一种辐照水产干制品的检测方法与流程

本发明涉及水产品检测技术领域，特别涉及一种辐照水产干制品的检测方法。

背景技术：

食品辐照是利用电离辐射(⁶⁰Co或¹³⁷Cs放射源产生的射线、电子加速器产生的低于10MeV电子束或X射线)对食品进行加工处理，利用电离辐射在食品中产生的辐射化学和辐射生物学效益，以达到控制食源性病原体，减少微生物负载和虫害，抑制生理过程和延长货架期的目的。因其具有冷加工处理、无二次污染和化学残留、能耗低等特点，在食品包装材料、粮食、水果等杀虫、灭菌等领域有着广泛的应用。另据研究表明，辐照技术对真菌毒素、农药、渔药等食品污染物也具有一定的抑制和降解作用。由于水产品具有容易腐败、储藏难等缺点，近年来，辐照技术被广泛应用于水产品加工、运输及储存过程中的杀菌保鲜，成为世界上除了香辛料、根茎类植物外主要的辐照处理食品。

辐照食品的潜在安全性问题一直存在争议，不当的辐照会对食品的颜色、味道、营养产生一些副作用，比如脱色、有臭味、破坏蛋白质、脂肪等营养成分。目前，世界各国对辐照食品均持相当严格和谨慎的态度，尤其是辐照食品管理中标识的问题已得到欧盟各国及日、韩等国的重视。目前，美国、英国、德国等国家对食品辐照有比较详细的要求，对于食品种类、辐照剂量、辐照设施、食品辐照的标示都有明确的规定。欧盟有关食品辐照的指令即“离子照射处理的食品”的框架指令1999/2/EC规定，所有经辐照的食品或含有辐照食品成分的必须在食品标签上标明；执行指令1999/3/EC规定在欧盟允许辐照的食品目前只允许辐照处理草药、香料和植物调味料一类物质。

目前，辐照检测方法均建立在对不同种类食品经辐照后产生的特定的衍生物检测的基础上，受方法本身采用的原理所限，每种方法均适用于特定类型的样品。见下表1。

表1不同辐照检测方法比较

含脂食品被辐照时，食品中的脂肪酸和酰基甘油会分解形成相应的同碳原子数2-烷基环丁酮(2-alkylcyclobutanones，2-ACBs)。自发现以来，2-ACBs一直是含脂辐照食品研究的热点。作为含脂食品辐照的标志性化合物，2-ACBs可用来检测含脂辐照食品。但是大部分水产品脂肪含量较低，因此通过检测2-十二烷基环丁酮判定是否经过辐照不适用于辐照水产品的检测。辐照检测的另一种常用方法热释光分析法(TL)可用来检测能分离出矿物质的食品是否经过辐照处理。但是部分水产制品因其加工过程中经过了去内脏、去壳、蒸煮，尤其是多次漂洗，如鱿鱼丝、鱼肉等产品，实际检测过程中很难提取到足够量的矿物质用于检测，热释光分析法在该类产品是否经过辐照检测的应用中有一定的难度；另外该法存在假阴性的问题；其发光曲线无法对辐照剂量进行定量。因此，目前还缺乏针对辐照水产品检测的标准化方法，尤其是辐照剂量定量检测的方法。

苯丙氨酸是带有芳香环的中性氨基酸(见结构式1)，在pH 7.0条件下因羧基端带负电，氨基端带正电而使整个分子呈电中性，其在细胞中可以游离形式或通过肽键结合存在于蛋白质中。食品中的水经辐照后，会生成羟基自由基、氢自由基、氢离子和水合电子，其中羟基自由基会进攻含芳环的苯丙氨酸的邻、间、对位，进而生成三种相应的羟基化合物，即酪氨酸三种异构体-对酪氨酸(p-Tyrosine，结构式2)、邻酪氨酸(o-Tyrosine，结构式4)和间酪氨酸(m-Tyrosine，结构式3)。其中，对酪氨酸较为常见，且在基体本身中均有大量存在。而间位酪氨酸(间-酪氨酸，3-羟基苯丙氨酸或LM-酪氨酸)和邻位酪氨酸(邻-酪氨酸或2-羟基苯丙氨酸)，两者虽自然存在，但皆为罕见，须经由苯丙氨酸的氧化压力条件下进行的非酶自由基羟化而产生。

结构式1 Phenylalanine苯丙氨酸

结构式2 Tyrosine对酪氨酸

结构式3 m-Tyrosine间酪氨酸或3-羟基苯丙氨酸

结构式4 o-Tyrosine邻酪氨酸或2-羟基苯丙氨酸

水产品包括鱼类、甲壳类及和软体动物类含水量丰富，且蛋白质含量在15％-25％之间，其中苯丙氨酸的含量虽在不同水产品中存在一定差异，在蛋白质组成中都占较高的比例。水产品经辐照后会产生o-Tyrosine和m-Tyrosine，因此测定水产品中是否含有o-Tyrosine和m-Tyrosine即可对该产品是否经过辐照进行判定。

目前，国内未见基于QTRAP-UPLC-MS/MS技术，通过将酪氨酸及苯丙氨酸多种同分异构体分离，测定酪氨酸、苯丙氨酸及2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸的含量对辐照水产品鉴别及定量检测的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种辐照水产干制品的检测方法，可同时分离多种氨基酸及其同分异构体，并对其进行定性、定量及二次定性，能判断水产干制品是否经过辐照且对辐照剂量定量，结果可靠、检测限低、适用于辐照水产干制品快速检测。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种辐照水产干制品的检测方法，步骤如下：

一、样品前处理

(1)样品处理：将待测样品粉碎后装入容器内，密封、冷藏备用；

(2)酸解：称取样品0.2g加入20mL酸解玻璃管中，加入10mL 6moL/L盐酸，充氮气后盖紧旋盖，于110℃下酸解过夜得酸解液；

(3)净化：取酸解液用滤纸过滤后，置于玻璃离心管中，4℃下离心，取上清液5mL，35℃下氮气吹干，接着冻干机冻干，用1mL 0.1％甲酸水溶液溶解冻干物，0.22μm水相尼龙滤膜过滤，滤液作为样品液用于2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸的检测；同时，取100μL滤液用0.1％甲酸水溶液定容至1mL得稀释10倍后的样品液用于酪氨酸和苯丙氨酸检测；

二、QTRAP-UPLC-MS/MS检测分析

以酪氨酸、苯丙氨酸以及辐照特异性产物2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸为标准品，将辐照质谱响应值峰面积作为横坐标，对酪氨酸、苯丙氨酸、2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸浓度作为纵坐标，绘制标准曲线；用MRM-IDA-EPI模式，将四种标准物质的二级图谱存入谱库，以便样品与之比对；

将样品液及稀释10倍后的样品液均上机检测，将待测物质的对应离子对与标准图谱进行匹配，以Purity值为判断依据，大于70％认为是同一物质，并对其进行定量；

待测样品含2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸代表接受过辐照处理，并根据标准曲线计算所含2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸的含量；

三、辐照剂量定量检测

以辐照剂量为横坐标，3-羟基苯丙氨酸和2-羟基苯丙氨酸含量为纵坐标绘制标准曲线，将待测样品中3-羟基苯丙氨酸和2-羟基苯丙氨酸的含量代入标准曲线以确定待测样品所接受过的辐照剂量。

因水产品中所含酪氨酸和苯丙氨酸含量较高，因此用稀释10倍后的样品上机对这两种物质进行定量检测及定性确证。虽然检测辐照特异性产物2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸就能判断是否经过辐照并进行进一步定量。但是酪氨酸和苯丙氨酸是2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸的同分异构体，如果不检测这两者并对照，这样直接对于2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸测定会出现假阳性，检测中难以对酪氨酸和苯丙氨酸这两种同分异构体进行区分。因此，同时检测酪氨酸和苯丙氨酸作为比对，能提高检测的精确性。

由于水产干制品中所含游离的3-羟基苯丙氨酸和2-羟基苯丙氨酸较少，因此本发明针对水产干制品设计特定的提取方式，大大提高了酪氨酸、苯丙氨酸、3-羟基苯丙氨酸和2-羟基苯丙氨酸的提取效率，并结合低温高速离心进行净化以及冻干技术，提高了实际检测的灵敏度；且QTRAP-UPLC-MS/MS具有较强的分离能力、定性分析结果可靠、检测限低快速准确等优点，QTRAP-UPLC-MS/MS技术能准确测定高蛋白质含量的水产品中特异性辐照产物3-羟基苯丙氨酸和2-羟基苯丙氨酸的含量并进行二次定性，避免了同分异构体及其它杂峰的干扰，通过不同的已知剂量辐照后的水产品的特异性产物含量进行比较，确定待测样品的所接受过的辐照剂量。本发明适合辐照水产品的定性和定量检测及食品安全监测。

作为优选，QTRAP-UPLC-MS/MS检测分析的色谱参数设置为：

色谱分离条件：Waters Acquity UPLC BEH C18柱，流速0.4mL/min；流动相A：甲醇，流动相B：0.1％甲酸水溶液；进样量：2μL；柱温：35℃；

流动相的梯度洗脱程序为：0-5min，流动相B比例从5％调整到30％，之后5.1min-8min，在13-13.5min内将流动相B比例从30％调整到5％。

作为优选，QTRAP-UPLC-MS/MS检测分析的质谱条件为：离子源Turbo V，电离模式ESI+，采集方式MRM模式，离子化温度550℃；喷雾电压5500V，雾化气55psi，辅助气60psi，气帘气30psi，碰撞气为High；入口电压10v，碰撞室出口电压13v。

作为优选，MRM-IDA-EPI模式参数设置为：IDA触发信号强度阈值5000；EPI条件：扫描速率10000Da/s；扫描范围：50-200Da；Souce/Gas条件同MRM；DP电压80v；碰撞能量35v，碰撞能量谱宽为15。

作为优选，步骤二中，绘制标准曲线时，标准品的浓度梯度设置为：5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、500μg/L，按照标准品的浓度梯度设置对应配制同时含有酪氨酸、苯丙氨酸、2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸的混合标准溶液。同时含有酪氨酸、苯丙氨酸、2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸的混合标准溶液即混合标准溶液中同时酪氨酸、苯丙氨酸、2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸四者的浓度均相同且为标准浓度设计值，如5μg/L或10μg/L。

作为优选，步骤三中，绘制标准曲线的方法具体为：取未经辐照的对照样品，用X光辐照仪分别进行0kGy、1kGy、2kGy、5kGy、10kGy、20kGy剂量的辐照，按照步骤一样品前处理方法进行处理后，用MRM-IDA-EPI模式上机分别检测经不同剂量辐照后的对照样品中的3-羟基苯丙氨酸和2-羟基苯丙氨酸的含量以及二次定性，将辐照剂量做为横坐标，3-羟基苯丙氨酸和2-羟基苯丙氨酸含量作为纵坐标，分别求出回归方程与相关系数并绘制标准曲线。

作为优选，步骤一中，4℃下12000r/min离心10min。

每次测定均采用空白和阳性对照样品。空白对照为阴性样品即未经辐照的同类型水产品作为空白对照，阳性样品为待检样品同类型水产品，如待检样品为单冻虾仁则采用未经辐照的虾仁在X光辐照仪中进行2kGy剂量的辐照，将此辐照后的样品作为阳性样品，作为质控的手段。

本发明的有益效果是：

1、应用范围广。本发明可加强水产品辐照的监控，有利于水产品流通环节及进出口贸易中的监控，减少因水产品辐照所引起的国际贸易争端，减少进出口企业的经济损失。

2、本发明可同时分离多种氨基酸及其同分异构体，并对其进行定性、定量及二次定性。解决了氨基酸同分异构体难分离、难测定的问题。

3、本发明解决了目前没有适用于辐照水产干制品鉴定及检测方法的问题。利用水产品高蛋白质含量，且经过辐照后产生特异性辐照产物3-羟基苯丙氨酸和2-羟基苯丙氨酸的特点，建立了适用于辐照水产干制品鉴定和检测的方法，解决了辐照水产干制品检测无方法可依据的问题。

4、本发明采用了UPLC-MS/MS技术，可在5min内快速完成对氨基酸及同分异构体的分离和定量检测。由于同分异构体具有相同的分子量，且均能产生相同的离子对，必须通过离子对与保留时间相结合的方式来定性和定量。UPLC-MS/MS技术快速有效的解决了同分异构体难分离的问题。

5、本发明采用了MRM-IDA-EPI即MRM触发增强子离子扫描技术，同时得到MRM色谱图及MS²质谱图，通过与标准物质二级谱图的匹配度，对多种同分异构体进行二次定性确证。保留了串联四极杆质谱仪选择性好、敏度高的MRM，同时增强了二级碎片全谱定性，有效解决了同分异构体的定性及易受其他物质干扰的问题。

6、本发明通过第一次标准曲线的制备，辐照特异性产物2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸是否检出即可快速定性判断待测样品是否经过辐照处理。待检样品中如含有2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸，即可判定接受了辐照。方法简单易行，在短时间内即可对待测样品是否经过辐照进行判定。

7、本发明采用测定经不同剂量辐照的样品产生的特异性产物的含量与其所经受的辐照剂量的关系作为标准曲线，通过检测待测样品中3-羟基苯丙氨酸和2-羟基苯丙氨酸的含量确定其接受的辐照剂量。首次实现了辐照食品的定量检测。

8、本发明中选择了2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸作为辐照特异性产物进行测定作为判定是否经过辐照的依据，这两种物质稳定性较好，经辐照处理后的样品在长时间保存后重新测定依旧能检出这两种物质。因此该法可靠性高，尤其冷冻水产品具有长期冻存的特点，本发明同样适用于经长期冷冻或储存后样品的辐照检测。

9、本发明采用了QTRAP-UPLC-MS/MS方法对辐照水产品进行检测，提高了实际检测的灵敏度，且QTRAP-UPLC-MS/MS具有较强的分离能力、定性分析结果可靠、检测限低、二次定性等优点，与传统的检测方法相比，具有更好的利用价值。

10、本发明采用了QTRAP-UPLC-MS/MS方法对辐照水产干制品进行检测，液相色谱-串联质谱仪是目前实验室较通用且常见的检测设备，其在分析测试领域及食品安全控制领域具有广泛的应用和研究前景。其在辐照检测中的应用可避免购置辐照检测的专用仪器设备如热释光检测仪、电子自旋共振仪、光释光测量系统等，该类设备除用于鉴定特定种类的样品是否经过辐照外，如热释光检测仪只用于可分离出硅酸盐的辐照食品的定性检测，在其余领域的应用较少，且该类设备购置成本较高，可选择的仪器品牌少且价格昂贵，极大地增加了实验室的检测成本和运行费用。液相色谱-串联质谱仪在辐照水产品检测中的应用，可避免实验室购置价格昂贵的专用辐照检测设备，提高了仪器的利用效率，大大地减少了检测成本。

11、本发明一次可处理大批样品，适合大批量样品的快速检测。

附图说明

图1是四种氨基酸的MRM图；

图中：1酪氨酸；2.间酪氨酸(m-tyrosine，3-羟基苯丙氨酸)；3.邻酪氨酸(o-tyrosine，2-羟基苯丙氨酸)；4.苯丙氨酸。

图2是四种氨基酸的EPI图；

图中：A酪氨酸(p-tyrosine)；B间酪氨酸(m-tyrosine，3-羟基苯丙氨酸)；C邻酪氨酸(o-tyrosine，2-羟基苯丙氨酸)；D苯丙氨酸(Phenylalanine)。

图3是经辐照后样品MRM图，图中：1酪氨酸；2.间酪氨酸(m-tyrosine，3-羟基苯丙氨酸)；3.邻酪氨酸(o-tyrosine，2-羟基苯丙氨酸)；4.苯丙氨酸。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

一种辐照水产干制品的检测方法，步骤如下：

一、样品前处理

(1)样品处理：将待测样品粉碎后装入容器内，密封、冷藏备用；

(2)酸解：称取样品0.2g加入20mL酸解玻璃管中，加入10mL 6moL/L盐酸，充氮气后盖紧旋盖，于110℃下酸解过夜得酸解液；

(3)净化：取酸解液用滤纸过滤后，置于玻璃离心管中，4℃下12000r/min离心10min，取上清液5mL，35℃下氮气吹干，接着冻干机冻干，用1mL 0.1％甲酸水溶液溶解冻干物，0.22μm水相尼龙滤膜过滤，滤液作为样品液用于2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸的检测；同时，取100μL滤液用0.1％甲酸水溶液定容至1mL得稀释10倍后的样品液用于酪氨酸和苯丙氨酸检测。

二、QTRAP-UPLC-MS/MS检测分析

以酪氨酸、苯丙氨酸以及辐照特异性产物2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸为标准品，将辐照质谱响应值峰面积作为横坐标，对酪氨酸、苯丙氨酸、2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸浓度作为纵坐标，绘制标准曲线，绘制标准曲线时，标准品的浓度梯度设置为：5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、500μg/L，按照标准品的浓度梯度设置对应配制同时含有酪氨酸、苯丙氨酸、2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸的混合标准溶液。

用MRM-IDA-EPI模式，将四种标准物质的二级图谱存入谱库，以便样品与之比对；

将样品液及稀释10倍后的样品液均上机检测，将待测物质的对应离子对与标准图谱进行匹配，以Purity值为判断依据，大于70％认为是同一物质，并对其进行定量；

待测样品含2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸代表接受过辐照处理，并根据标准曲线计算所含2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸的含量。

色谱参数设置为：

色谱分离条件：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(100mm*2.1mm，1.7μm)，流速0.4mL/min；流动相A：甲醇，流动相B：0.1％甲酸水溶液；进样量：2μL；柱温：35℃。

流动相的梯度洗脱程序为：0-5min，流动相B比例从5％调整到30％，之后5.1min-8min，在13-13.5min内将流动相B比例从30％调整到5％。

质谱条件为：离子源Turbo V，电离模式ESI+，采集方式MRM模式，离子化温度(TEM)550℃；喷雾电压5500V，雾化气(GS1)55psi，辅助气(GS2)60psi，气帘气(CUR)30psi，碰撞气(CAD)为High；入口电压(EP)10v，碰撞室出口电压(CXP)13v。各化合物的具体采集参数见表2。

表2优化的质谱条件参数

采用MRM-IDA-EPI模式监测。MRM触发增强子离子扫描IDA-EPI条件：IDA触发信号强度阈值5000；EPI条件：扫描速率(Scan rate)10000Da/s；扫描范围：50-200Da；Souce/Gas条件同MRM；DP电压80v；碰撞能量(CE)35v，碰撞能量谱宽(CES)为15。

三、辐照剂量定量检测

以辐照剂量为横坐标，3-羟基苯丙氨酸和2-羟基苯丙氨酸含量为纵坐标绘制标准曲线，绘制标准曲线的方法具体为：取未经辐照的对照样品，用X光辐照仪分别进行0kGy、1kGy、2kGy、5kGy、10kGy、20kGy剂量的辐照，按照步骤一样品前处理方法进行处理后，用MRM-IDA-EPI模式上机分别检测经不同剂量辐照后的对照样品中的3-羟基苯丙氨酸和2-羟基苯丙氨酸的含量以及二次定性，将辐照剂量做为横坐标，3-羟基苯丙氨酸和2-羟基苯丙氨酸含量作为纵坐标，分别求出回归方程与相关系数并绘制标准曲线。将待测样品中3-羟基苯丙氨酸和2-羟基苯丙氨酸的含量代入标准曲线以确定待测样品所接受过的辐照剂量。

实际样品检测：

鱿鱼丝(干制品)是否经过辐照以及辐照剂量的定量检测。

1、样品处理：将鱿鱼丝充分混匀并搅碎，装入容器内，密封、冷藏备用；

2、酸解：称取样品0.2g(精确至0.01g)，于20mL酸解玻璃管中，加入10mL 6moL/L盐酸，充氮气后盖紧旋盖，于110℃下酸解过夜。

3、净化：取酸解液用滤纸过滤后，置于玻璃离心管中，4℃温度下，12000r/min离心10min。

4、取上清液5mL，35℃下氮气吹干，接着冻干机冻干，用1mL 0.1％(v/v)甲酸水溶液溶解冻干物，用0.22μm水相尼龙滤膜过滤。取100μL滤液用0.1％(v/v)甲酸水溶液定容至1mL即稀释10倍用于酪氨酸和苯丙氨酸检测，剩余滤液(未稀释)作为样品液用于2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸的检测。两个浓度的样品均上机待测。

5、将步骤4处理后的样液用QTRAP-UPLC-MS/MS条件分析，采用MRM-IDA-EPI模式监测。

色谱分离条件：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(100mm*2.1mm，1.7μm)，流速0.4mL/min；流动相A：甲醇，流动相B：0.1％(v/v)甲酸水溶液；进样量：2μL；柱温：35℃。

液相流动相的梯度洗脱程序为：0-5min，流动相B比例从5％调整到30％，之后从5.1min-8min之间13-13.5min内将流动相B比例从30％调整到5％，对色谱柱进行冲洗，结束整个检测流程。

采用质谱条件：离子源Turbo V，电离模式ESI⁺，采集方式MRM模式，离子化温度(TEM)550℃；喷雾电压5500V，雾化气(GS1)55psi，辅助气(GS2)60psi，气帘气(CUR)30psi，碰撞气(CAD)为High；入口电压(EP)10v，碰撞室出口电压(CXP)13v。各化合物的具体采集参数见上面表2。

采用MRM-IDA-EPI模式监测。MRM触发增强子离子扫描IDA-EPI条件：

a.IDA触发信号强度阈值5000；

b.EPI条件：扫描速率(Scan rate)10000Da/s；扫描范围：50-200Da；Souce/Gas条件同MRM；DP电压80v；碰撞能量(CE)35v，碰撞能量谱宽(CES)为15。

6、质量控制实验。分别取未经辐照过及经7kGy辐照后的干制鱿鱼丝样品，与待测样品一起进行前处理，按照步骤5中QTRAP-UPLC-MS/MS条件测定，并根据结果，判断整个检测过程中的实验准确性，避免假阳性或者假阴性等检测结果。

7、将辐照质谱响应值峰面积作为横坐标，对酪氨酸、苯丙氨酸、2-羟基苯丙氨酸和3-羟基苯丙氨酸浓度作为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线的制备同实施例。在10-500μg/L范围内分别得到对酪氨酸(p-tyrosine)的线性回归方程为Y＝1.10986e⁶x+5.2e³，r＝0.9987；邻酪氨酸(o-tyrosine，2-羟基苯丙氨酸)Y＝7.95756e⁶x+7.6e³，r＝0.9995；和间酪氨酸(m-tyrosine，3-羟基苯丙氨酸)Y＝1.10049e⁶x+3.2e³；苯丙氨酸(Phenylalanine)的线性回归方程为Y＝7.77349e⁶x+2.5e⁴，r＝0.9990；式中X表示相应的化合物浓度，Y表示质谱响应值峰面积。标准溶液的质谱图及EPI图分别见图1和图2，并将二级质谱图存入谱库。

8、该产品是否经过辐照的判定：该鱿鱼丝样品中及用于质控的辐照样品中发现辐照特异性产物间酪氨酸(m-tyrosine，3-羟基苯丙氨酸)和邻酪氨酸(o-tyrosine，2-羟基苯丙氨酸)，鱿鱼丝样品实验结果见图3，并将EPI二级质谱图结果与谱库做比对。相似程度主要以Purity为主要判断依据，大于70％可认为是同一物质。鱿鱼丝样品中间酪氨酸(m-tyrosine)和邻酪氨酸(o-tyrosine)的EPI图与谱库中相对应的标准图谱相似程度Purity值分别为93.253％和92.825％。因此，可判定该鱿鱼丝样品经过辐照处理。

9、辐照剂量测定的标准曲线的制备。取未经辐照的鱿鱼丝样品，用X光辐照仪分别进行0kGy、1kGy、2kGy、5kGy、10kGy、20kGy剂量的辐照。样品前处理同步骤1-4，QTRAP-UPLC-MS/MS条件下分析，采用MRM-IDA-EPI模式监测同步骤5。上机检测并用步骤7中的标准曲线计算出经不同剂量辐照后鱿鱼丝样品中的间酪氨酸(m-tyrosine)和邻酪氨酸(o-tyrosine)的含量。根据辐照剂量和含量的对应关系，在1-20kGy剂量的范围内得到辐照剂量与间酪氨酸(m-tyrosine)含量的拟合多项式为Y＝-0.0016+0.03112x-0.0002x²，r＝0.98；辐照剂量与邻酪氨酸(o-tyrosine)含量的线性回归方程为Y＝-0.0224+0.09718x-0.0009x²，r＝0.98；将X为辐照剂量(kGy)，Y为相应化合物含量(mg/kg)。

10、待测样品检测结果。鱿鱼丝样品根据步骤7中的标准曲线测得含对酪氨酸1.31g/kg、间酪氨酸(m-tyrosine，3-羟基苯丙氨酸)0.022mg/kg和邻酪氨酸(o-tyrosine，2-羟基苯丙氨酸)0.528mg/kg、苯丙氨酸(Phenylalanine)1.704g/kg。根据间酪氨酸(m-tyrosine)和邻酪氨酸(o-tyrosine)的含量，依据步骤9中的第二个标准曲线，可确定被检测鱿鱼丝所接受过的辐照剂量为6kGy。

11、回收率实验：精密称取样品1.0g，定量加入标准品，使添加量相当于20、50、100μg/L间酪氨酸(m-tyrosine)和邻酪氨酸(o-tyrosine)，测定加标回收率。回收率＝样品实测浓度/样品理论浓度×100％。结果表明，平均回收率在81.3％～105.1％，相对标准偏差(n＝6)在8.45％以下，符合定量分析的要求。以3倍信噪比(S/N)计算检出限为3μg/L，间酪氨酸(m-tyrosine)和邻酪氨酸(o-tyrosine)浓度达5.0μg/L，20μL上样，以10倍信噪比(S/N)计算间酪氨酸(m-tyrosine，3-羟基苯丙氨酸)和邻酪氨酸(o-tyrosine，2-羟基苯丙氨酸)的定量下限为10μg/kg，能满足食品安全的检测需要。

上述实验结果证明，本方法在5-500μg/L范围内线性良好，相关系数在0.99以上，检出限为3μg/L，定量限为10μg/L，基质加标的回收率在81.3％以上。用QTRAP-UPLC-MS/MS测定水产干制品中的辐照特异性产物，具有较好的回收率和提取效率。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。