一种检测聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料，具体涉及聚丙酰胺凝胶电泳方法中检测DNA的银染试剂。

背景技术：

聚丙烯酰胺凝胶的银染法是检测DNA分子标记的常用方法之一，该方法具有高的灵敏度和高的分辨率，可区分1个碱基的差异【Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,304-306】和鉴别出低至27.8pg的DNA【An Z,Xie L,Cheng H,Zhou Y,Zhang Q,He X,Huang H.A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment.Anal Biochem,2009,391:77-79】。但从目前业已报道的检测PCR扩增产物的传统经典银染方法【Bassam BJ,Caetano AG,Gresshoff PM.Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels.Anal Biochem,1991,196(1):80-83)及改良银染方法(Liang Q,Wen D,Xie J,Liu L,Wei Y,Wang Y,Shi S.A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels.Electrophoresis,2014,35(17):2520-2523】所需试剂来看，甲醛是现在所有银染方法显色步骤中的必需试剂，使用浓度在370～1480mg/L之间【郭培国,刘文杰,李海洋,王直亮,夏岩石,李荣华.一种快速有效检测SSR标记的聚丙烯酰胺凝胶的银染方法.广州大学学报(自然科学版)，2016，(4):1-6】。

众所周知，甲醛是一种易溶于水的高刺激性有毒气体，在常温下易挥发；环境中的甲醛属于一种严重影响人类健康的污染物。它对人体的危害主要包括(1)刺激作用：主要表现在对皮肤黏膜的刺激作用，且能与蛋白质的氨基结合，高浓度吸入时出现呼吸道严重的刺激和水肿、眼刺激和头痛等症状；(2)致敏作用：主要表现在皮肤直接接触甲醛可引起过敏性皮炎、色斑、组织细胞坏死；(3)致突变作用：属于基因毒性物质，是潜在的强致突变物之一，如可引起鼻咽肿瘤等(闫金萍.甲醛及其对人体的危害.化学世界，2004(10):558-559)。因其毒性较大，目前世界卫生组织(WHO)和美国环境保护局(EPA)均将甲醛列为潜在危险致癌物和重要环境污染物(徐向荣和徐增康.甲醛的危害及其卫生检验方法.职业与健康，2003,19(12):47-49)；在我国有毒化学品优先控制名单中，甲醛高居第二位【周雪媚，李玉光，陈霜玲，付慧群，姜思朋，王永.一株高效甲醛降解菌的分离筛选与降解特性研究.生态环境学报，2015,24(12):2040-2044】。对于利用银染法检测PCR扩增产物的操作人员来讲，长期使用和接触甲醛溶液，人体不可避免吸入挥发在空气中的甲醛、或经皮肤接触导致甲醛侵入人体，从而危害身体健康。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种检测聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染试剂盒，该试剂盒不仅可替代现有的DNA银染试剂，而且不含对操作人员身体健康有害的甲醛。

本发明解决上述问题的技术方案是：

一种检测聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染试剂盒，该试剂盒包括：

试剂A：该试剂为水溶液，且每一升该水溶液中具有冰醋酸3～5mL、硝酸银1～3g和乙醇50～100mL；

试剂B：该试剂为水溶液，且每一升该水溶液中具有氯化钠0.5～1g、亚硫酸钠0.5～2.5g、碳酰肼0.1～0.3g、碳酸钠2～10g和葡萄糖5～10g；

试剂C：该试剂为水溶液，且每一升该水溶液中具有冰醋酸3～5mL。

上述试剂盒可用于获取DNA聚丙烯酰胺凝胶染色图片，该DNA聚丙烯酰胺凝胶染色图片具体获取方法包括以下步骤：

(1)取胶：取下PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后的胶板，轻轻揭去具凹槽的玻璃板，保留附着有聚丙烯酰胺凝胶的另一玻璃板；

(2)银染：将附着有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后加入所述的试剂A浸泡；将托盆置于振荡器上，按每分钟30～60次的频率振荡8～15分钟后取出，用水冲洗3～5秒；

(3)显色：将银染后的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后先加入所述的试剂B，再将托盆置于振荡器上，按每分钟10～30次的频率振荡至能清晰观察出凝胶中DNA条带时取出；

(4)终止：将显色后的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后先加入所述的试剂C，再将托盆置于振荡器上，按每分钟30～60次的频率振荡1～2分钟取出，用水冲洗3～5秒；

(5)获取DNA聚丙烯酰胺凝胶染色图片：将经步骤(4)处理后的玻璃板晾干，用扫描仪扫描便获得聚丙烯酰胺凝胶图片。

与现有的技术方案相比，本发明试剂盒具有以下优点：

1、本发明试剂盒中的试剂摈弃了危害人体健康的甲醛。

2、本发明试剂盒的最低可检测极限为7.3pg/μL，灵敏度明显高于现有技术。

附图说明

图1为30份烟草材料PCR扩增产物的DNA聚丙烯酰胺凝胶染色图片，图中，M为DNA标样的电泳条带，1～30为第1～30份烟草材料PCR扩增产物的电泳条带。

图2为30份菜心材料PCR扩增产物的DNA聚丙烯酰胺凝胶染色图片，图中，M为DNA标样的电泳条带，1～30为第1～30份菜心材料PCR扩增产物的电泳条带。

图3为30份大剌鳅材料PCR扩增产物的DNA聚丙烯酰胺凝胶染色图片，图中，M为DNA标样的电泳条带，1～30为第1～30份大剌鳅材料PCR扩增产物的电泳条带。

图4为66份大麦材料PCR扩增产物的DNA聚丙烯酰胺凝胶染色图片，图中，M为DNA标样的电泳条带，1～66为第1～66份大麦材料PCR扩增产物的电泳条带。

图5为DL500DNA标样的DNA聚丙烯酰胺凝胶染色图片，图中，泳道1为DNA标样原液的电泳条带，泳道2～15分别为不同浓度标样原液的电泳条带。

具体实施方式

实施例1

一、建立试剂盒

1、制备试剂A：取硝酸银1g溶解于800L去离子水中，再加入50mL乙醇和3mL冰醋酸，然后加入去离子水定容至1L；

2、制备试剂B：取0.5g氯化钠、2.5g亚硫酸钠、0.1g碳酰肼、10g碳酸钠和8g葡萄糖，加入去离子水定容至1L；

3、制备试剂C：取5mL冰醋酸，加入去离子水定容至1L。

二、获取烟叶材料的DNA聚丙烯酰胺凝胶染色图片

(1)PCR扩增：取30份烟草材料的DNA样品(DNA浓度为10～20ng/μL)作为DNA模板，然后分别用下述引物按常规方法进行PCR扩增，保留每份烟草材料的PCR扩增产物：

正向引物：5'-TCCAGCCTATTCCTTTCTTGTT-3'(SEQ ID No.1)，

反向引物：5'-CCACAAGCAGTATTGGAGCA-3'(SEQ ID No.2)；

(2)凝胶电泳：将每一份烟草材料的PCR扩增产物按常规方法进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得附着有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板；

(3)取胶：取下PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后的胶板，轻轻揭去具凹槽的玻璃板，保留附着有聚丙烯酰胺凝胶的另一玻璃板；

(4)银染：将附着有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后加入上述试剂盒中的试剂A浸泡；将托盆置于振荡器上，按每分钟30次的频率振荡15分钟后取出，用水冲洗3秒；

(5)显色：将银染后的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后先加入上述试剂盒中的试剂B，再将托盆置于振荡器上，按每分钟10次的频率振荡至能清晰观察出凝胶中DNA条带时取出；

(6)终止：将显色后的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后先加入上述试剂盒中的试剂C，再将托盆置于振荡器上，按每分钟30次的频率振荡2分钟取出，用水冲洗3秒；

(7)获取聚丙烯酰胺凝胶染色图片：将经步骤(6)处理后的玻璃板晾干，用BenQ M800扫描仪扫描便获得如图1所示的聚丙烯酰胺凝胶图片。

实施例2

一、建立试剂盒

1、制备试剂A：取硝酸银3g溶解于800L双蒸水中，再加入100mL乙醇和5mL冰醋酸，然后加入双蒸水定容至1L；

2、制备试剂B：取1g氯化钠、0.5g亚硫酸钠、0.3g碳酰肼、2g碳酸钠和10g葡萄糖，加入双蒸水定容至1L；

3、制备试剂C：取3mL冰醋酸，加入双蒸水定容至1L。

二、获取菜心材料的DNA聚丙烯酰胺凝胶染色图片

(1)PCR扩增：取30份菜心材料的DNA样品(DNA浓度为10～20ng/μL)作为DNA模板，然后分别用下述引物按常规方法进行PCR扩增，保留每份菜心材料的PCR扩增产物：

正向引物：5'-CTGCTCGCATTTTTTATCATAC-3'(SEQ ID No.3)，

反向引物：5'-TACGCTTGGGAGAGAAAACTAT-3'(SEQ ID No.4)；

(2)凝胶电泳：将每一份菜心材料的PCR扩增产物按常规方法进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得附着有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板；

(3)取胶：取下PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后的胶板，轻轻揭去具凹槽的玻璃板，保留附着有聚丙烯酰胺凝胶的另一玻璃板；

(4)银染：将附着有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后加入上述试剂盒中的试剂A浸泡；将托盆置于振荡器上，按每分钟45次的频率振荡12分钟后取出，用水冲洗4秒；

(5)显色：将银染后的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后先加入上述试剂盒中的试剂B，再将托盆置于振荡器上，按每分钟20次的频率振荡至能清晰观察出凝胶中DNA条带时取出；

(6)终止：将显色后的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后先加入上述试剂盒中的试剂C，再将托盆置于振荡器上，按每分钟45次的频率振荡1.5分钟取出，用水冲洗4秒；

(7)获取聚丙烯酰胺凝胶染色图片：将经步骤(6)处理后的玻璃板晾干，用BenQ M800扫描仪扫描便获得如图2所示的聚丙烯酰胺凝胶图片。

实施例3

一、建立试剂盒

1、制备试剂A：取硝酸银2g溶解于800L去离子水中，再加入80mL乙醇和4mL冰醋酸，然后加入双蒸水定容至1L；

2、制备试剂B：取0.8g氯化钠、1.5g亚硫酸钠、0.2g碳酰肼、6g碳酸钠和5g葡萄糖，加入双蒸水定容至1L；

3、制备试剂C：取4mL冰醋酸，加入双蒸水定容至1L。

二、获取大剌鳅材料的DNA聚丙烯酰胺凝胶染色图片

(1)PCR扩增：取30份大剌鳅材料的DNA样品(DNA浓度为10～20ng/μL)作为DNA模板，然后分别用下述引物按常规方法进行PCR扩增，保留每份大剌鳅材料的PCR扩增产物：

正向引物：5'-TAATACCAGCACCACCATTT-3'(SEQ ID No.5)，

反向引物：5'-GCTTCATGCAATTAGAGCAG-3'(SEQ ID No.6)；

(2)凝胶电泳：将每一份大剌鳅材料的PCR扩增产物按常规方法进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得附着有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板；

(3)取胶：取下PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后的胶板，轻轻揭去具凹槽的玻璃板，保留附着有聚丙烯酰胺凝胶的另一玻璃板；

(4)银染：将附着有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后加入上述试剂盒中的试剂A浸泡；将托盆置于振荡器上，按每分钟60次的频率振荡15分钟后取出，用水冲洗5秒；

(5)显色：将银染后的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后先加入上述试剂盒中的试剂B，再将托盆置于振荡器上，按每分钟30次的频率振荡至能清晰观察出凝胶中DNA条带时取出；

(6)终止：将显色后的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后先加入上述试剂盒中的试剂C，再将托盆置于振荡器上，按每分钟60次的频率振荡2分钟取出，用水冲洗5秒；

(7)获取聚丙烯酰胺凝胶染色图片：将经步骤(6)处理后的玻璃板晾干，用BenQ M800扫描仪扫描便获得如图3所示的聚丙烯酰胺凝胶图片。

实施例4

一、建立试剂盒

1、制备试剂A：取硝酸银2.5g溶解于800L去离子水中，再加入60mL乙醇和3.5mL冰醋酸，然后加入双蒸水定容至1L；

2、制备试剂B：取0.9g氯化钠、1g亚硫酸钠、0.25g碳酰肼、5g碳酸钠和9g葡萄糖，加入双蒸水定容至1L；

3、制备试剂C：取3mL冰醋酸，加入双蒸水定容至1L。

二、获取大麦材料的DNA聚丙烯酰胺凝胶染色图片

(1)PCR扩增：取66份大麦材料的DNA样品(DNA浓度为10～20ng/μL)作为DNA模板，然后分别用下述引物按常规方法进行PCR扩增，保留66份大麦材料的PCR扩增产物：

正向引物：5'-GAAACCCATCATAGCAGC-3'(SEQ ID No.7)，

反向引物：5'-AAACAGCAGCAAGAGGAG-3'(SEQ ID No.8)；

(2)凝胶电泳：将每一份大麦材料的PCR扩增产物按常规方法进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得附着有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板；

(3)取胶：取下PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后的胶板，轻轻揭去具凹槽的玻璃板，保留附着有聚丙烯酰胺凝胶的另一玻璃板；

(4)银染：将附着有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后加入上述试剂盒中的试剂A浸泡；将托盆置于振荡器上，按每分钟60次的频率振荡15分钟后取出，用水冲洗5秒；

(5)显色：将银染后的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后先加入上述试剂盒中的试剂B，再将托盆置于振荡器上，按每分钟30次的频率振荡至能清晰观察出凝胶中DNA条带时取出；

(6)终止：将显色后的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后先加入上述试剂盒中的试剂C，再将托盆置于振荡器上，按每分钟60次的频率振荡2分钟取出，用水冲洗5秒；

(7)获取聚丙烯酰胺凝胶染色图片：将经步骤(6)处理后的玻璃板晾干，用BenQ M800扫描仪扫描便获得如图4所示的聚丙烯酰胺凝胶图片。

实施例5

本实验使用上述实施例2中的试剂盒。

1、样品

购买日本宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.,Japan)的DL500DNA标样，该标样具50bp、100bp、150bp、200bp、300bp、400bp和500bp 7个DNA标准条带，除200bp标准条带的DNA浓度为30ng/μL外，其余均为10ng/μL。

将DNA标样按2倍梯度依次稀释，即稀释后样品的DNA浓度依次为标样的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1024、1/2048、1/4096、1/8192、1/16384、1/32798。

2、实验方法

(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA标样

选取美国CBS公司MGV-216-33双面三倍宽垂直电泳槽及电泳仪，电泳玻璃板大小为33cm宽×16cm高，采用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA标样；其中所述的聚丙烯酰胺凝胶由质量比为29:1的丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺组成。凝胶厚度为1.5mm，每个载样孔宽2mm；依DNA浓度高低各取1μL样品从左至右上样于6％载样孔中。电泳缓冲液为0.5×TBE缓冲液【45mM Tris-硼酸缓冲液(内含1mM EDTA)；配制方法为称取5.4g Tris碱和2.75g硼酸，吸取2mL0.5M EDTA(pH 8.0)，用双蒸水定容至1L】；电泳条件为：电压120V，电泳时间100min。

(2)银染检测DNA标样

①取胶：取下PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后的胶板，轻轻揭去具凹槽的玻璃板，保留附着有聚丙烯酰胺凝胶的另一玻璃板；

②银染：将附着有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后加入所述的试剂A浸泡；将托盆置于振荡器上，按每分钟50次的频率振荡12分钟后取出，用水冲洗3秒；

③显色：将银染后的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后先加入所述的试剂B，再将托盆置于振荡器上，按每分钟15次的频率振荡至能清晰观察出凝胶中DNA条带时取出，用双蒸水冲洗3秒；

④终止：将显色后的玻璃板放置在托盆中，并使其附着有聚丙烯酰胺凝胶的一面向上，然后先加入所述的试剂C，再将托盆置于振荡器上，按每分钟30次的频率振荡1分钟取出，用水冲洗3秒，置于玻璃架上晾干。

3、实验结果

取出晾干的凝胶，可直接观察DNA标样的条带，并用BenQ M800扫描仪扫描得到如图5所示的聚丙烯酰胺凝胶图片。图中泳道1为DNA标样原液样品，泳道2～15分别为标样原液DNA浓度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1024、1/2048、1/4096、1/8192、1/16384DNA浓度的样品，其中200bp的DNA在泳道13仍清晰可辨，此时DNA的浓度为标样原液的1/2¹²，表明可检测的DNA灵敏度最高可达到30ng/μL×1/4096＝7.3×10^-3ng/μL＝7.3pg/μL；其它标准DNA条带均可观察到泳道11或以上，表明可检测的DNA灵敏度最少可达到10ng/μL×1/1024＝9.8×10^-3ng/μL＝9.8pg/μL；该结果明显高于背景技术中所介绍的An等(2009)和Liang等(2014)建立的利用甲醛开展聚丙烯酰胺银染法检测DNA最高灵敏度分别为27.8pg/μL和97pg/μL的水平。