用于分析颗粒的方法与流程

本发明涉及对存在于液体中，特别是体液、例如血液中的颗粒进行计数和识别的领域。

背景技术：

体液、特别是血液中可能含有颗粒、例如细胞，知道其类型和数量是有用的。

例如，对于血液，全血细胞计数或全血检查通常是在医学实验室进行的检验。这种类型的检验允许识别血液的主要成分(特别是红细胞、白细胞或血小板)及其数量。这些检查通常使用高性能自动化装置进行，但是正在研究比较便宜同时允许获得相当性能水平的更简单的方法。

研究所寻求的途径之一就是使用简单的光学方法，例如无透镜成像。2000年底以来，通过无透镜成像观察生物颗粒已经有一定的发展。该技术在于将样本放置在光源和矩阵阵列光电检测器或图像传感器之间。由光电检测器捕获的图像通过由光源产生的入射波和由构成样本的颗粒衍射的波之间的干涉形成。该图像通常称为“全息图”。因此，对于每个颗粒，可以在传感器上记录其特定的衍射图案。适用于生物样本的这种技术已经在文献wo2008090330中描述。然后可以通过将其产生的衍射图案和事先建立的衍射图案相比较并且与已知颗粒相对应来对每个颗粒进行简单分析。然而，随着颗粒浓度增加，这种方法可能达到极限。

具体地，仅基于由图像传感器检测到的衍射图案对颗粒进行计数和识别随着样本中颗粒浓度的增加而达到一定的极限。尤其是，当样本是血液且颗粒是每μl超过100000个颗粒的红细胞时，计数不再可靠，如在2010年6月1日，analchem，seosungjyu的“high-throughputlensfreebloodanalysisonachip”的出版物中所报道的。可以应用称为数字全息重建技术的数学技术以构建样本中存在的每个颗粒的所谓复合图像。这种类型的技术在于将光波反向传播到颗粒位于其中的物体平面，所述物体平面位于距成像器的已知距离处。上述出版物表明，这样的全息重建允许对样本中的高浓度红细胞进行计数。该出版物报道，在重建的复合图像中，事先经过标记的白细胞具有与红细胞不同的特征。

文献us2014/0327944还描述了基于全息图、通过对由图像传感器获得的全息图与模拟的全息图的库进行比较来对颗粒、例如血液颗粒进行分类的方法。然而，这种方法也有相同的限制，即当粒子密度高时变得难以实施。

在文献us2012/0148141和wo2014/012031中也描述了允许重建细胞(在该情况下是精子)的复合图像的方法。然而，这些方法允许从重建的复合图像估计所述细胞的特性及其路径。文献us2009/0290156也是如此，其描述了基于所述颗粒的复合图像来分类颗粒以及跟踪所述颗粒的路径。样本的复合图像可能不足以识别颗粒。

寻求可以应用于颗粒浓度高的样本的、用于识别颗粒、特别是血细胞的方法。此外，该方法还具有大的观察范围并且易于实施，同时特别是避免需要事先标记颗粒。此外，该方法必须允许容易在体液中发现的颗粒被可靠地区分，所述颗粒特别是红细胞、白细胞和血小板。

此外，寻求一种不需要精确了解颗粒和光电检测器之间的距离的方法。

技术实现要素：

为应对该问题，本发明提供了一种用于识别样本中存在的颗粒的方法，所述样本是例如生物液体、比如血液的样本，该方法包括以下步骤：

-使用光源照射所述样本，所述光源产生沿着传播轴线向样本传播的入射光波；

-使用矩阵阵列光电检测器获取样本的图像，所述样本置于所述光源和所述光电检测器之间使得矩阵阵列光电检测器暴露于光波，所述光波包含入射光波与由每个颗粒产生的衍射波之间的干涉；

所述方法特征在于，其还包括以下步骤：

-确定所述颗粒在与矩阵阵列光电检测器所在平面平行的平面中的位置；

-对所述获取的图像应用数字重建算法，以便在距离所述矩阵阵列光电检测器的多个重建距离处估计矩阵阵列光电检测器所暴露于的所述光波的至少一个特征量；

-确定表示所述特征量沿着与所述传播轴线平行并通过所述位置的轴线随所述重建距离的变化的曲线；

-根据所述曲线识别颗粒。

通过应用数字重建算法意味着通常以卷积乘积的形式将传播算子应用于图像。

特征量可以通过在每个重建距离处估计矩阵阵列光电检测器所暴露于的光波的复数表达式来获得。

特征量可以由所述复数表达式的模来确定，在这种情况下，其表示检测器暴露于的所述光波的幅度。

特征量可以根据所述复数表达式的幅角来确定，在这种情况下，其表示矩阵阵列光电检测器所暴露于的所述光波的相位。

根据一个实施方案，所述方法包括：

-通过对由矩阵阵列光电检测器获取的图像应用数字重建算法来确定称为参考复合图像的复合图像；

-在距离所述矩阵阵列光电检测器的多个重建距离处，根据所述参考复合图像估计矩阵阵列光电检测器所暴露于的光波的至少一个特征量。

然后，所述方法可以包括：

-将传播算子应用于参考复合图像，以便针对距重建平面或矩阵阵列光电探测器所在的平面的多个距离，计算所谓二次复合图像；

-从每个二次复合图像确定在所述距离的每一处的特征量。

所述参考复合图像可以是在远离样本平面的重建平面中形成的复合图像。它也可以是在检测平面中形成的复合图像。

可以通过将所述特征量的变化与在学习阶段确定的参考曲线进行比较来实现所述识别。

可以使用由光电检测器获取的图像或使用光电检测器所暴露于的光波的复数表达式来确定每个颗粒在平行于矩阵阵列光电检测器平面的平面中的位置。

光源优选为空间相干光源，例如发光二极管，在这种情况下，优选在光源和样本之间放置空间滤波器。所述光源可以是时间相干光源，例如激光二极管。

矩阵阵列光电检测器包括能够收集光电检测器暴露于的波的像素的矩阵阵列。像素和样本之间的距离可以为50μm至2cm，优选为100μm至5mm。优选地，不将样本放置成与光电检测器的像素直接接触。

优选地，在样本和矩阵阵列光电检测器之间不放置放大光学元件。

特别地，样本可以包括血细胞。在这种情况下，可以在白细胞、红细胞或血小板的细胞系中识别颗粒。

本发明的另一主题是一种用于识别颗粒的装置，所述颗粒包含在样本中，所述装置包括：

-光源，其被布置成在所述样本的方向沿着传播轴线产生入射光波；

-固定器，用于将样本固定在所述光源和矩阵阵列光电检测器之间；

-矩阵阵列光电检测器，其被布置成获取样本的图像，能够暴露于由所述入射光波与由所述颗粒形成的衍射波之间的干涉引起的光波；

其特征在于，该装置包括被配置为实施以下操作的处理器，例如微处理器或电子计算机：

-确定所述颗粒在与矩阵阵列光电检测器的平面平行的平面中的位置；

-对所述获取的图像应用数字重建算法，以便在距离所述矩阵阵列光电检测器的多个重建距离处估计矩阵阵列光电检测器所暴露于的所述光波的至少一个特征量；

-确定表示所述特征量沿着与所述传播轴线平行并通过所述位置的轴线随所述重建距离的变化的曲线；

-根据所述曲线识别颗粒。

优选地，所述装置在矩阵阵列光电检测器和被分析的样本之间不包括放大光学元件。

处理器可以包括或连接到可编程的存储器，其包括允许执行上述步骤的一系列指令。

特别地，其能够：

-在每个重建距离处确定检测器所暴露于的光辐射的复数表达式；

-通过确定所述复数幅值的模或幅角，估计在每个重建距离处的所述特征量。

附图说明

图1示出根据本发明的一个实施方案的装置。

图2a示出由矩阵阵列光电检测器获取的图像。

图2b示出根据第一实施例，对于各种类型的颗粒，光电检测器所暴露于的光波的特征量、称为互补幅度随相对于光电检测器的距离变化的曲线。

图3a示出根据该第一实施例，对于各种白细胞，光电检测器所暴露于的光波的特征量、称为互补幅度随相对于光电检测器的距离变化的曲线。

图3b示出根据该第一实施例，对于各种红细胞，光电检测器所暴露于的光波的特征量、称为互补幅度随相对于光电检测器的距离变化的曲线。

图4a示出根据该第一实施例，由光电检测器获取的图像的感兴趣区域，其以血小板聚集群为中心。

图4b示出对于形成图4a示出的集群的部分的各种血小板，光电检测器所暴露于的光波的特征量、称为互补幅度的曲线。

图5a示出根据第二实施例，对于各种类型的颗粒，光电检测器所暴露于的光波的特征量、称为互补幅度随相对于光电检测器的距离变化的曲线。

图5b示出根据第二实施例，对于各种类型的颗粒，光电检测器所暴露于的光波的相位随相对于光电检测器的距离z变化的曲线。

图6a示出根据第三实施例，对于各种类型的颗粒，光电检测器所暴露于的光波的特征量、称为互补幅度随相对于光电检测器的距离变化的曲线。

图6b示出根据第三实施例，对于各种类型的颗粒，光电检测器所暴露于的光波的相位随相对于光电检测器的距离变化的曲线。

图7a、7b和7c分别示出根据第一、第二和第三实施例，光电检测器所暴露于的光波的复合特征量随距离变化的曲线。

图8a、8b、8c和8d分别示出：

-允许在重建平面中计算的样本的复合图像、称为参考复合图像的方法；

-由矩阵阵列光电检测器获取的全息图；

-在图8a所示的方法的多次迭代之后重建的图像、称为参考复合图像的表示；

-基于由参考复合图像形成的二次复合图像获得的曲线。

图9a是由图像传感器获取的全息图，样本包括分散在水溶液中的红细胞。图9b和9c分别示出称为参考图像的复合图像的模和相位，该复合图像在重建平面中形成。图9d和9e是分别示出图像传感器所暴露于的光波的模和相位沿着穿过红细胞的传播轴线的变化的曲线。

具体实施方式

图1示出作为本发明的一个主题的装置的实施例。光源11能够沿着传播轴线z在样本14的方向上产生被称为入射光波的光波12。样本14包括介质10，例如生物液体，其包括期望在预设类型的颗粒之间识别的颗粒1、2、3、4、5、...、9。

颗粒可以是细胞。特别地，当介质10是血液或包含血液的溶液时，颗粒可以是红细胞、白细胞或血小板。

颗粒也可以是有机或无机微珠，例如金属微珠或聚合物或玻璃的微珠，这种类型的微珠通常在实施生物方法时被使用。颗粒也可以是浸入介质10中的液滴，例如脂滴。其也可以是微生物、例如细菌或酵母，或外来体。通常，颗粒的尺寸有利地小于1mm，甚至小于500μm，优选为0.5μm至500μm的尺寸。因此，术语颗粒是指最初存在于被检测样本中的内源性颗粒和在分析之前添加到该样本中的外源性颗粒。

介质10最通常地是液体介质，特别是体液，但其也可以是琼脂、或空气、或液体的干残留物。

作为本发明的一个主题的方法允许识别每个观察到的颗粒。识别是将颗粒分类成预定类型的颗粒。其可以是确定颗粒在预设性质中的性质、或者确定颗粒在预设性质中的大小的问题。

光源和样本之间的距离δ优选大于1cm。其优选为2至30cm。优选地，从样本的角度看，光源可以认为是点状的。这意味着，其直径(或其对角线)优选为小于样本和光源之间的距离的十分之一，更好的是小于样本和光源之间的距离的百分之一。因此，光以平面波的形式、或可以认为是平面波的波的形式到达样本。

光源11可以是点光源，或与隔板或空间滤波器(图1中未示出)相关联以便呈现点状。隔板的孔径通常为5μm至1mm，优选为50μm至500μm。

隔板可以由光纤代替，光纤的第一端面向光源放置，其第二端面向样本放置。在这种情况下，所述第二端可以比作点光源11。

样本14由包括基座15和盖13的室所限定。该室的侧壁没有示出。在所考虑的实施例中，所述室是neubauerc-芯片流体室。基座15和盖13之间的距离为100μm。通常，室的沿着传播轴线z的厚度小于几厘米，例如小于1cm，甚至小于1mm，例如为50μm至500μm。

光源11可以是时间相干的，但这不是必需的。

在该第一实施例中，光源是以450nm的波长发光的激光二极管。其位于距样本15cm的距离处。

样本14放置在光源11和矩阵阵列光电检测器或图像传感器16之间。后者优选平行地或基本上平行地延伸到包围样本的室的基座15。

表述“基本平行地”意味着两个元件可以不是严格平行的，几度、小于10°的角度公差是可接受的。

优选地，光源具有小的光谱宽度，例如光谱宽度小于100nm或甚至小于20nm，甚至优选小于5nm。表述“光谱宽度”表示在光源发射峰的半最大值处的全宽。

光电检测器16可以是矩阵阵列光电检测器，其包括ccd或cmos像素的矩阵阵列。cmos光电检测器是优选的，因为像素的尺寸较小，这允许更有利于获取的图像的空间分辨率。在该实施例中，检测器是参考mt9p031的12位aptina传感器，其是rgbcmos传感器，其像素间间距为2.2μm。光电检测器的有用面积是5.7×4.3mm²。

光电检测器位于优选垂直于入射光波12的传播轴线z的检测平面p中。

优选地，光电检测器包括像素的矩阵阵列，其上方放置有透明保护窗。像素的矩阵阵列与保护窗之间的距离通常为几十μm至150或200μm。为了提高图像的空间分辨率，光电检测器的像素间间距优选小于3μm。

在该实施例中，颗粒1、2、...9与光电检测器16的像素的矩阵阵列之间的距离d等于1.5mm。然而，其可能根据所使用的流体室的厚度而波动。通常，无论哪种实施方案，颗粒与光电检测器的像素之间的距离d优选为50μm至2cm，优选为100μm至2mm。

注意到矩阵阵列光电检测器16和样本14之间不存在放大光学元件。这不妨碍聚焦微透镜可选地与光电检测器16的每个像素保持同一水平。

在该第一实施例中，样本是根据常规方法获得的白细胞富血浆，在6％右旋糖苷(sigmaaldrich参考d4876)的存在下在alsever溶液中沉淀红细胞后，收集血小板富血浆和白细胞富血浆。然后将所获得的血浆在生理ph的磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液中稀释。红细胞的消耗是不完全的，所获得的富血浆含有残留的红细胞。

颗粒可以分为多种类型的颗粒，特别是红细胞、白细胞或血小板。优选地，颗粒预先没有经过标记。

图2a示出由光电检测器16所获得的图像。该图像示出总衍射图案，其中可以看到基本衍射图案，每个基本衍射图案与相应的颗粒相关联。每个基本衍射图案包括中心的圆盘形区域，深和浅的同心圆围绕其交替延伸。这种基本图案允许选择待识别的颗粒，以及确定在检测平面p中所述颗粒的径向坐标(x,y)。这些坐标例如是与所述颗粒对应的基本衍射图案的中心。

每个基本衍射图案是由样本上游的源11产生的入射光波12与由颗粒的入射波的衍射所产生的波之间的干涉形成的。因此，光电检测器16暴露于由以下叠加形成的光波22：

-由样本14上游的源11发射的光波12；

-由样本14中存在的每个颗粒或其它衍射元素衍射的光波。

处理器20(例如微处理器)接收矩阵阵列光电检测器16的图像，并沿着传播轴线z执行矩阵阵列光电检测器所暴露于的光波22的特征量的重建。微处理器20连接到能够存储用于实施本申请中所描述的计算步骤的指令的存储器23。其可以连接到屏幕25。特别地，在矩阵阵列光电检测器和观察到的样本之间形成重建。

处理器20能够执行存储在存储器中的一系列指令，以便实施识别方法的步骤。处理器可以是微处理器或能够处理矩阵阵列光电检测器传送的图像的任何其它电子计算机，以便执行本说明书中描述的一个或更多个步骤。

由矩阵阵列光电检测器获取的图像i，其图像如图2a所示，表示光波22的强度i(x,y)的空间分布，x和y是光电检测器的平面p中的坐标。

根据众所周知的数字全息重建原理，其在ryle等人的“digitalin-lineholographyofbiologicalspecimens”，proc.ofspie第6311卷(2006)中描述，可以通过确定由光电检测器测量的强度i(x,y)和传播算子h(x,y,z)的卷积乘积来重建在空间坐标(x,y,z)任何点处的、特别是在位于距光电检测器距离|z|的平面中的光波22的复数表达式u(x,y,z)。

传播算子h(x,y,z)的功能是描述光电检测器16和坐标(x,y,z)点之间的光的传播。然后可以确定该光波在该距离|z|、称为重建距离处的幅度u(x,y,z)和相位其中：

-u(x,y,z)＝abs[u(x,y,z)]；

运算符abs和arg分别返回模和幅角。

特别地，传播算子的应用允许在光电检测器上游、距光电检测器距离|z|处估计复数表达式。由此，在光波22到达所述检测器之前，光波22的复合值被重建。然后，说到反向传播。如果坐标z＝0被认为是检测平面p，则该反向传播通过应用传播算子h(x,y,-|z|)实施。术语“上游”和“下游”理解为相对于入射波12的传播方向。

如果i(x,y)＝i(x,y,z＝0)对应于由光电检测器测量的信号强度，则在检测平面p中，所测量的强度i(x,y)和的光波的复数表达式u(x,y)之间的关系表示为：i(x,y)＝|u(x,y)|²。

在坐标(x,y,z)处，光波(22)的复数表达式表示为：

符号*代表卷积运算符。

其中：

-在由检测平面p所描绘的且包括样本14的半空间中，z<0；

-在由检测平面p所描绘且不包括样本14的半空间中，z>0。

在由检测平面p所描绘的且包括样本14的半空间中，光波的复数表达式也可以写为：

优选地，在全息重建之前，将数学预处理事先应用于所测量的强度i(x,y)。这允许尤其是通过减少当应用传播算子时所产生的伪影的数量来改善结果的质量。

因此，确定称为归一化强度的强度使得

其中

-i(x,y)＝在坐标(x,y)处通过光电检测器测量的强度；

-average(i)＝在图像i的感兴趣区域中测量的强度的平均值，所述区域包括所述坐标(x,y)。该感兴趣区域可以对应于通过光电检测器形成的整个图像。

该预处理将入射光波(12)的强度等同于所测量的强度的归一化，入射光波(12)的强度通过算子average(i)估计。

接着，波(22)的复数表达式使用上文说明的等式由归一化强度来确定。

数字重建可以特别地基于菲涅耳衍射模型。在该实施例中，传播算子是菲涅耳-亥姆霍兹函数，使得：

其中λ是波长。

因此，

其中

-x′和y′是光电检测器平面中的坐标；

-x和y是重建平面中的坐标，重建平面位于距光电检测器的距离|z|处；

-z是重建图像沿着入射光波(12)的传播轴线z的坐标。

由复数表达式u(x,y,z)的值，可以提取源11发射的入射光波12的、由颗粒(1、2、...、9)引起的衍射产生的光波22的特征量。如上文所描述，可以求幅度u(x,y,z)或相位的值，但也可以求幅度或相位的任何函数的值。

例如，可以求称为互补幅度的特征量的值，使得：

从每个重建复数表达式u(x,y,z)，可以形成：

-在平行于检测器的平面、距离检测器的平面|z|处的平面中，波22的幅度的图像uz，其中uz(x,y)＝abs[u(x,y,z)]；

-在平行于检测器的平面、距离检测器的平面|z|处的平面中，波22的相位的图像其中

-在平行于检测器的平面、距离检测器的平面|z|处的平面中，例如如上所述的波22的互补幅度的图像其中

在该第一实施例中，

-互补幅度的图像在沿着传播轴线z的多个坐标z1…zm处被重建，m等于21；

-由每个图像其中1≤m≤m，提取值(xn,yn)表示在平行于光电检测器16平面的平面中的颗粒n的坐标；

-通过事先在确定的两个量和之间插值来获得(xn,yn,z)的不同值，其中zm<z<zm＝+1。

在平行于光电检测器16平面的平面中，每个被检查的颗粒n的坐标(xn,yn)使用所获取的图像i(x,y)或由在给定重建高度z处的图像来确定。

图2b示出，对于各种类型的颗粒，例如如上定义的互补幅度对于9种不同颗粒随重建距离|z|的变化：

-颗粒1至4：白细胞，由首字母缩写词wbc标示；

-颗粒5和6：红细胞，由首字母缩写词rbc标示；

-颗粒7至9：血小板，由字母plt标示。

重建距离|z|在zmin＝1000和zmax＝1500μm之间变化。

与这些操作类似地，在显微镜下观察每个颗粒(1、…、9)，在显微镜下观察所得作为参考测量，允许获得无可争议的识别。

在该实施例中所研究的样本中，可以看出：

-对于颗粒1至4，其为白细胞wbc，表示互补幅度随重建距离变化的曲线具有比幅度阈值低的最小值，然后向着基线bl增加，这种增长有明显的振荡；

-对于颗粒5和6，其对应于红细胞rbc，曲线具有基线bl和幅度阈值之间的最小值，然后是向基线bl的单调增加；

-对于颗粒7至9，其对应于血小板plt，曲线遵循基线bl并且仍然限于两个值bl±ε之间。

因此，对于每个检测到的颗粒n，其在与检测器平面平行的平面中的位置是(xn,yn)，可以建立曲线其表示在多个重建高度z处的互补幅度的变化，并且可以使用该曲线来识别颗粒是红细胞、白细胞还是血小板。

特别地，该曲线可以与在用已知颗粒在学习阶段产生的曲线库比较。换句话说，曲线表示互补幅度沿着传播轴线z(坐标z的轴)的变化，其形成观察到的颗粒的类型的信号。

与现有技术相比，不是通过从距样本预定距离处进行全息重建形成颗粒的复合图像，而是沿着入射波的传播方向在距光电检测器多个距离处重建由具有入射波12的颗粒衍射所产生的波22的特征。所获得的信息更加丰富，并允许在各种类型的颗粒之间的清晰分类。

图3a和3b示出检测器所暴露于的波22的互补幅度曲线所述曲线分别是针对50个白细胞wbc和240个红细胞rbc获取的。曲线的重复性足以允许基于颗粒的鲁棒分类。这些曲线在与上述实施例类似的实验条件下获得的。

用于获得图3a所示测量值的样本是类似于参照图2a和2b所描述的样本的富血浆。

用于获得图3b所示测量值的样本包括在如上所述的磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液中以1/400的稀释因子稀释的全部血液。

图4b示出在如上所述的类型的富血浆的实施例中、对于4个血小板101、102、103、104沿着轴线z所获得的互补幅度的曲线显微镜下的观察示出血小板101、102、103和104是聚集的。

图4a示出通过光电检测器16获取的图像i的感兴趣区域。其示出待识别聚集群的每个血小板的坐标(x101,y101)、(x102,y102)、(x103,y103)、(x104,y104)。

在与第一实施例类似的实验条件下获得这些曲线。可以看出，无论血小板聚集或不聚集，曲线是相似的，并且限于基线bl，在间隔bl±ε内。因此，利用作为本发明一个主题的识别方法，即使血小板聚集，其也能被正确地识别。

在第二实施例中，光源11是耦接到以波长λ＝485nm为中心的485-df-22omega光学滤波器的白色发光二极管，并且其半极大处全宽度为22nm。光源和检测器之间的距离δ等于8cm。样本是如上所述的富血浆。

在该实施例中，波22的复数表达式u(x,y,z)在距检测器多个距离z处被重建，然后，在各种颗粒的坐标(x,y)处，确定辐射的互补幅度和相位。然后建立随z变化的互补幅度和相位的曲线和

与前述实施例一样，通过在显微镜下观察来证实观察到的颗粒的性质。

图5a和5b分别示出对于各种颗粒的、随距离z变化的互补幅度和相位图5a示出：

-对于对应于白细胞wbc的颗粒，表示互补幅度随重建距离变化的曲线具有比幅度阈值低的经标记的最小值，然后向着基线bl增加，该增加具有经标记的振荡；

-对于对应于红细胞rbc的颗粒，曲线具有在基线bl和幅度阈值之间的最小值，然后所述曲线描述向基线bl的单调增加；

-对于对应于血小板plt的颗粒，曲线遵循基线bl并且保持限于两个值bl±ε之间。

因此，对于每个检测到的颗粒n，其在平行于检测器平面的平面中的位置是(xn,yn)，可以建立曲线其表示在多个重建高度z处，检测器暴露于的波22的如上所述的互补幅度并且可以使用该曲线来分类所述颗粒是红细胞rbc、白细胞wbc或血小板plt。

因此用除了激光源之外的光源进行分类是可能的。

图5b示出：

-对于对应于白细胞wbc的颗粒，表示相位随重建距离z变化的曲线具有比第一相位阈值高的最大值，然后是比第二相位阈值低的最小值，接着是向着基线bl的增加；

-对于对应于红细胞rbc的颗粒，曲线具有比所述第一相位阈值高的最大值，然后是比第二相位阈值高的最小值，然后所述曲线描述向着基线bl的单调增加；

-对于对应于血小板plt的颗粒，表示相位随重建距离变化的曲线保持限于两个值和之间。测量值保持在所述第一和第二相位阈值之间。

因此，对于每个检测到的颗粒n，其在与检测器平面平行的平面中的位置是(xn,yn)，可以建立表示在多个重建高度z处、检测器所暴露于的辐射的相位变化的曲线并且可以使用该曲线来分类颗粒是是红细胞、白细胞或血小板。

在第三实施例中，光源11是耦接到以波长λ＝610nm为中心的610-df-20omega光学滤波器的白色发光二极管，且其半极大处全宽度为20nm，所述光源置于距样本距离δ＝8cm处。操作模式和样本类似于前述实施例中的那些。

图6a和6b分别示出不同颗粒的随距离z变化的互补幅度和相位图6a示出：

-对于对应于白细胞wbc的颗粒，表示幅度u随重建距离z变化的曲线具有比互补幅度阈值低的经标记的最小值，然后向着基线bl增加，该增加含有经标记的振荡；

-对于对应于红细胞rbc的颗粒，曲线具有在基线bl和幅度阈值之间的最小值，然后所述曲线描述向基线bl的单调增加；

-对于对应于血小板plt的颗粒，曲线遵循基线bl并且保持限于两个值bl±ε之间。

因此，如上所述，对于每个检测到的颗粒n，其在平行于检测器平面的平面中的位置是(xn,yn)，可以建立曲线其表示在多个重建高度z处，检测器暴露于的辐射的互补幅度变化，并且可以使用该曲线来分类所述颗粒是红细胞rbc、白细胞wbc或血小板plt。

图6b示出：

-对于对应于白细胞wbc的颗粒，表示相位随重建距离z变化的曲线具有比第一相位阈值高的最大值，然后是比第二相位阈值低的最小值，接着是向着基线bl的增加；

-对于对应于红细胞rbc的颗粒，曲线具有比所述第一相位阈值高的最大值，然后是比第二相位阈值高的最小值，然后所述曲线描述向着基线bl的单调增加；

-对于对应于血小板plt的颗粒，表示相位随重建距离变化的曲线保持限于两个值和之间。测量值保持在所述第一和第二相位阈值之间。

前述两个实施例示出互补幅度曲线或相位曲线允许颗粒被表征。

也可以使用所谓的复合光学参数、符号k，以比例的形式组合互补幅度和相位，例如：

图7a、7b和7c示出在第一实施例(405nm激光源)、第二实施例(白色led光源与以λ＝485nm为中心的滤波器的组合)和第三实施例(白色led光源与以λ＝610nm为中心的滤波器的组合)的配置中，沿着传播轴线z的所述复合光学参数的变化。在每个配置中，观察到的样本是如上所述的富血浆。

在每个图中，经分析的颗粒是3个白细胞(wbc)和1个红细胞(rbc)。

可以看出，无论那种源，白细胞的曲线k(z)的波动大于红细胞的曲线k(z)的波动。

特别地，可以确定第一复合阈值kthreshold¹和第二复合阈值kthreshold²，使得当曲线k(z)保持在低于第一复合阈值kthreshold¹且高于第二复合阈值kthreshold²时，经分析的颗粒是红细胞。当曲线与这些阈值中的一个交叉，所检查的颗粒被识别为白细胞。

对于由矩阵阵列光电检测器16所获取的图像i或全息图，应用数字传播算子h可能具有一定的限制，因为所获取的图像不包括与相位相关联的信息。因此，在建立曲线前，优选地获得与光电检测器16所暴露于的光波22的相位相关联的信息。该与相位相关联的信息可以使用现有技术所描述的方法通过重建样本14的复合图像uz获得，以便获得矩阵阵列光电检测器16的平面p中的光波22的幅度和相位的估计，或者获得位于距矩阵阵列光电检测器16为距离|z|的重建平面pz中的光波22的幅度和相位的估计。本发明人已开发了基于参考复合图像的计算的方法，参考图8a描述了该方法。该方法包括以下步骤：

-用矩阵阵列光电检测器16获取样本14的图像i，该图像形成全息图(步骤100)。

-在重建平面pz或检测平面p中计算称为样本14的参考图像uref的复合图像，该参考复合图像包括关于矩阵阵列光电检测器16所暴露于的光波22的相位和幅度的信息；该步骤通过将如上所述的传播算子h应用于所获取的图像i(步骤110至170)来执行。该复合图像称为参考图像，因为基于其形成表征颗粒的曲线。

-使用参考复合图像uref或由光电检测器16所获取的图像i来选择颗粒在检测平面或平行于检测平面的平面中的径向位置(x,y)(步骤180)。

-沿着传播轴线z将传播算子h应用于参考复合图像uref以便计算称为二级图像的复合图像uref,z(步骤185)。

-由每个二级复合图像uref,z，在预先选择的颗粒的径向位置(x,y)处以及在距重建平面pz(或检测平面p)的多个距离处估计光波22的特征量，然后形成表示所述特征量沿着传播轴线z变化的曲线(步骤190)。

-根据所述曲线表征颗粒。如上所述，可以通过将所获得的曲线与在校准阶段中使用标准样本所获得的标准曲线进行比较来实现该表征(步骤200)。

图8a中给出的算法详述如下，在某些步骤中获得的结果在图8b至8d中示出。步骤110至170是获得表示为uref的参考复合图像的优选方式，该图像表示波22在重建平面pz中的复数表达式的空间分布。本领域技术人员将理解，其他算法允许重建这样的复合图像，例如也可以想到使用现有技术提及的算法。

步骤100：图像获取。

在该步骤中，图像传感器16获取样本14的图像i，更准确地，由样本14发射的、图像传感器暴露于的光波22。这种图像或全息图示于图8b中。

该图像使用浸入盐水缓冲液中的包含红细胞的样本14产生，该样本包含在距离cmos传感器1500μm的距离d的100μm厚的流动室中，如上文所述的装置中。

步骤110：初始化。

在该步骤中，由图像传感器16所获取的图像i定义样本14的初始图像该步骤是下面参照步骤120至180所描述的迭代算法的初始化，指数k表示每次迭代的阶。初始图像的模可以通过将平方根算子应用于由图像传感器获得的图像i来获得，在这种情况下在该实施例中，图像i通过表示入射到样本14上的光波12的强度的项来归一化。所述项例如可以是图像i的平均值的平方根，在这种情况下所获取的图像的每个像素i(x,y)被所述平均值除，使得

初始图像的相位或认为在每个像素(x,y)中是0，或预设为任意的值。特别地，初始图像直接来自于由矩阵阵列光电检测器16所获得的图像i。然后，后者不包括与通过样本14传输的光波22的相位相关联的信息，图像传感器16仅对该光波的强度敏感。

步骤120：传播。

在该步骤中，通过应用如上所述的传播算子，将在样本平面中获得的图像传播至重建平面pz，以便获得在重建平面pz中表示样本14的复合图像所述传播通过图像和传播算子h-z的卷积来进行，使得：

符号*表示卷积运算符。下标–z表示传播在与传播轴线z的方向相反的方向上进行，称为反向传播。

在第一迭代(k＝1)中，是步骤110中所确定的初始图像。在之后的迭代中，是在上一迭代中更新的检测平面p中的复合图像。

重建平面pz是远离检测平面p的平面，优选地平行于检测平面。优选地，重建平面pz是样本14位于的平面p14。特别地，在该平面中重建的图像允许获得通常高的空间分辨率。重建平面也可以是另一个平面，其位于距检测平面的非零距离处，优选平行于检测平面，例如位于矩阵阵列光电检测器16和样本14之间的平面。

步骤130：计算多个像素中的指标。

在该步骤中，计算与复合图像的多个像素(x,y)的每个像素相关联的量∈^k(x,y)，优选在这些像素中的每个中。在所计算的像素(x,y)中，该量取决于图像的值或其模。其也可以取决于该像素中的图像的维度导数，例如该图像的维度导数的模。

在该实施例中，与每个像素相关联的量ε^k(x,y)是每个像素中的图像和值1之间的差的模。这种量可以使用以下表达式表示：

步骤140：建立与图像相关联的噪声指标。

在步骤130中，在复合图像的多个像素中计算了量ε^k(x,y)。这些量可以形成向量e^k，其项是与每个像素(x,y)相关联的量ε^k(x,y)。在该步骤中，根据向量e^k的范数计算称为噪声指标的指标。通常，阶与范数有关，使得坐标(x1,x2,....xn,)的维数n的向量x的阶p的范数‖x‖p为：其中p≤0。

在这种情况下，使用1阶的范数，换句话说p＝1。具体地，发明人估计1阶的或者低于或等于1阶的范数特别适用于如下所述的这种样本。

在该步骤中，将在复合图像的每个像素(x,y)中由复合图像计算的量ε^k(x,y)相加以便形成与复合图像相关联的噪声指标ε^k。

因此，ε^k＝∑(x,y)ε^k(x,y)。

因为使用了1阶的或者低于或等于1阶的范数，噪声指标ε^k的值随着复合图像变得越来越类似样本而降低。具体地，在第一迭代中，粗略估计图像的每个像素(x,y)中的相位的值。然后，如现有技术中所提到的，将样本从检测平面p传播到重建平面pz伴随着大量的重建噪声。该重建噪声采用重建图像中的波动的形式。由于这些波动，随着重建图像中重建噪声的贡献增加，如上定义的噪声指标ε^k的值增加。具体地，重建噪声引起的波动会增加该指标的值。

该步骤的重要方面在于在检测平面p中确定样本的图像的每个像素的相位值这允许在随后的迭代中获得的重构图像其指标ε^k+1低于指标ε^k。

在第一迭代中，如上所述，仅关于光波22的强度的相关信息可得到，而关于其相位的相关信息不可得到。因此，由于没有关于检测平面p中的光波22的相位的相关信息，在重建平面pz中重建的第一图像受到大量重建噪声的影响。因此，指标ε^k＝1是高的。在随后的迭代中，算法在检测平面p中逐渐调整相位以便使指标ε^k逐渐最小化。

从光波22的强度及其相位的角度来看，检测平面中的图像表示在检测平面p中的光波22，步骤120至160旨在迭代地建立图像的每个像素的相位的值，其最小化指标ε^k，指标ε^k是通过将图像传播到重建平面pz而获得的图像所获得的。

最小化算法可以是梯度下降算法或共轭梯度下降算法，后者在下文中描述。

步骤150：调整检测平面中的相位值。

步骤150旨在确定复合图像的每个像素的相位的值，以便在下一个迭代k+1中最小化指标ε^k+1，其由复合图像传播到重建平面pz而产生。为此，建立相位向量其每一项是复合图像的像素(x,y)的相位该向量的维数是(npix,1)，其中npix是所讨论的像素数。在每个迭代中，使用以下更新表达式来更新该向量：

其中：

-α^k是整数，称为“步长”，表示距离；

-p^k是维数(npix,1)的方向向量，其每一项p(x,y)形成指标ε^k的梯度的方向。

该表达式可以表达为如下的向量形式：

其可以示为：

其中：

-是维数(npix,1)的梯度向量，其每一项表示指标ε^k随作为问题的未知数的每个自由度的变化，即向量的项；

-p^k-1是在上一次迭代中建立的方向向量；

-β^k是应用于方向向量p^k-1的比例因子。

梯度向量的每一项▽ε^k(x,y)为

其中im是返回操作数虚部的算子，r′是检测平面中的坐标(x,y)。

比例因子β^k可以表示为：

步长α^k可以根据迭代变化，例如第一次迭代中的0.03至最后一次迭代的0.0005。

更新等式允许调整待获得的向量这导致复合图像的每个像素中的相位的迭代更新。然后用与每个像素相关联的相位的这些新值更新检测平面中的该复合图像将注意到的是，不修改复合图像的模，复合图像是由矩阵阵列光电检测器16所获取的图像确定的，使得

步骤160：重复或退出算法。

假设没有达到收敛标准，则步骤160在步骤150中更新的复合图像的基础上重复步骤120至160的新迭代以重复算法。收敛标准可以是迭代的预定数k、或者指标的梯度的最小值、或两个连续相位向量之间的被认为可忽略的差值。当达到收敛标准时，该估计被认为是在检测平面p或重建平面pz中的样本的复合图像的正确估计。

步骤170：获得参考复合图像。

在最后一次迭代结束时，该方法可以包括将从最后一次迭代得到的复合图像传播到重建平面pz，以获得参考复合图像替代地，参考复合图像uref是由检测平面p中的最后一次迭代产生的复数图像当颗粒密度高时，该替代不太有利，因为检测平面p中的空间分辨率比在重建平面pz中低，特别是当重建平面pz对应于样本14所在的平面p14时。

图8c示出在8次迭代之后在重建平面pz中获得的参考复合图像的每个像素的模的图像。该图像的空间分辨率允许良好的识别每个颗粒的径向坐标(x,y)。

步骤180：选择颗粒径向坐标。

在该步骤中，从参考图像例如从其模或从其相位的图像中选择颗粒的径向坐标(x,y)。如上所述，表述径向坐标表示在检测平面或重建平面中的坐标。也可以设想基于全息图i0或者基于最后一次迭代后的检测平面中获得的复合图像来进行选择。然而，当颗粒数增加时，优选地在重建平面中形成的图像上进行选择，这是由于其更好的空间分辨率，特别是当重建平面pz对应于样本p14的平面时。在图8c中，示出颗粒的选择，其被虚线围绕。

步骤185：应用传播算子。

在该步骤185中，使用如上所述的传播算子h将参考复合图像uref传播到多个重建距离，以便获得在距检测平面p或重建平面pz不同距离处的多个所谓的二级复合图像uref,z。因此，该步骤包括确定多个复合图像uref,z，使得：

uref,z＝uref*hz其中zmin≤z≤zmax。

值zmin和zmax是沿着轴线z传播参考复合图像的最小和最大坐标。优选地，在样本14和图像传感器16之间的多个坐标z处重建复合图像。可以在样本14的任一侧上形成复合图像。

通过将全息重建算子h应用于参考图像uref建立这些二次复合图像。参考图像uref是在步骤120至160的迭代之后，正确描述图像传感器所暴露于的光波22的、特别是其相位的复合图像。因此，二次图像uref,z形成沿着传播轴线z传播光波22的良好的描述符。

步骤190：形成曲线

在该步骤中，从每个二级复合图像uref,z确定如上所述的光波22的特征量，以便限定表示所述特征量沿着传播轴线z的变化的曲线。特征量可以例如是模或相位，或其组合。图8d示出光波22的相位沿着传播轴线z的变化。

步骤200：表征

然后可以由上一步骤中形成的曲线来表征颗粒。优选地，存在使用已知的标准样本在学习阶段形成的标准曲线的数据库。在标准曲线的基础上，通过比较或分类所形成的曲线来进行表征。

该实施方案已经在包括红细胞的样本上进行了测试。另一实施例如图9a至9e所示。在这些实施例中，样本包括稀释在包含稀释至1/400的磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液的水溶液中的红细胞。将样本14放置在100μm厚的流体室15中，该室位于与上述发光二极管的距离为8cm处，所述发光二极管的光谱带以450nm为中心。将样本放置在距上述cmos图像传感器1.5mm的距离处。空间滤波器18的孔径尺寸为150μm。

图9a示出由图像传感器获取的图像i。在图9b和9c中示出在样本的平面p10中重建的复合图像的模和相位的图像。这些图像在8次迭代中获得。

图像形成如上所述应用传播算子h的参考图像uref，以便获得沿着传播轴线z的多个二级复合图像aref,z。此外，在参考图像的模图像或相位图像中，识别出红细胞，红细胞在这些图像的每一个中被虚线围绕。提取该红细胞的径向坐标(x,y)。由二级复合图像aref,z，形成表示模的曲线u(z)和表示到达图像传感器16的光波22的相位的曲线通过确定所述径向坐标处的相应二级图像的模和相位来获得曲线的每个点的值。图9d和9e分别示出如此选择的红细胞的模和相位的曲线。在坐标zmin＝1000μm与zmax＝2000μm之间确定曲线，z方向步长为5μm。重建平面位于距检测平面1380μm处，对应于图9d和9e中的横坐标76。

所描述的方法不限于血液，并且可以应用于其它体液，例如尿液、脑脊髓液、骨髓等。此外，该方法可以应用于非体液，特别是用于分析在水或任何其他水溶液中的污染物或毒素。

该方法还适用于放置在非液体介质中的颗粒的检测和识别，例如琼脂或体液的干残余物，例如引起在载玻片上大量沉积干血的血液涂片。在后者的情况下，颗粒通过干残留物或空气彼此分离。

此外，如上所述，颗粒可以是内源性的(例如血液颗粒)或外源性的(微珠、液滴)。

上述实施例提供了基于随重建距离变化的特征量的曲线的变化以及基于与预定阈值比较的简单识别标准。标准的有效性与在其中放置颗粒的介质以及样本的制备方法有关。其他标准可以适用于经历不同制备方法的颗粒。因此，对于给定类型的样本，可以在包括已知颗粒的标准样本上进行的学习阶段来定义识别标准。

此外，在不脱离本发明范围的情况下，可以实施更复杂和更鲁棒的其他分类方法。