用于淋巴血液疾病的预后方法与流程

本发明涉及一种用于淋巴血液疾病，尤其淋巴性白血病和淋巴瘤的预后方法。

单克隆抗体已彻底改变大量病理中的治疗护理，所述病理包括癌症和免疫疾病。利妥昔单抗(rituximab)已例如使改善患有淋巴瘤或慢性淋巴性白血病患者的存活率和患有免疫疾病患者的生活品质成为可能。

利妥昔单抗是由b淋巴细胞从幼淋巴细胞阶段到浆细胞阶段表达的嵌合免疫球蛋白igg1识别cd20。已描述体外利妥昔单抗的不同作用机制，一些作用机制取决于其可变部分fv(细胞凋亡)，其它作用机制取决于其恒定部分fc(adcc、cdc、吞噬作用)。fcγriiia由自然杀伤细胞(nk细胞)和巨噬细胞、具有抗体依赖性细胞的细胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity，adcc)的效应细胞表达。

已经证明，导致取代(fcγriiia-158vf)受体上氨基酸158的fcgr3a基因的多态性使得有可能在对利妥昔单抗反应良好(158-v纯合子)的患者与并未同样反应(158-f纯合子和异合子)的患者之间区分。

具体来说，从专利申请wo2003035904已知，个体fcgr3a基因型的测定可用于患有恶性肿瘤、尤其淋巴瘤的患者，并且适合于选择最佳反应个体和/或调节用于用低反应曲线反应的个体的治疗条件或方案。

然而，活体内抗cd20的作用机制仍了解不多并且可能基于病理而不同。此外，重要的是应注意通过fcγriiia-158vf多态性分析预测功效目前并未临床上使用，因为67％具有不利表型的患者仍对利妥昔单抗起反应。因此，有兴趣更好地理解作用机制以便提出用于改善治疗的新策略，而且更好地选择可能不对此类型昂贵治疗起反应的患者以便使其转向其它治疗替代方案。

免疫细胞包括分泌白介素-10(il-10)的b淋巴细胞(b10细胞)，所述白介素-10为一种尤其用于限制细胞毒性t反应的免疫调节细胞因子。这些细胞存在于小鼠和人类中。肿瘤b淋巴细胞可具有b10功能，即分泌il-10。

已经证明在小鼠淋巴瘤模型中，小鼠中b10的频率干扰对使用小鼠抗cd20的治疗的反应(horikawa等人《临床调查杂志(jclininvest.)》2011年11月1日；121(11)：4268-4280)。然而，人类中b10细胞的频率尚未联系到用抗cd20抗体治疗的患者的治疗反应，因为研究在小鼠中进行。此外，不同免疫球蛋白同种型的生物活性以及在免疫球蛋白的fc部分处受体的表达在人类与小鼠之间极其不同。在小鼠到人类中获得的结果的外推因此为不可能的，并且在无临床证明下在任何情况下在小鼠模型中获得的结果均不适用于人类。

理解对免疫疗法的反应仍存在，并且有必要具有使得治疗有可能适应患者的元素。

本发明的一个目标为抵消这些缺点。

本发明的另一目标为提供一种预后方法，其能够实现快速并轻易确定欲在给定病理情况下应用的治疗方案，考虑成功的可能性并且以便限制与治疗失败相关的成本。

本发明的又一目标为提供一种使得有可能进行所述方法的预后试剂盒。

本发明涉及一种用于在取自患有血液疾病的患者的肿瘤样品中由治疗抗体介导的治疗反应的体外预后方法，

所述抗体是耗尽所述血液疾病细胞的抗体，

所述方法包含体外测定在所述肿瘤样品中分泌白介素10的b淋巴细胞的数量，

使得获取肿瘤样品的患者在使用所述治疗抗体治疗之后将具有50％机率经历超过90％的所述血液疾病的细胞的耗尽，所述肿瘤样品具有低于所述样品的总细胞数量的5％的分泌il-10的b细胞的数量。

本发明基于本发明人得到的出人意料的观测结果：一方面，前述血液疾病具有一群分泌il-10的b细胞；并且另一方面，如果使用治疗抗体治疗患者，那么这些细胞的数量影响其预后。此外，本发明人已注意到，在治疗之前细胞分泌il-10的数量越低，对治疗的反应将会更好，并且因此患者的预后将会更好。

具体来说，本发明人已能够证明如果细胞分泌il-10的数量低于血液疾病的循环细胞总数的5％，那么在治疗之后患者的预后在超过一半情况下将为有利的。

在本发明的情形下，“来自患有血液疾病的患者的肿瘤样品”是指血液样品或活检，其中所有或一部分样品或活检样品包含肿瘤细胞。前述肿瘤样品获自开始治疗之前的患者，从而寻求根除血液疾病。

不考虑红细胞、无核细胞。

根据本发明的预后方法涉及治疗抗体或更通常而言“抗体”。除非另外规定，否则下文将使用两种名称。“治疗抗体”是指其功能为消除个体或患者中所确定靶细胞的抗体。靶细胞的实例是肿瘤细胞、由一种或多种病毒感染的细胞、涉及过敏、自体免疫疾病等的病理免疫活性细胞(例如，b或t淋巴细胞、抗原呈递细胞等)或甚至正常细胞(在抗血管生成治疗策略中的内皮细胞情况下)。优选的靶细胞是肿瘤细胞和受感染细胞。

具有同型igg1的治疗抗体如利妥昔单抗可以介导抗体依赖性细胞的细胞毒性或adcc，以及抗体依赖性细胞的吞噬作用或adpc，和互补依赖性细胞毒性或cdc，溶解。

根据本发明的治疗抗体可以通过杂交瘤或基因工程制造，并有利地具有同型igg1或igg3。在本发明中优选的治疗抗体是具有对抗肿瘤抗原(在肿瘤表面上表达的分子)(如cd20、cd22、cd25、cd38)或更通常而言造血肿瘤抗原，优选淋巴的前述同型的抗体。

“耗尽”抗体在本发明中是指能够引起靶细胞耗尽，即其减少或耗尽的抗体。

本发明的预后是基于能够分泌白介素10或il-10的肿瘤b细胞的数量的测定。il-10通过抑制某些细胞因子，如白介素2、白介素3、tnf和某些干扰素的产生对免疫反应造成抑制影响。il-10也通过调节涉及免疫系统的不同细胞(肥大细胞、淋巴细胞等)的数量作用于免疫。

通过定量血液疾病中b淋巴细胞分泌il-10的数量，本发明人已观测到在治疗之前具有少于5％这些细胞的肿瘤对使用治疗抗体的治疗更好地起反应，这引起患者的更好预后。随后可能考虑基于此治疗抗体单独或与其它方案(化疗、辐射等)组合的用于患者的疗法。超过5％b淋巴细胞分泌il-10的临限值，用单一治疗抗体治疗的患者的预后将可能并不十分良好，并且因此推荐考虑另一种更加适当的治疗方案。

因此，本发明的预后使得有可能确定使用治疗抗体治疗的成功的可能性，并且确定提供给患者的最佳疗法，同时精简成本，避免向反应不良或完全不反应的患者提供繁琐和昂贵的治疗。

有利地，本发明涉及前述预后方法，其进一步包含测定如序列seqidno：1所示的fcγriiia受体的序列的位置176中的氨基酸；或如序列seqidno：2所示的fcγriiia受体的序列的位置158中的氨基酸，

使得从其中采取肿瘤样品的以下患者，

-在如序列seqidno：1所示的fcγriiia受体的序列的位置176中，或在如序列seqidno：2所示的fcγriiia受体的序列的位置158中具有缬氨酸，并且

-在治疗之前在样品中具有低于总样品细胞5％的分泌il-10的b细胞数量

在使用所述治疗抗体治疗之后将具有超过50％机率经历超过90％所述血液疾病细胞的耗尽。

换句话说，本发明涉及一种用于在取自患有血液疾病的患者的肿瘤样品中由治疗抗体介导的治疗反应的体外预后方法，所述抗体是耗尽所述血液疾病细胞的抗体，所述方法包含在所述样品的细胞中体外测定：

-在如序列seqidno：1所示的fcγriiia受体的序列的位置176中，或在如序列seqidno：2所示的fcγriiia受体的序列的位置158中的氨基酸，和

-在治疗之前的分泌白介素10的b淋巴细胞的数量，

使得采取肿瘤样品的患者，

-在如序列seqidno：1所示的fcγriiia受体的序列的位置176中，或在如序列seqidno：2所示的fcγriiia受体的序列的位置158中具有缬氨酸，并且

-在样品中具有低于总样品细胞5％的分泌il-10的b细胞数量

在使用所述治疗抗体治疗之后将具有超过50％机率经历超过90％所述血液疾病细胞的耗尽。

本发明人已得到第二个出人意料的观测结果：如果结合b淋巴细胞分泌il-10数量的测定与fcγriiia受体的特定多态性测定，那么患者的预后将因此显著改善。

实际上，如以下实例所示，fcγriiia受体的仅多态性的测定并未使得有可能具有足够信息以预测患者对使用治疗抗体的治疗的正确反应。

fcγriiia受体的多态性已描述于目前先进技术和尤其国际申请wo2003035904中。取决于已经历修饰的在蛋白质的位置176中或在成熟蛋白质的位置158中的氨基酸是苯丙氨酸(f)或缬氨酸(v)，对治疗抗体的治疗反应将不同。

在本发明中，由序列seqidno：1组成的蛋白质对应于fcγriiia蛋白质，并且由序列seqidno：2组成的蛋白质对应于成熟fcγriiia蛋白质。

人类是二倍体，因此关于此多态性存在三种可能基因型：176v/v(或158v/v)、176v/f(或158v/f)和176f/f(或158f/f)。

在前述方法的情形下，认为在fcgr3a基因的其两种等位基因上的位置176或158中具有缬氨酸的个体或患者是v/v纯合患者。因此，在fcγriiia受体的176(158)位置为v/v纯合的并且在治疗之前具有相对于肿瘤总细胞低于5％的b淋巴细胞分泌il-10含量的患者将具有超过50％机率对使用治疗抗体的治疗反应良好，并且在治疗之后具有超过90％的肿瘤细胞的耗尽。

分泌il-10的b细胞的含量低于肿瘤中总细胞数量的5％为有利的。这意味着细胞分泌il-10的4.9％、4.8％、4.7％、4.6％、4.5％、4.4％、4.3％、4.2％、4.1％、4％、3.9％、3.8％、3.7％、3.6％、3.5％、3.4％、3.3％、3.2％、3.1％、3％、2.9％、2.8％、2.7％、2.6％、2.5％、2.4％、2.3％、2.2％、2.1％、2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％的重叠特别有利。

有利地，本发明涉及前述预后方法，其中血液疾病是其细胞表达cd20表面标记物，即其肿瘤细胞表达cd20表面标记物的血液疾病。

cd20是已使用单克隆抗体鉴别的用于人类b淋巴细胞的第一分化抗原。其为历经其从b前阶段到成熟b淋巴细胞阶段的发展过程的b细胞的特异性标记物。然而其从浆细胞表面遗失。编码基因位于染色体11。cd20属于包含cd20的分子、ige的高亲和力受体的β链和存在于淋巴和骨髓造血细胞表面上的htm4分子并且其功能未知的家族。

在一个有利实施例中，本发明涉及前述预后方法，其中血液疾病选自以下：b细胞慢性淋巴细胞白血病(chroniclymphoidleukemia，cll)、弥漫性大b细胞淋巴瘤和所有这些表达cd20的组织学变体、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴性组织(mucosa-associatedlymphoidtissue，malt)淋巴瘤、伯基特(burkitt)淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦病(disease)、b细胞前淋巴细胞性白血病和所有不可分类型cd20+b细胞淋巴瘤。

因此，有利地，本发明涉及一种在取自患有慢性淋巴性白血病的患者的肿瘤样品中通过治疗抗体介导用于治疗反应的体外预后方法。

在一个有利实施例中，本发明涉及一种如上定义的预后方法，其中在激活il-10的分泌之后样品中分泌il-10的b细胞的数量通过通量细胞计量术测量，或通过测量血清中的循环il-10含量。

尽管存在用于测定肿瘤样品中分泌il-10的b细胞的数量的若干方式，但本发明的有利方法由通过通量细胞计量术的检测组成。

为此，将从患者中分离的有核细胞放置在培养物中并用刺激il-10分泌的化合物治疗。随后可能测定培养基中所分泌的il-10的数量，鉴于刺激为人工的，所述数量并非良好的定量信息，或进行分泌阻断步骤，使得所产生的il-10在分泌b细胞中隔离。随后可以使用il-10抗体标记细胞并通过通量细胞计量术定量。在下文实例中给定实验细节。

本发明人也已展示患有如上所定义的血液疾病的患者的肿瘤中分泌il-10的b细胞的数量与在所述患者的血浆中循环的il-10的数量之间存在相关性(也参见下文实例)。因此，通过血清中il-10的简单分析，有可能至少更加近似地确定患者中分泌il-10的b细胞的比例。

在另一有利实施例中，本发明涉及前述预后方法，其中如序列seqidno：1所示的fcγriiia受体的序列的位置176中的氨基酸；或如序列seqidno：2所示的fcγriiia受体的序列的位置158中的氨基酸的体外测定使用常规方法和特异性寡核苷酸(引物)通过聚合酶链反应(polymerasechainreaction，pcr)，如pcr，pcr与逆转录结合(rt-pcr)或嵌套式pcr进行。

编码fcγriiia受体的基因的基因分型可以通过包含分析核酸或蛋白质的不同技术进行。分析可以通过限制酶的特异性消化、杂交或有利地扩增/分离/排序进行。甚至可能考虑测定和识别来自rna的多态性。描述于申请wo2003035904中的技术比照适用。

在使用扩增反应，如pcr技术的情形下，用作引物的寡核苷酸将优选地为包含50个核苷酸、有利地约30个核苷酸、优选地17到25个核苷酸的单链寡核苷酸。寡核苷酸优选地具有与待扩增的标靶序列严格互补的至少5个或甚至至少8个核苷酸，和尤其所述寡核苷酸的位置3′中的核苷酸。为确定有利的寡核苷酸，所属领域的技术人员可能使用可在数据库存取、尤其在基因银行资料库中的编号al590385下的人类fcgr3a基因的序列，或在编号nm_000569下可在基因银行资料库中存取的互补dna的序列。

判定根据本发明的预后的尤其有利核苷酸是由序列seqidno：3、seqidno：4和seqidno：5表示的寡核苷酸。

当然，本发明不限于这些特定寡核苷酸，并且所属领域的技术人员能够设想其它特定寡核苷酸。

在又一有利实施例中，本发明涉及前述方法，其中治疗抗体是免疫球蛋白igg1或igg3、尤其cd20抗体、尤其利妥昔单抗。

用于本发明方法的情形下的治疗抗体因此有利地是cd20抗体和尤其利妥昔单抗。在此配置中，本发明方法有利地旨在提出一种用于使用这些抗体治疗b细胞慢性淋巴性白血病或b细胞淋巴瘤的患者的反应预后。

利妥昔单抗是对抗cd20表面分子的嵌合单株抗体。利妥昔单抗的可变部分结合到b淋巴细胞的cd20抗原，并且其恒定部分fc可以产生引起这些淋巴细胞溶解的免疫效应子功能。由效应子诱导的细胞溶解的可能机制是涉及c1q片段结合的互补依赖性细胞毒性(complementdependentcytotoxicity，cdc)、经历一个或若干个粒细胞、巨噬细胞和nk细胞表面的fcγ受体的抗体依赖性细胞毒性(antibodydependentcellularcytotoxicity，adcc)和也经历与粒细胞、巨噬细胞表面的fcγ受体相互作用的吞噬作用(或adpc)。也已表明利妥昔单抗通过与b淋巴细胞的cd20抗原结合通过细胞凋亡造成细胞死亡。

因此，在此有利方面中，本发明涉及一种在取自患有慢性淋巴性白血病或b细胞淋巴瘤的患者的肿瘤样品中，由具有同型igg1或igg3的cd20治疗抗体介导的用于治疗反应的体外预后方法，所述方法包含体外测定所述样品的细胞，所述样品：

-在如序列seqidno：1所示的fcγriiia受体的序列的位置176中，或在如序列seqidno：2所示的fcγriiia受体的序列的位置158中具有氨基酸，并且

-具有一定数量分泌白介素10的b淋巴细胞，

使得从其中采取肿瘤样品的以下患者，

-在如序列seqidno：1所示的fcγriiia受体的序列的位置176中，或在如序列seqidno：2所示的fcγriiia受体的序列的位置158中具有缬氨酸，并且

-在样品中具有低于总样品细胞5％的分泌il-10的b细胞数量

在用所述cd20治疗抗体治疗之后将具有超过50％机率经历超过90％的所述白血病或所述淋巴瘤细胞的耗尽。

在另一方面中，本发明涉及一种用于体外预后可以用治疗抗体治疗患有血液疾病的患者，尤其用于预后慢性淋巴性白血病或b细胞淋巴瘤的试剂盒，其包含：

-用于检测如序列seqidno：1所示的fcγriiia受体的序列的位置176中的氨基酸；或如序列seqidno：2所示的fcγriiia受体的序列的位置158中的氨基酸的构件；

-用于测定分泌il-10的b淋巴细胞的数量的构件，和

-一个或若干个对照样品。

根据本发明的预后试剂盒提供用于测量前述方法必不可少的两个参数：受体的多态性和分泌il-10的b细胞的数量的构件。为使预后标准化，试剂盒也含有对应于取自健康个体(阴性对照)和/或具有不良预后的患病个体(阳性对照)和/或已诊断具有不良预后的个体(阳性对照)的样品的对照样品。

这一或这些对照样品还可以为允许校准通量细胞仪以测定分泌il-10的b细胞数量的物理媒体上的指示或计算机数据。

如上文提到，用于检测分泌il-10的b细胞数量的构件可以为用于通过通量细胞计量术评估细胞的抗体，以及刺激和/或抑制il-10产生的药物。其还可涉及使得有可能测量在血浆中循环的il-10含量的抗体。

有利地，本发明涉及一种如上所定义的预后试剂盒，其中用于检测如序列seqidno：1所示的fcγriiia受体的序列的位置176中的氨基酸；或如序列seqidno：2所示的fcγriiia受体的序列的位置158中的氨基酸的构件包含具有序列seqidno：3、seqidno：4和seqidno：5的寡核苷酸。

当然，所属领域的技术人员可以提出通过pcr扩增对应于多态性的区域的其它寡核苷酸并确定测试患者所携带的等位基因。

在另一方面中，本发明涉及一种用于体外检测患有血液疾病的患者的样品中的分泌il-10的b细胞的适当媒体上的计算机程序产品。

本发明的另一方面涉及经设计以通过通量细胞计量术进行分泌il-10的b细胞的检测和/或包含用于在计算机上执行所述程序，尤其与通量细胞仪连接时执行所述检测的部分/构件/程序代码说明书的软件或计算机程序产品。有利地，所述程序包含于可由计算机读取的数据记录媒体。这类媒体不限于便携式记录媒体，如cd-rom，而且也可为包含内部存储器和计算机的装置的部分(例如ram和/或rom)，或外部存储器装置，如硬盘驱动器或usb密钥或附近或远程服务器。

因此，本发明涉及一种用于实施如先前定义的预后方法的适当媒体上的计算机程序产品，所述计算机程序产品能够测定分泌il-10的b细胞数量。

此计算机程序尤其使得有可能进行自动和标准化调节，使得使用者随后仅需要下载细胞仪中的信息并传递肿瘤细胞以可再现地获得分泌il-10的b细胞数量的测定。

在另一方面中，本发明涉及一种寻求改善使用治疗抗体治疗血液疾病的方法，其包含使用至少一种淋巴细胞的il-10的分泌或活性的抑制剂。

具体来说，本发明涉及一种寻求改善使用cd20抗体、尤其利妥昔单抗治疗血液疾病的方法，其包含使用至少一种淋巴细胞的il-10的分泌或活性的抑制剂。

在另一方面中，本发明涉及一种寻求改善使用治疗抗体治疗血液疾病的方法，其包含使用至少一种淋巴细胞分泌il-10的抑制剂。

具体来说，本发明涉及一种寻求改善使用cd20抗体、尤其利妥昔单抗治疗血液疾病的方法，其包含使用至少一种分泌il-10的b细胞的抑制剂。

分泌il-10的b细胞或淋巴细胞分泌il-10的抑制剂在本发明的含义内是指能够通过抑制其分泌il-10的能力、或通过抑制其增殖、或通过尤其通过细胞凋亡造成其死亡干扰b10淋巴细胞活性的化合物或分子或其混合物。

因为本发明人已鉴别b10细胞对利妥昔单抗功效的影响，和il-10分泌之间的相关性，所以有利的是提出实际上寻求以下的方法：

-例如通过抑制合成或分泌抑制b淋巴细胞的il-10的产生，

-或抑制il-10的生物活性。

可以使用分泌抑制剂，如布雷菲德菌素。

也可能考虑使用如il-10抗体的il-10抑制剂，或使用将使白介素的标靶饱和并因此抑制天然蛋白质作用的模拟肽。

具有其一般知识的所属领域的技术人员可以轻易提出一种用于筛选il-10抑制剂分子或抑制其分泌的分子的方法。

本发明还涉及il-10活性或分泌的抑制剂用于制备寻求促进使用治疗抗体、尤其抗cd20或利妥昔单抗的血液疾病治疗的药用药物的用途。

本发明涉及一种il-10活性或分泌的抑制剂，其用于使用至少一种治疗抗体、尤其cd20抗体或利妥昔单抗治疗的血液疾病的治疗情形下。

有利地，本发明涉及一种包含至少一种il-10活性或分泌的抑制剂和至少一种治疗抗体、尤其cd20抗体或利妥昔单抗的组合物，其用于治疗其中在如序列seqidno：1所示的fcγriiia受体的序列的位置176中，或在如序列seqidno：2所示的fcγriiia受体的序列的位置158中具有缬氨酸的血液疾病。

鉴于遵循以下的四个图式和实例将更好地理解本发明：

图式描述：

图1展示图示，所述图示展示在d0天，即治疗之前与血浆il-10含量相关的感受态il-10白血病b细胞(cll)的频率(p＝0.0166，r＝3969)。x轴展示以pg/ml为单位的血浆中的il-10数量并且y轴展示以％为单位表达的b10细胞的百分比。

图2展示图示，所述图示展示在用单独利妥昔单抗(d22)治疗之后所观测到的淋巴细胞耗尽受在d0天感受态il-10cllb细胞频率的统计学影响(p＝0.004)。x轴展示以％为单位的淋巴细胞耗尽的百分比并且y轴展示以％为单位表达的b10细胞的百分比。

图3展示图示，所述图示展示淋巴细胞耗尽对于携带fcγriiia-158v等位基因的患者而言在统计学上较多。

图4展示接受者操作曲线(roccurves，receiveroperatingcurve)，其通过针对单独感受态il-10cllb细胞的百分比(a)(auc＝0.763)、fcgr3a多态性的v对f/f等位基因的携带者(b)(auc＝0.675)和感受态il-10cllb细胞的百分比与fcgr3a多态性的v对f/f等位基因的携带者的组合(c)(auc＝0.855)的逻辑回归来生成。

图5展示比较调节b细胞的数量(通过细胞计量术-x轴列出)与il-10分泌的分析(快速方法-v轴)的图示。具有虚线的矩形对应于具有与cd20抗体的低风险次最佳反应的个体。具有实线的矩形对应于具有与cd20抗体高风险次最佳反应的个体。在通过两种方法获得的结果之间观测到良好的相关性(r＝0.79)。

实例

实例1

利妥昔单抗(以商标节售)的作用机制仍未知并且可取决于b细胞淋巴增生病症的亚型而不同。已知利妥昔单抗引起体外细胞凋亡、互补依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性细胞的细胞毒性(adcc)和抗体依赖性吞噬作用(adpc)，并且一些结果倾向于涉及这些活体内机制。

最近已发现影响对利妥昔单抗的反应的某些因素。

本发明人先前已观测到fcγriiiav/f受体的多态性影响对利妥昔单抗治疗的临床反应。因为此多态性改变fcγriiia受体的igg1的恒定部分的亲和力(在nk细胞和巨噬细胞的表面上表达)，所以本发明人阐述假设：adcc机制在治疗使用利妥昔单抗治疗的滤泡性淋巴瘤的情形下应为显著的。

最近已在人类和小鼠中将调节b细胞鉴别为能够分泌il-10的细胞亚型。这些b细胞又称为b10细胞或b10，其特征在于其基于il-10产生调节发炎、自身免疫性和先天性或适应性免疫反应的能力。在小鼠模型中，b10细胞将能够通过作用于由免疫球蛋白的恒定部分(fc部分)介导的单核细胞功能抑制由cd20抗体诱导的淋巴瘤细胞的消除。

最近，已经证明克隆慢性淋巴性白血病(cll)的细胞具有免疫抑制性质和il-10感受态。

本发明人随后考虑cll的感受态il-10细胞可能影响在患有此类型白血病的患者中使用利妥昔单抗治疗的功效。

患者和治疗

患者。

在59法国中心进行前瞻性和随机ii期研究，其包括在2012年6月与2013年1月之间的140名患者。未接受任何先前治疗(年龄在18岁与65岁之间)并且根据2008iwcll准则通过免疫表型确认的慢性淋巴性白血病诊断(患有活性疾病的比奈(binet)c期或比奈a或b期)的患者参与此试验。考虑其它纳入准则：通过fish评估不存在17p缺失(＜10％阳性核心)。所有患者在纳入之前均提供书面形式的知情同意书。

随机化。

基于在fish分析之后其igvh突变状况(11q缺失)将患者分层并且以1∶1比值随机分配从而对于a组接受标准剂量的fcr(氟达拉宾(fludarabine)、环磷酰胺和利妥昔单抗)化疗或对于b组在标准fcr治疗之前接受具有利妥昔单抗前期的dense-fcr。

治疗。

标准fcr治疗由6轮通过28天分离的利妥昔单抗(第1轮d1375mg/m²和其它轮500mg/m²)、氟达拉宾(40mg/m²/dd2-4)、环磷酰胺(250mg/m²/dd2-4)组成。对于实验组而言，fcr治疗前面是由4次连续输注组成的利妥昔单抗前期，其分布如下：在d0天500mg、和在d1天、第d8天和第d15天2000mg。针对患者的第1轮在第d22天开始，并且后续轮由28天分离。

在cll、il-10试验和fcgr3a基因分型中的感受态il-10细胞的鉴别

cll的感受态il-10细胞通过通量细胞计量术从多克隆刺激之后的纯化单核血球中鉴别。

已使用ficoll-hypaque密度梯度(eurobio，法国科塔布夫)纯化来自研究b组中患有cll的患者的外周血单核细胞(peripheralbloodmononucleatedcells，pbmc)。

pbmc再悬浮(9×10⁶个细胞/毫升)于含有以下各者的培养基(rpmi1640-biotechgmbh，德国艾登巴赫)中：10％胎牛血清(eurobio，法国科塔布夫)、2mml-麸酰胺酸(eurobio，法国科塔布夫)、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2.5μg/ml两性霉素(所有抗生素均获自tebu-bio，法国伊夫林省勒佩赖)。

b淋巴细胞的克隆活化在包含5％co2-95％空气混合物的潮湿大气中在37℃下使用cpg(odn2006，10μg/ml；invivogen，美国圣迭戈)、cd40l(50ng/ml；r&dsystems，美国明尼苏达州明尼阿波利斯)和抗多组氨酸(500ng/ml；r&dsystems，美国明尼苏达州明尼阿波利斯)进行48小时。添加豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(pma，50ng/ml；西格玛-奥德里奇公司，美国密苏里州圣路易斯)和伊屋诺霉素(1μg/ml；西格玛-奥德里奇公司，西格玛-奥德里奇公司，美国密苏里州圣路易斯)以刺激il-10产生。在包含5％co2-95％空气混合物的潮湿大气中在37℃下4h之后，添加布雷菲德菌素a(1x溶液/毫升；biolegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥)以阻断il-10分泌以便鉴别b10细胞。使用以下抗体标记细胞：来自biolegend(美国加利福尼亚州圣地亚哥)的抗cd19bv421(hib19)、抗cd69pe/cy7(fn50)、抗cd38apc(hit2)、抗il-10pe(jes3-9d7)和来自贝克曼库尔特公司(美国加利福尼亚州布瑞亚市)的抗cd45ko(j.33)和抗cd5fitc(bl1a)。克隆cll细胞识别为cd19+cd5+cd20int淋巴细胞。使用cyantmadp通量细胞仪(贝克曼库尔特公司，美国加利福尼亚州布瑞亚市)进行分析。

根据制造商的认识(r&dsystems，美国明尼阿波利斯)通过激光双读数系统使用技术在磁性球上测定血浆il-10含量。在环境温度下将68名患者的血浆与覆盖有il-10抗体的超顺磁球一起培育2小时，稀释一半。由于用于检测的两种抗体的组合而定量血浆il-10：il-10生物素标记抗体和与藻红蛋白结合的抗生蛋白链菌素抗体。

fcγriiia-158vf多态性通过嵌套式pcr测定。简单来说，在一些修改下如dall′ozzo等人(dall′ozzo等人《免疫学方法杂志(jimmunolmethods)》.2003；277(1-2)：185-192)所描述进行单步骤等位基因特异性多重pcr测试。25μl反应混合物包含基因组dna、400nm正向引物(5′-tccaaaagccacactcaaagtc-3′(seqidno：3))、400nm对等位基因v具有特异性的反向引物(5′-agacacatttttactcccatc-3′(seqidno：4))和200nm对等位基因f具有特异性的反向引物(5′-gcgggcagggcggcgggggcggggccggtgatgttcacagtctctgatcacacatttttactcccata-3′(seqidno：5))、每种核苷酸(dntp)400μm、2mmmgcl2和0.5u在其缓冲液中的taqdna聚合酶(普洛麦格(promega)，美国麦迪逊)。pcr条件是：在95℃下3.5min，随后35周期，每一周期由95℃维持20秒、56℃维持20秒、72℃维持30秒组成。在扩增之后，pcr产物(对于等位基因f为137bp并且对于等位基因b为81bp)在8％丙烯酰胺凝胶(美国卡尔斯巴德，invitrogen)上分离并且通过使用溴化乙锭标记查看。

统计学分析

使用shapiro-wilk测试测试数据分布。χ²和fisher测试用于分类数据。

使用学生t测试或mann-whitney测试进行中值比较。

在单变量分析中具有p＜0.10的所有变量均包括于中间模型中。最终模型的变量使用学生t测试使用进行性消除方法测定(p＜0.05作为显著模型)。

所有统计学分析均通过使用3.0.2.10版本的r软件以级别α，0.05实施两侧测试进行。

结果和讨论

在第22天(d22)评估使用利妥昔单抗的单药疗法之后的淋巴细胞耗尽以研究在包括于研究实验组中的68名患者中il-10感受态白血病细胞(b10)对利妥昔单抗的活体内功效的影响。

在利妥昔单抗的四次给药之前(d0)的白血病淋巴细胞数目的中值为91.13g/l(范围：3.74-497.40)并且在使用单独利妥昔单抗的治疗的前期结束时(d22)为2.60g/l(范围：0.14-189.40)。因此，在使用单独利妥昔单抗治疗的前期之后(d22)的中值淋巴细胞耗尽为95.1％(范围为77.0-99.9)，其中66％获得超过90％的耗尽。

患者的特征和其分布基于下表1中提供的90％淋巴细胞耗尽。

在90％淋巴细胞耗尽与年龄、性别、比奈期、ighv突变、细胞遗传学异常或β2微球蛋白的临床参数之间未发现显著相关性。

在所有测试患者中鉴别b10细胞的子群(n＝47，中值：3.06％cll细胞，范围：0.12到29.55)。在白血病细胞之间b10细胞的频率与血浆il-10的数量相关(图1，r＝0.39，p＝0.02)，而血浆il-10含量与非b10白血病细胞不相关(未示出)。b10细胞的频率并未基于患者特征而变化，并且在存在或不存在igvh突变下在患有cll的患者中也未显著不同(分别为中值：6.29％，范围：0.12到15.83对中值：1.85％，范围：0.23到20.81)。此外，这类b10细胞频率也不与细胞遗传学变化(del11q、del13q、三体性12)相关。

单变量分析展示在使用单独利妥昔单抗治疗的前期之后(d22)b10细胞的频率影响超过90％的淋巴细胞耗尽(图2，p＝0.004)。b10细胞的频率也使得有可能预测在使用氟达拉宾-环磷酰胺组合和利妥昔单抗治疗结束之后的3个月临床反应(完全反应)，认为是患有慢性淋巴性白血病的患者的参考治疗(p＝0.04)。

这些结果展示所有cll患者具有表示白血病b细胞可变百分比并且对利妥昔单抗的活性具有化学显著活体内抑制影响的b10细胞亚群。

因为fcγriiia-158v/f多态性与滤泡性淋巴瘤中利妥昔单抗的活体内功效相关，所以本发明人已确定在组的不同患者中的此多态性。

fcγriiia-158v/f多态性与在d22天淋巴细胞的正常数目(＜5g/l)(p＝0.03)和90％的淋巴细胞耗尽(p＝0.03)显著相关。此也是fcγriiia-158v多态性的携带者的情况(p＝0.01)(图3)。

相反地，fcγriiia-158v/f多态性不与免疫化疗之后3个月临床反应相关。因此，这些结果表明由fcγriiia介导的免疫功能在利妥昔单抗活性中起至关重要的作用，但fcγriiia-158v/f多态性的参与可以通过免疫化疗的高活性或通过化疗直接抑制效应子免疫细胞隐藏。

逻辑回归分析展示仅b10细胞的频率和fcγriiia-158v/f多态性与使用单独利妥昔单抗治疗的前期之后(d22)的90％淋巴细胞耗尽相关(分别为密切相关风险(or)＝0.83；信赖区间(ci)：0.72-0.3；p＝0.002，和or＝4.95；95％ci：1；07-27.48；p＝0.04)。

使用b10细胞的频率和fcγriiia-158v/f多态性构建的接收者操作曲线(roc)展示极其显著的曲线下面积(areaunderthecurve，auc)(auc＝0.855；95％ci：0.732-0.978)，引起具有超过90％的其淋巴细胞耗尽的患者与不具有这类耗尽的那些患者之间的良好差别(图4)。

从roc曲线(图4)中，可以提取以下数据：

1.获自单独fcγriiia受体的基因分型的数据

基于在多变量分析期间所使用的群体(n＝44)(曲线下面积(auc＝0.669)，95％ci＝0.514-0.824)，所获得的结果如下：

表2的图例.90％淋巴细胞耗尽的敏感度和特异性通过使用前述计算概率获得。

可以发现鉴别大量假阳性(约33％)。

2.获自单独b10细胞数目的数据

a.具有4.34％的临限值

基于在多变量分析期间使用的群体(n＝44)(auc＝0.779)，95％ci＝0.652-0.905，所获得的结果如下：

表3的图例：与表2的图例一致。

b.具有3％的临限值

基于在多变量分析期间使用的群体(n＝44)(auc＝0.729)，95％ci＝0.598-0.589，所获得的结果如下：

表4的图例：与表2的图例一致。

c.具有5％的临限值

基于在多变量分析期间使用的群体(n＝44)auc＝0.726，95％ci＝0.586-0.866，所获得的结果如下：

表5的图例：与表2的图例一致。

可以看到通过在低于5％b10细胞处施加临限值，假阳性含量降低到约5％。b10检测显著改善相对于多态性的预后。

3.获自fcγriiia受体和b10的基因分型的数据

基于在多变量分析期间所使用的群体(n＝44)(曲线下面积(auc＝0.0855)，95％ci＝0.732-0.978)，所获得的结果如下：

表6的图例：与表2的图例一致。

在前述表2到6中，敏感度是测试病症存在时鉴别其能力的测量值。测试将真阳性(truepositives，tp)的比例检测为具有“病症”[se＝tp/(tp+fn)]。假阴性是患有“病症”的患者，但未通过测试检测到。高敏感度在筛选中为优选的，因为其更容易排斥未患有病症的患者。

特异性是测试在病症不存在时将其排除的能力。测试将真阴性(truenegatives，tn)的比例检测为不具有“病症”[sp＝tp/(tp+fp)]。假阳性是未患有“病症”的患者，但测试检测为呈阳性。

通过组合多态性和b10细胞数目的检测，看到预后的改善，和尤其认为是假阴性患者的数目的异常显著的减少。此外，双检测使得有可能对于b10的低于5％的临限值而言获得良好敏感度(约86％)。

本发明人已因此确定患有慢性淋巴性白血病并接受利妥昔单抗的患者的b10群体。同时，其已确定这些患者的fcγriiia-158vf表型。其因此已能够展示b10细胞的频率和fcγriiia-158vf多态性在患有慢性淋巴性白血病的患者中影响对利妥昔单抗的反应。这两个组合因素的分析使得有可能改善预后反应预测的敏感度和特异性。

实例2

本发明人也已提出一种用于分析调节b细胞的频率的简单和快速方法。方法与参考方法比较，其基于il-10合成流入细胞计量术的胞浆内检测。

所述方法由用于通过从外周血样品中负选择来富集b淋巴细胞群体的第一步骤组成，所述b淋巴细胞通常构成白细胞之间的极少数。在(cpt真空采血管bd型的)相分离管上收集血液。或者，血液可以从含有抗凝血剂的主管转移到相分离管。

将rosettesepstemcell类型的耗尽混合液添加到血液样品中以便富集具有b淋巴细胞的白细胞相。在包含培育、通过离心和两次细胞洗涤离心的分离的此步骤结束时，获得含有超过90％b淋巴细胞的群体。

细胞通过目测计数(在显微镜下的细胞)或通过细胞计量术计数以便制备6百万个细胞/毫升的浓度并放置在含有rpmi+10％胎牛血清的培养基的培养物中。细胞通过多克隆激活剂的混合液，如木酚素-组氨酸+抗体cpg和cd40样式的混合物刺激。同时进行未受刺激的孔。在不干涉下使培养物在37℃下保持18h到48h。

在此培育结束时，将细胞培养物离心并收集培养物上清液并且保持在-20℃下或立即通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunoabsorbentassay，eia)以便测定所分泌的il-10浓度。

与细胞计量术的参考方法比较所获得的数据展示通过il-10分泌的eia分析的方法提供两种方法之间良好相关的结果。因此，恰当鉴别含有超过5％的调节b细胞比例的细胞样品(图5)。

序列表

<110>蒙彼利埃大学

蒙彼利埃大学医疗中心

法国国家科研中心

法国国家健康和医学研究院

<120>用于淋巴血液疾病的预后方法

<130>br91196

<141>2016-06-09

<150>fr15/55253

<151>2015-06-09

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>254

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

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<221>unsure

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<223>v或f

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<211>236

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<213>智人(homosapiens)

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<223>v或f

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