针采用的荧光分子可根据实际需要进行选择，本发明采用的 有机染料分子标记配体、发光蛋白质标记抗体等容易直接合成或购得；本发明采用的无机 荧光纳米颗粒具有激发光谱宽且连续分布，发射光谱窄且对称，颜色可调，光化学稳定性 高，荧光寿命长的特点，其标记配体时具有易控性。
[0041] 在本发明一实施例中，所述步骤（2)包括至少一种待测细胞，每种待测细胞采用 至少一种报告探针，其中，每种报告探针的荧光分子均不相同。
[0042] 在此优选条件下，采用不同的荧光分子即可对不同的待测细胞进行标记，因此，通 过对不同报告分子进行单分子检测可以读出待测细胞的信息，从而同时对多种细胞进行检 测。
[0043] 在本发明一实施例中，所述步骤（2)包括至少一种待测细胞，每种待测细胞采用 至少一种捕获探针，其中，每种捕获探针的第一配体均不相同。
[0044] 在此优选条件下，每种待测细胞上具有不同的受体分子，这些受体分子可以特异 地与不同的第一配体结合，从而提高待测细胞在后续磁分离过程中被富集的概率。
[0045] 在本发明一实施例中，所述步骤（2)包括至少一种待测细胞，所述待测细胞来源 于B淋巴细胞肿瘤、白血病、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌和 甲状腺癌的细胞或组织中的至少一种。
[0046] 在本发明一实施例中，所述步骤（3)中，所述结合缓冲液为包含酵母转移核糖核 酸（Yeast tRNA)和牛血清白蛋白（BSA)的洗涤缓冲液。
[0047] 在本发明一实施例中，所述步骤（3)中，所述结合缓冲液中还包含胎牛血清 (FBS)。
[0048] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（3)中，所述洗涤缓冲液为包含4.5g/L葡萄 糖和5mM氯化镁的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS，pH 7. 3)。
[0049] 如本发明所述的，所述"结合缓冲液"可以由本领域技术人员根据具体需要（即细 胞上的受体分子和捕获探针、报告探针上的配体分子相结合所需要的缓冲液）进行配置。
[0050] 在本发明一实施例中，所述步骤（3)中，所述报告探针的浓度为100?5000nM。
[0051] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（3)中，所述报告探针的浓度为100?500nM。
[0052] 在本发明一实施例中，所述步骤（3)中，所述捕获探针的浓度为100?5000nM。
[0053] 在本发明一优选实施例中，所述步骤（3)中，所述捕获探针的浓度为100?500nM。
[0054] 在本发明一实施例中，所述步骤（3)中，所述待测细胞的浓度为0. 01?1000个/ μ 1〇
[0055] 在本发明一实施例中，所述步骤（3)中，混匀后孵育的温度条件为0?10°C。
[0056] 在本发明一实施例中，所述步骤（3)中，离心去上清的方法采用本领域常用的对 细胞进行离心的条件。
[0057] 在本发明一实施例中，所述步骤（3)中，所述链霉亲和素标记的磁珠包括但不限 于购买的链霉亲和素标记的磁珠。
[0058] 如本发明所述的，所述步骤（3)中，"探针-细胞-磁珠复合物"是指细胞上的受体 特异性地与捕获探针、报告探针结合后，由于捕获探针上修饰有生物素，通过生物素和链霉 亲和素的结合作用，磁分离后可以对同时结合有捕获探针以及报告探针的细胞进行富集， 得到所述探针-细胞-磁珠复合物。
[0059] 在本发明一实施例中，所述步骤（4)中，所述洗脱缓冲液包括但不限于DL-二硫 苏糖醇（DTT，300mM)、2-巯基乙醇（2.0M)、十二烷基硫酸钠（SDS，0. 1%)、或含95%甲酰胺 的乙二胺四乙酸（EDTA，10mM，pH 8. 2)。
[0060] 如本发明所述的，所述"洗脱缓冲液"可以由本领域技术人员根据具体需要（使生 物素-链霉亲和素断开所需要的缓冲液）进行配置。
[0061] 如本发明所述的，所述步骤（4)中，所采用的洗脱缓冲液可使生物素-链霉亲和素 断开，通过后续加热处理可使配体和细胞受体断开结合，从而释放细胞上的捕获探针和报 告探针，通过离心分离得到包含捕获探针和报告探针的上层清液，将此上清液用于单分子 检测；由于报告探针上的报告分子的荧光分子数量或荧光强度与细胞数量成正比，因此，由 所检测到的荧光分子数量或荧光强度即可获知细胞的数量，进而实现高灵敏特异性的细胞 检测；此外，报告探针上的报告分子的荧光分子数量或荧光强度可以反映每个细胞上平均 结合的配体数量，从而获得待测细胞表面受体的种类和数量信息。
[0062] 如本发明所述的，所述"单分子检测"的设备优选是采用单分子仪检测分子个数， 或检测单分子水平上的荧光强度。
[0063] 第二方面，本发明提供了一种单分子细胞检测试剂盒，包括：
[0064] 捕获探针和报告探针，所述捕获探针包括第一配体和修饰在所述第一配体上的生 物素分子；所述报告探针包括第二配体和修饰在所述第二配体上的荧光分子；所述第一配 体和第二配体具有与待测细胞表面的受体分子结合的结构域；以及 [0065] 结合缓冲液、链霉亲和素标记的磁珠和洗脱缓冲液。
[0066] 在本发明一实施例中，所述第一配体为核酸适体DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
[0067] 在本发明一实施例中，所述第二配体为核酸适体DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
[0068] 在本发明一实施例中，所述第一配体与第二配体相同或不同。
[0069] 如本发明所述的，"具有特异性结合所述受体分子的结构域"是指配体分子具有能 与待测细胞表面受体特异性结合的核酸片段结构、多肽片段结构或抗体结构域。
[0070] 如本发明所述的，"核酸适体DNA、核酸适体RNA"是指能与待测细胞表面受体结合 的核酸片段。
[0071] 在本发明一优选实施例中，所述核酸适体DNA包括如SEQ ID NO: 1?4所示的任 一种核苷酸序列。
[0072] 在本发明一优选实施例中，所述核酸适体DNA为但不限于人小细胞肺癌细胞 (NCI-H69)的核酸识体DNA、人B淋巴瘤细胞（Ramos)的核酸识体DNA、耐糖皮质激素人淋巴 瘤细胞（Toledo)的核酸识体DNA、人急性淋巴白血病细胞（CCRF-CEM)的核酸识体DNA、人 肝肿瘤细胞（HepG2)的核酸识体DNA、人结肠癌细胞（HT-29)的核酸识体DNA、人卵巢癌细 胞（T0V-21G，卵巢透明细胞腺癌）的核酸识体DNA或人卵巢癌细胞（CA0V-3,卵巢浆液性腺 癌）的核酸识体DNA。
[0073] 如本发明所述的，所述人小细胞肺癌细胞（NCI-H69)的核酸识体DNA包括如SEQ ID N0:5或6所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID N0:5为HCA12:5' -GTG GAT TGT TGT GTT CTG TTG GTT TTT GTG TTG TC-3，，所述SEQ ID NO:6为HCC03 :5，-TCC GTG CCA CTG GCC CCC GGT GCC CCG GTC CCC GG-3Z 。
[0074] 如本发明所述的，所述人B淋巴瘤细胞（Ramos)的核酸识体DNA包括如SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID N0:7为TD05:5' -AAC ACC GGG AGG ATA GTT CGG TGG CTG TTC AGG GTC TCC TCC CGG TG-3^ 。
[0075] 如本发明所述的，所述耐糖皮质激素人淋巴瘤细胞（Toledo)的核酸识体DNA包括 如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID N0:8为sgd5/Tl# -ATA CCA GCT TAT TCA ATT ATC GTG GGT CAC AGC AGC GGT TGT GAG GM GM AGG CGG ATA ACA GAT AAT AAG ΑΤΑ GTA AGT GCA ATC Τ-3^ ;
[0076] 如本发明所述的，所述人急性淋巴白血病细胞（CCRF-CEM)的核酸识体DNA包括如 SEQ ID Ν0:9所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID Ν0:9为sgcSA' -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3^ ;
[0077] 如本发明所述的，所述人肝肿瘤细胞（!fepG2)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO: 10或11所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO: 10为B-2 :5' -CAA CTC AAT AAG CTA GGT GGG TGG GGG ACA CTG CCC GGG GGT GGT TGG GT-3，（SEQ ID NO: 10);所述 SEQ ID NO:11为E-I :5，-CGA TGG CGG TGG GTG GGG GAC AAA TTT GGG GGG CGT TGG GTG TTT GTG GT-3，。
[0078] 如本发明所述的，所述人结肠癌细胞（HT-29)的核酸识体DNA包括如SEQ ID NO: 12或13所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO: 12为SYLl # -AGC GTC GAA TAC CAC TAC AGT TTG GCT CTG GGG GAT GTG GAG GGG GGT ATG GGT GGG AGT CTA ATG GAG CTC GTG GTC AG-3';所述SEQ ID NO: 13 为 SYL2 :5' -AGC GTC GM TAC CAC TAC AGA GCT CGG GGT TTT TTG GGG TTT TTT GGG GTT TTG GTG GGG CTA ATG GAG CTC GTG GTC AG-3^ 。
[0079] 如本发明所述的，所述人卵巢癌细胞（T0V-21G，卵巢透明细胞腺癌）的核酸识体 DNA包括如SEQ ID NO: 14或15所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO: 14为Tov2 : 5' -ATC CAG AGT GAC GCA GCA TM TCT CTA CAG GCGCAT GTA ATA TAA TGA AGC CCA TCC ACC TGG ACA CGG TGG CTT A-3';所述 SEQ ID NO: 15 为 Tov3 :5' -ATC CAG AGT GAC GCA GCA CTC ACT CTG ACC TTG GAT CGT CAC ATT ACA TGG GAT CAT CAG TCG ACA CGG TGG CTT Ut ο
[0080] 如本发明所述的，所述人卵巢癌细胞（CA0V-3,卵巢浆液性腺癌）的核酸识体DNA 包括如SEQ ID Ν0:16或17所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID Ν0:16为D0V4:5' -ACT CM CGA ACG CTG TGG AGG GCA TCA GAT TAG GAT TAG GAT CTA TAG GTT CGG ACA TCG TGA GGA CCA GGA GAG CA-3，；所述SEQ ID NO: 17为D0V6 :5，-ACT CAA CGA ACG CTG TGG AAT GTT GGG GTA GGT AGA AGG TGA AGG GGT TTC AGT TGA GGA CCA GGA GAG CA-Si .
[0081] 在本发明一优选实施例中，所述核酸适体RNA包括但不限于人类星形胶质细胞瘤 细胞（U251，脑癌）的核酸识体RNA、人乳腺癌细胞（MCF7)的核酸识体RNA或人前列腺癌细 胞（LNCaP)的核酸识体RNA。
[0082] 如本发明所述的，所述人类星形胶质细胞瘤细胞（U251，脑癌）的核酸识体RNA包 括如SEQ ID N0:18所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID N0:18为E9P2-2:5' -UGC CCA CUA UGC GUG CCG AAA AAC AUU UCC CCC UCU ACC C-3， ·
[0083] 如本发明所述的，所述人乳腺癌细胞（MCF7)的核酸识体RNA包括如SEQ ID NO: 19 所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID NO: 19为A30 :5' -CAG CGA AAG UUG CGU AUG GGU CAC AUC GCA GGC ACA UGU CAU CUG GGC Gl。
[0084] 如本发明所述的，所述人前列腺癌细胞（LNCaP)的核酸识体RNA包括如SEQ ID N0:20或21所示的核苷酸序列，具体地，所述SEQ ID N0:20为A9 # -ACC GAA AAA GAC CUG ACU UCU AUA CUA A⑶ CUA CGU UCCIi ;所述SEQ ID N0:21 为AlO :5' -AUC AGC CAU GUU UAC ⑶C ACU CCU UGU CAA UCC UCA UCG Gl。
[0085] 如本发明所述的，"抗体分子"是指能与待测细胞表面受体结合的抗体。
[0086] 在本发明一优选实施例中，所述抗体分子包括但不限于上皮细胞粘附分子 抗体（anti-EpCAM/⑶326)、白细胞共同抗原抗体（anti-⑶45)、表皮生长因子抗体 (anti-EGFR)、甲胎蛋白抗体（anti-AFP)、造血干细胞抗原CD133抗体（anti-CD133)、乳腺 癌HER2抗体（anti-HER2/neu)、MUC1粘蛋白抗体（anti-MUCl)、乳腺癌相关抗原BRCAAl抗 体（anti-BRCAAl/RBBPILl)。
[0087] 本发明所述的捕获探针和报告探针，在配体类别的选择上，可以选择核酸适体 DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
[0088] 优选地，当不同待测细胞与某种抗体分子都能结合时，优选核酸适体DNA/RNA 作为配体，如EGFR广泛分布于上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面， anti-EGFR能结合表皮鳞癌细胞（A431)、人结直肠癌细胞（DiFi)、前列腺癌细胞（DU145)、 人乳腺癌细胞（MDA-MB-468)、宫颈癌细胞（ME180)等。
[0089] 优选地，当指数富集的配基系统进化技术（SELEX)未筛选出核酸适体DNA/RNA、或 筛选出核酸适体DNA/RNA的亲和常数（Kd)值较大、或核酸适体DNA/RNA对几种细胞都有作 用时，优选抗体分子作为配体，如针对NCI-H69细胞筛选出的核酸适体DNA (HCH07:5 ^ -GCC GAT GTC AAC TTT TTC TAA CTC ACT GGT TTT GC-3')，能识别人小细胞肺癌细胞 (NCI-H69、NCI-H146、NCI-H128)、人肺腺癌细胞（NCI-H23)、肝癌细胞（MEA、BNL)。
[0090] 在本发明一实施例中，所述荧光分子为有机染料分子、无机荧光纳米颗粒或发光 蛋白质。
[0091] 在本发明一优选实施例中，所述有机染料分子包括但不限于Alexa Fluor488、 Alexa Fluor 640、FAM、R6G、R0X、FITC、cy5、PE 或 APC。
[0092] 在本发明一优选实施例中，所述无机荧光纳米颗粒包括但不限于QD525量子点、 QD605量子点或QD655量子点。
[0093] 在本发明一优选实施例中，发光性蛋白质包括但不限于绿色荧光蛋白（GFP)、青色 荧光蛋白（CFP)或黄色荧光蛋白（YFP)。
[0094] 本发明提供的报告探针采用的荧光分子可根据实际需要进行选择，本发明采用的 有机染料分子标记配体、发光蛋白质标记抗体等容易直接合成或购得；本发明采用的无机 荧光纳米颗粒具有激发光谱宽且连续分布，发射光谱窄且对称，颜色可调，光化学稳定性 高，荧光寿命长的特点，其标记配体时具有易控性。
[0095] 在本发明一实施例中，所述单分子细胞检测试剂盒可用于检测至少一种待测细 胞，每种待测细胞采用至少一种报告探针，其中，每种报告探针的荧光分子均不相同。
[0096] 在此优选条件下，采用不同的荧光分子即可对不同的待测细胞进行标记，因此，通 过对不同报告分子进行单分子检测可以读出待测细胞的信息，从而同时对多种细胞进行检 测。
[0097] 在本发明一实施例中，所述单分子细胞检测试剂盒可用于检测至少一种待测细 胞，每种待测细胞采用至少一种捕获探针，其中，每种捕获探针的第一配体均不相同。
[0098] 在此优选条件下，每种待测细胞上具有不同的受体分子，这些受体分子可以特异 地与不同的第一配体结合，从而提高待测细胞在后续磁分离过程中被富集的概率。
[0099] 在本发明一实施例中，所述单分子细胞检测试剂盒可用于检测至少一种待测细 胞，所述待测细胞来源于B淋巴细胞肿瘤、白血病、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌、乳 腺癌、胰腺癌、膀胱癌和甲状腺癌的细胞或组织中的至少一种。
[0100] 在本发明一实施例中，所述结合缓冲液为包含酵母转移核糖核酸（Yeast tRNA)和 牛血清白蛋白（BSA)的洗涤缓冲液。
[0101] 在本发明一实施例中，所述结合缓冲液中还包含胎牛血清（FBS)。
[0102] 在本发明一优选实施例中，所述洗涤缓冲液为包含4. 5g/L葡萄糖和5mM氯化镁的 杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS，pH 7. 3)。
[0103] 如本发明所述的，所述"结合缓冲液"可以由本领域技术人员根据具体需要（即细 胞上的受体分子和捕获探针、报告探针上的配体分子相结合所需要的缓冲液）进行配置。
[0104] 在本发明一实施例中，所述报告探针的浓度为100?5000nM。
[0105] 在本发明一优选实施例中，所述报告探针的浓度为100?500nM。
[0106] 在本发明一实施例中，所述捕获探针的浓度为100?5000nM。
[0107] 在本发明一优选实施例中，所述捕获探针的浓度为100?500nM。
[0108] 在本发明一实施例中，所述单分子细胞检测试剂盒可用于检测的待测细胞的浓度 为 0· 01 ?1000 个 /μ 1。
[0109] 在本发明一实施例中，所述链霉亲和素标记的磁珠包括但不限于购买的链霉亲和 素标记的磁珠。
[0110] 在本发明一实施例中，所述洗脱缓冲液包括但不限于DL--二硫苏糖醇（DTT， 300mM)、2-巯基乙醇（2.0Μ)、十二烷基硫酸钠（SDS，0. 1%)、或含95%甲酰胺的乙二胺四乙 酸（EDTA，10mM，pH 8· 2)。
[0111] 如本发明所述的，所述"洗脱缓冲液"可以由本领域技术人员根据具体需要（使生 物素-链霉亲和素断开所需要的缓冲液）进行配置。
[0112] 第三方面，本发明提供了如第一方面所述的单分子细胞检测方法在制备癌症或肿 瘤诊断试剂盒中的应用。
[0113] 本发明提供了单分子细胞检测方法及应用和单分子细胞检测试剂盒具有如下有 益效果：
[0114] (1)本发明提供的单分子细胞检测方法简便、快速、灵敏度高，利用细胞表面受体 特异性结合大量捕获探针和报告探针的优势，以放大待测细胞的检测信号，无需序列放大 反应；
[0115] (2)本发明提供的单分子细胞检测方法特异性好，可以同时检测多种细胞；
[0116] (3)本发明提供的单分子细胞检测试剂盒设计简单、成本较低。
【专利附图】
【附图说明】
[0117] 图1为本发明实施例提供的单分子细胞检测方法的流程示意图。
[0118] 图2为本发明实施例提供的单分子细胞检测方法对两种细胞进行检测的原理示 意图。
[0119] 图3为本发明实施例提供的单分子细胞检测方法检测细胞的荧光图像结果。
[0120] 图4为本发明实施例提供的不同个数A549细胞的单分子检测结果。
[0121] 图5为本发明实施例提供的不同个数H23细胞的单分子检测结果。
[0122] 图6为本发明实施例提供的同时对A549细胞和H23细胞进行单分子检测的结果。
[0123] 图7为本发明实施例提供的对A549细胞、H23细胞、H460细胞、H69细胞、MCF-7 细胞分别进行单分子检测的结果。
【具体实施方式】
[0124] 以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
[0125] 本发明涉及的英文说明：U/μ 1 :单位每微升；mmol/L:毫摩尔每升；ymol/ L(yM):微摩尔每升；nmol/L(nM):纳摩尔每升；pmol/L(pM)皮摩尔每升；fmol/L(fM)飞摩 尔每升；yg/mL:微克每毫升。
[0126] 表1中的DNA寡核苷酸由英潍捷基（广州）公司合成：
[0127] 表1.合成序列
[0128]
【权利要求】
1. 一种单分子细胞检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 提供捕获探针和报告探针，所述捕获探针包括第一配体和修饰在所述第一配体上的 生物素分子；所述报告探针包括第二配体和修饰在所述第二配体上的荧光分子； 2) 提供待测细胞，所述待测细胞的表面具有受体分子，所述第一配体和第二配体具有 特异性结合所述受体分子的结构域； 3) 在结合缓冲液中加入所述报告探针、捕获探针和待测细胞，混匀后孵育0. 5?2小 时，再离心去上清，然后加入链霉亲和素标记的磁珠，室温孵育20?60分钟时间后，磁分离 2?10分钟，富集到探针-细胞-磁珠复合物； 4) 在步骤（3)所得的探针-细胞-磁珠复合物中加入洗脱缓冲液，80?95°C下加热 2?10分钟，离心，取上清液进行单分子荧光检测。
2. 如权利要求1所述的单分子细胞检测方法，其特征在于，所述步骤（1)中，所述第一 配体为核酸适体DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
3. 如权利要求1所述的单分子细胞检测方法，其特征在于，所述步骤（1)中，所述第二 配体为核酸适体DNA、核酸适体RNA或抗体分子。
4. 如权利要求2或3所述的单分子细胞检测方法，其特征在于，所述抗体分子包 括上皮细胞粘附分子抗体（anti-EpCAM/⑶326)、白细胞共同抗原抗体（anti-⑶45)、表 皮生长因子抗体（anti-EGFR)、甲胎蛋白抗体（anti-AFP)、造血干细胞抗原⑶133抗体 (anti-CD133)、乳腺癌 HER2 抗体（anti-HER2/neu)、MUCl 粘蛋白抗体（anti-MUCl)或乳腺 癌相关抗原 BRCAAl 抗体（anti-BRCAAl/RBBPILl)。
5. 如权利要求1所述的单分子细胞检测方法，其特征在于，所述步骤（1)中，所述荧光 分子为有机染料分子、无机荧光纳米颗粒或发光蛋白质。
6. 如权利要求5所述的单分子细胞检测方法，其特征在于，所述无机荧光纳米颗粒包 括QD525量子点、QD605量子点或QD655量子点。
7. 权利要求1所述的单分子细胞检测方法，其特征在于，所述步骤（2)包括至少一种 待测细胞，所述待测细胞来源于B淋巴细胞肿瘤、白血病、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、食管 癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌和甲状腺癌的细胞或组织中的至少一种。
8. 如权利要求1所述单分子细胞检测方法，其特征在于，所述步骤（3)中，所述结合缓 冲液为包含酵母转移核糖核酸（Yeast tRNA)和牛血清白蛋白（BSA)的洗涤缓冲液。
9. 一种单分子细胞检测试剂盒，其特征在于，包括：捕获探针和报告探针，所述捕获探 针包括第一配体和修饰在所述第一配体上的生物素分子；所述报告探针包括第二配体和修 饰在所述第二配体上的荧光分子；所述第一配体和第二配体具有与待测细胞表面的受体分 子结合的结构域；以及 结合缓冲液、链霉亲和素标记的磁珠和洗脱缓冲液。
10. 如权利要求1所述的单分子细胞检测方法在制备癌症或肿瘤诊断试剂盒中的应 用。
【文档编号】G01N33/574GK104313139SQ201410541542
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】张春阳, 胡娟 申请人:深圳先进技术研究院