本发明涉及一种发射寿命测量方法和设备、特别是用于测量表征样本的电子激发态的时间衰变的平均寿命、例如荧光或磷光寿命或等同特征的发射寿命测量方法和设备。本发明的应用在调查样本的领域中可使用，例如在生物学、医学、材料科学或环境技术领域。
背景技术：
例如基于荧光或磷光发射的发射寿命(激发态寿命)的估算是基础科学和应用科学中的基本技术。寿命(tau，τ)确定提供了大分子(例如蛋白质和核酸)的结合和其它分子式相互作用和构象状态的敏感度量，以及它们的微环境的物理性质(例如粘度、极性、ph)。时间分辨式光谱学的一个突出应用是fret(
为了测量发射寿命，利用脉冲状激发光照射所研究的样本。使用具有时间分辨率的检测器装置检测样本的发射响应。检测器装置创建时间性检测器响应函数(输出信号函数)，例如表示来自样本的发射响应的时间依赖性，并基于此计算样本中电子激发态的寿命。
发射寿命可以在单个样本位置处测量，或者在多个样本位置处以空间分辨率测量。在后一种情况下，提供一种成像模式，在荧光情况下称为荧光寿命成像(flim：fluorescencelifetimeimaging)。flim广泛应用于生物成像(显微术)，以便确定参与信号转导的关键分子的构象、活化、相互作用和再分布。在生物技术中，荧光衰变测量用于具有指定靶标的预期诊断或治疗分子的高通量筛选(例如经由结合测定)。
电子(单重态或三重态)激发态的衰变通常以各种消减过程(特别是自发发射、共振能量转移、非辐射衰变)的组合给出的限定的概率为特征，并且在激发源停止后通常呈指数性质。用于寿命确定的传统方法试图从测量的检测器响应函数中包括的发射衰变曲线的时间过程中提取指数时间常数(寿命τ的倒数)或在非均相系统的情况下的多个时间常数。
现有技术分为适于离散样本(例如比色杯、微量滴定板孔)或显微镜下复杂样本的技术。后一种情况构成成像模式flim，并且需要使用具有一个(或多个)检测器的扫描系统或能够获取2d图像的时间性序列的摄像装置。大量的flim技术及其比较优点和生物学应用通过大量评论进行了总结，例如：w.becker在“j.microsc.”247:119-136(2012)中或m.y.berezin等在“chem.rev”110:2641-2684(2010)中。在材料科学和其它应用领域中存在许多flim的相关实现。
并入共聚焦显微镜中的扫描系统通常利用与时间有关的单光子计数(tcspc：time-correlatedsingle-photoncounting)技术，该技术提供很高的固有灵敏度和时间分辨率。在时域中操作并使用一系列非常窄的激发脉冲的基于摄像装置的系统需要选通增强器前端，所述选通增强器前端限定检测窗口和激发脉冲之间的可编程的时间性关系。在频域中操作的类似仪器采用周期性(正弦)激发和相敏检测。在这种情况下，寿命由检测的信号相对于激发源的调制振幅和相位得出。较新的摄像装置系统直接在检测器芯片表面上执行相敏检测。
传统的时域测量、特别是flim中的实验困难在于，由于检测器响应函数由激发光脉冲与指数发射衰变函数的卷积给出并进而在形状上是任意复杂的，因此使得激发光脉冲以窄而有限的宽度为特征。因此，需要短激发光脉冲(持续时间小于衰变时间或与衰变时间相当)。
此外，用于得出衰变时间的检测器响应函数的数据分析需要将响应去卷积和/或数据集限制到衰变的最后部分。在这两种情况下，都涉及基于迭代最小化的复杂数学过程。即使使用当前的计算机，这些也需要相当长的计算时间，如果存在不止单个衰变组分，则计算时间会延长到几分钟。大多数flim应用基于从单独的衰变时间及其相应幅度计算出的平均衰变寿命。得出平均值仍需要完整的衰变分析以便获得组分的数量及组分的参数。此限制适于所有当前flim或单通道寿命技术。
技术实现要素：
本发明的目的
本发明的目的是提供一种改进的发射寿命测量方法和设备，从而避免传统技术的缺点。特别地，该方法和设备能够测量发射寿命并降低对激发脉冲的持续时间的要求和/或降低衰变分析的复杂性，因此特别有助于flim测量。
本发明的简要概述
根据本发明的第一总体方面，上述目的通过一种发射寿命测量方法、特别是用于测量样本的电子激发态的平均寿命的发射寿命测量方法来实现，该方法包括以下步骤：用至少一个激发光脉冲、特别是至少两个激发光脉冲照射样本，时间分辨式检测来自样本的发射响应并创建时间性检测器响应函数，以及基于检测器响应函数计算电子激发态的平均寿命。
照射样本包括用单个激发光脉冲或一系列的相同激发光脉冲辐照固体、液体或气体状态的样本，从而获得样本的电子激发态。术语“电子激发态”是指样本中的原子、分子或者原子或分子聚集体的通过吸收特别是具有光波长的所述至少一个激发光脉冲(包括紫外线、可见光和红外波长的至少一个)而激发的电子状态。所述至少一个激发光脉冲以聚焦或宽场方式被导向至静止或移动状态的样本。沿着一个或多个电子跃迁的激发态的发射衰变引起来自样本的可检测的发射响应(发射率)。根据样本的组成，特别是沿着单个电子跃迁或多个不同电子跃迁的发射，发射响应的时间依赖性与单个电子跃迁的单个寿命或不同电子跃迁的寿命有关。术语“平均寿命”是指代表电子激发态总体的发射衰变的定量测量的单个寿命或不同寿命(例如强度平均寿命)的加权叠加。
根据本发明，所述至少一个激发光脉冲的脉冲形状使得样本达到包括线性增加的或恒定数量的电子激发态的平衡激发稳态(也表示为：平衡激发稳态分布)。换句话说，脉冲的时间强度函数具有至少一个区段，所述区段的持续时间被选择为使得样本的电子激发态的数量在稳态激发区段期间随时间线性增长或恒定。样本的这种状态被称为稳态激发态平衡，因为每时间单位的吸收和发射事件的数量是平衡的，并且诱发的发射响应在稳态激发区段期间具有线性增加或恒定的特性。在线性增加或恒定的发射响应的两种情况下，检测器响应函数创建成包括具有恒定正斜率的线性响应函数区段(线性输出信号区段)。
所述至少一个激发光脉冲、特别是其稳态激发区段具有比样本的发射寿命更长的持续时间。这与传统技术形成对比，在传统技术中，在激发样本的非平衡状态之后，利用大大短于待测量的寿命测量的超短激发脉冲来测量寿命。因此，作为本发明的第一个主要优点，与传统技术相比，实质上有助于产生和控制所述至少一个激发光脉冲。第二个重要优点是激发脉冲的强度和能量更大，使得检测到的发射的信噪比特性增强。
此外，根据本发明，基于线性响应函数区段相对于所述至少一个激发光脉冲的参考时间、例如稳态激发区段的开始时间的时间位置和/或基于线性响应函数区段的斜率计算电子激发态的平均寿命。特别地，基于由所述至少一个激发光脉冲引起的线性响应函数区段相对于直接表示激发脉冲的参考信号的相应响应或具有已知发射衰变特性的材料的响应的时间位置来计算电子激发态的平均寿命。线性响应函数区段的特征在于以使得能够与参考响应相比较的方式评估时间轴上的斜率和截距。发明人已经发现，平均寿命可以直接从检测器响应函数的线性响应函数区段得出。因此，作为本发明的第二个主要优点，大大便于分析响应函数区段。与传统技术相比，通过线性代数过程分析检测器信号，特别是无需去卷积，使得信号处理复杂度大大降低。特别地，这改进了本发明的flim应用，因为在成像系统的情况下可以以更高的速度和/或不损失空间分辨率来测量发射寿命图像。
根据本发明的第二总体方面，上述目的通过一种发射寿命测量设备、特别是用于测量样本的电子激发态的平均寿命的发射寿命测量设备来实现，发射寿命测量设备包括：激发源装置，激发源装置被布置为用于利用至少一个激发光脉冲、特别是至少两个激发光脉冲照射样本；检测器装置，其被布置成用于时间分辨式检测来自样本的发射响应并且创建时间性检测器响应函数；以及分析装置，其被布置为基于检测器响应函数计算电子激发态的平均寿命。根据本发明，激发源装置适于使所述至少一个激发光脉冲成形，使得样本达到包括线性增加的或恒定数量的电子激发态的平衡激发稳态，并且检测器响应函数具有有恒定斜率的线性响应函数区段。此外，分析装置适于基于线性响应函数区段相对于所述至少一个激发光脉冲的参考时间的时间位置和/或基于线性响应函数区段的斜率和截距计算电子激发态的平均寿命。优选地，本发明的第一方面的方法用本发明的第二方面的设备实施。
有利地，本发明的基本概念是用包括比样本的最长激发态寿命长(例如为8倍长)的恒定梯度的或恒定平坦的(平台)区段的至少一个激发脉冲代替当前在(例如荧光寿命的)激发态衰变估算中使用的非常窄的脉冲。可以包括单个检测器元件(例如apd、pmt、混合器(hybrid)、spad)以及检测器元件阵列或摄像装置、优选地选通增强摄像装置的检测器装置的输出信号被即时地测量或以积分的方式测量到不同的、适当选择的时间点(需要至少2次确定)。在激发稳态期间，检测器响应函数表现出普遍线性的时间性增大，从中可以即时估算任意复杂的非均质溶液或显微镜样本的强度加权寿命，而无需去卷积，特别是无需迭代技术。使用长激发光脉冲可以确定非常短(甚至小于ns)的寿命的事实并不直观明显，这使得传统技术中缺少这种方法。与传统技术相比，本发明的技术在发射响应检测的灵敏度、光子效率、信号处理速度以及降低信号处理中算法的复杂性方面具有优势。此外，本发明的独到之处在于直接提供平均寿命，而不考虑样本的复杂性如何。而且，它还具有在不修改设备的情况下测量单独的衰变的能力。
根据本发明的第一实施例，所述至少一个激发光脉冲的稳态激发区段是线性斜坡区段(或线性激发斜坡区段)。对于一系列的激发光脉冲，激发具有锯齿式强度形状，由此衰变缘(decayinglimb)不需要是线性的。激发脉冲的稳态激发区段具有脉冲强度的线性增大，其中斜坡的长度选择成使得在相应的检测时间窗内实现样本的平衡激发稳态。在线性斜坡区段期间，样本中电子激发态的数量随时间线性增加。因此，检测器响应函数包括来自样本的与时间相关的发射响应。线性响应函数区段遵循线性斜坡区段，具有由时间轴上的针对0净信号强度定义的截距限定的或由适当归一化的信号的时间性移位限定的时间延迟，两种情况均对应于待测量的平均发射寿命。
优选地，利用本发明的第一实施例，使用等式τ＝t-rf(t)/srf(t)或由其导出的等式计算电子激发态的平均寿命τ，其中t是脉冲开始之后的时间位置，rf(t)是在所考虑的时间位置处的发射响应，并且srf(t)是在时间t处的线性响应函数区段的斜率。在线性区域中，srf[t]是恒定的。优选地，使用寿命测量设备的分析装置来计算平均寿命τ。
根据本发明的第二实施例，所述至少一个激发光脉冲的稳态激发区段是具有恒定强度的脉冲区段。激发光脉冲是例如矩形脉冲或在弯曲边缘之间具有平坦区段的脉冲。具有恒定强度的脉冲区段的持续时间选择成使得在任意检测时间窗口处实现样本的平衡激发稳态。在具有恒定强度的脉冲区段期间，样本中电子激发态的数量不随时间变化。因此，检测器响应函数被创建成包括来自样本的时间积分式发射响应。线性响应函数区段具有由待测量的平均发射寿命确定的斜率。
优选地，利用本发明的第二实施例，使用等式τ＝t-rfi(t)/srfi[t]或由其导出的等式计算电子激发态的平均寿命τ，其中t是考虑的时间位置，rfi(t)是在所考虑的时间位置处的积分式发射响应，并且srfi[t]是在时间t处的线性响应函数区段的斜率。在线性区域中，srfi[t]是恒定的。优选地，使用寿命测量设备的分析装置来计算平均寿命τ。
有利地，收集来自样本的时间积分式发射响应的各种方法是可用的。根据第一变体，在具有恒定强度的脉冲区段开始之后，以至少两个积分时间区间收集时间积分式发射响应。根据第二变体，通过收集来自样本的至少一个与时间相关的发射响应和与时间相关的发射响应在激发脉冲完成之后的最终值来获得时间积分式发射响应。
根据本发明的第三实施例，所述至少一个激发光脉冲包括强度增大的区段和随后的具有恒定强度的脉冲区段的序列。通过由基于准确的脉冲形状的数学计算来定义有效的开始时间点，检测器响应函数可调整成适应这种更复杂的脉冲形状。通过已知标定样本的响应函数的确定来提供根据经验的确定。用于检测发射响应的时间函数的线性响应或来自样本的时间积分式发射响应的积分窗口在具有恒定强度的脉冲区段内选择。
所述至少一个激发光脉冲的稳态激发区段的持续时间被选择为比待测量的发射寿命更长。如果样本含有已知发射寿命的物质，则可根据已知数据选择持续时间。或者，特别地如果样本含有未知物质，则可以基于具有不同脉冲形状的初始测量选择稳态激发区段的持续时间，并将脉冲形状选择成使得稳态激发区段的持续时间能够提供可以以足够的信噪比、精确度和重现性进行分析的检测器响应函数。
优选地，所述至少一个激发光脉冲的线性斜坡区段和/或恒定脉冲区段的持续时间比激发态的最长寿命长，长的倍数与寿命和期望的测量准确度有关。使用给定等式的测量寿命将等于真实寿命τ乘以因子＝1+γ/(1-eγ)，其中γ＝t/τ。对于γ＝1、5和8，该因子＝0.418、0.966和0.997。因此，对于计算寿命的精确度>99％，线性斜坡区段和/或恒定脉冲区段的持续时间应该超过7*τ，优选达到10*τ。
本发明的另一个优点是它可以用于测量宽时间范围内的发射寿命，特别是覆盖荧光或磷光事件的发射寿命。因此，线性斜坡区段或具有恒定强度的脉冲区段的持续时间可以在从10ns到10ms的宽范围内选择。利用本发明的优选应用，激发源装置可适用于在特定脉冲控制范围内的操作，使得持续时间可以是至少10ns、特别是50ns；至少100ns、特别是500ns；至少1μs，特别是5μs；至少10μs，特别是50μs；至少100μs、特别是500μs；和/或至少1ms、特别是5ms。
激发源装置优选地包括至少一个激发光源元件，例如至少一个led、至少一个激光二极管元件和/或至少一个脉冲式激光源，所述激发光源元件与向激发光源元件提供电流控制的控制装置连接。激发光源元件的脉冲式成形的驱动电流被控制成用于产生所述至少一个激发光脉冲的形状和持续时间、特别是激发光脉冲的线性斜坡区段或具有恒定强度的脉冲区段的形状和持续时间。特别优选的是，激发源装置包括驱动器电路，该驱动器电路提供所述至少一个激发光脉冲的重复率、强度、持续时间(宽度)和触发的控制。重要的是将与激发源装置的触发和响应相关的抖动保持为小于寿命确定的期望精度的值、在荧光的情况下优选<50ps。
根据本发明，线性响应函数区段相对于所述至少一个激发光脉冲的参考时间的时间位置被用于计算电子激发态的平均寿命和/或用于估算线性响应函数区段的斜率。优选地，所述至少一个激发光脉冲的参考时间可以从利用参考样本或参考光学元件测得的标定响应函数获得。因此，寿命测量设备优选地包括被布置成用于标定目的的参考光学元件。特别地，“irf(instrumentresponsefunction，仪器响应函数)立方”可以设置在由线性偏振器和四分之一波长延迟器构成的寿命测量设备的光束路径中，并产生来自由样本表面(例如在显微镜研究中的玻片表面)反射的激发光的具有“零”寿命的参考检测器信号。已知寿命的样本也可以提供标定参考。
根据本发明的另一优选特征，可以用单个检测器元件或用多个检测器元件或用提供样本的平均寿命图像的时间选通摄像装置来检测来自样本的发射响应。检测器元件优选地包括固态或真空电子元件以及提供光子计数信息、特别是光子数量和到达时间的相关联的检测器处理器。时间选通摄像装置优选地包括选通增强摄像装置，所述选通增强摄像装置具有可编程选通延迟和宽度并且提供用于同步激发源装置的信号，优选地还提供脉冲持续时间的控制。
根据本发明的另一特别优选特征，检测器装置适于以低于50ps、特别是低于20ps、例如10ps或低于10ps的时间分辨率和/或以低于70ps、特别是低于50ps、例如35ps或低于35ps的抖动检测来自样本的发射响应。这些参数可以用时间选通摄像装置或单个检测器获得。
根据本发明的一特别优选的应用，激发源装置和检测器装置被集成到扫描显微镜、特别是具有超分辨率能力的显微镜中，或被集成到具有光学切片能力的宽视场显微镜中。有利地，这使得本发明技术能够与可用的显微技术组合，特别是用于研究生物材料。
根据本发明的一个优选变型，可以通过在一系列的激发脉冲期间检测来自样本的发射响应来创建检测器响应函数。在这种情况下，利用检测器装置使用偏移检测或积分窗口对发射响应进行采样。或者，检测器响应函数还可以通过利用两个适当定时的激发光脉冲或者甚至仅一个激发光脉冲检测来自样本的发射响应来创建，由此提供非常高的采集速率。检测器响应函数也可以通过与时间有关的单光子计数检测发射响应来创建，从而提供光子数和到达时间的直方图，使得在灵敏度、准确性和噪声抑制方面特别有利。
作为本发明的进一步优点，可以研究宽范围的样本，特别是包括具有被所述至少一个激发光脉冲激发的单个电子跃迁的样本，其中平均寿命是单个电子跃迁的单个发射寿命，或者包括具有由所述至少一个激发光脉冲激发的多个电子跃迁的样本，其中平均寿命是电子跃迁的强度平均发射寿命。
在不将本发明限制于下列清单的情况下，被研究的样本的例子可以包括：例如物质的混合物，特别是大分子、配体和小分子的混合物；微环境探针；经受共振能量转移的组分；生物材料、特别是生物细胞；生物材料、特别是细胞器；病理生物材料、特别是沉淀物；分布在阵列中的组分、特别是分布在多孔测定板中的组分；流动的流、特别是如在流式细胞仪中那样的流动的流；通道中的实体、特别是如在微流体室中那样的实体；视觉系统的结构、特别是如在眼科中那样的视觉系统的结构；皮肤结构、特别是如在皮肤医学中那样的皮肤结构；与牙齿相关的结构、特别是如在牙科中那样的与牙齿相关的结构；组织、特别是如在活组织检查中那样的组织；组织、特别是如在荧光引导的手术中那样的组织；组织、特别是如通过血管内机器人接近的组织；自发荧光物质、特别是如在组织中那样的自发荧光物质；组织、特别是在小动物成像期间那样的组织；法医检查中的材料；和/或固态材料、特别是表面。
本发明的技术可以与如下所述的传统的时域(例如tcspc)和选通增强摄像装置确定进行比较。传统的tcscp方法提供了高脉冲重复频率(例如>40mhz)，但是由于需要单光子检测而没有“堆积”，所以采集速率低得多(例如1％)，因此也将该方法限制到低电平信号。此外，它在点扫描(共焦)系统中具有低激发占空比，并且信号分析通常需要迭代曲线拟合。使用窄脉冲的传统选通增强摄像装置flim由于需要在时间上相继地移位以限定衰变曲线的窄选通窗口，而具有低的发射检测效率，由于使用窄的低能量激发脉冲而具有低信号强度，并且信号分析需要迭代曲线拟合。传统方法还可以配置有少量具有可变持续时间的检测窗口，但是不能提供复杂混合物的可靠寿命，并且由于使用窄激发脉冲而在灵敏度方面受到限制。
相反，本发明利用简单的高强度、高能量“长”脉冲提供高效的激发，并提供对所有信号电平(从非常低到非常高，单光子或多光子)的适用性、检测器响应函数信号的简单性质、以及无论样本异质性如何对平均寿命的适用性。估算平均寿命简单提供了具有立即读出的非迭代分析，并且本发明可以应用于所有时域(ps至s)。附加的测量模式、如直接衰变曲线分析也可以由同一台仪器容纳。本发明提供了非常高的采集速度(2个适当选择的选通宽度就足够了)，这在目前的商业系统中是无法实现的，本发明特别地由于集成在可商用的摄像装置中的增强器和emccd检测器而具有高灵敏度。此外，平均发射寿命可通过传统逐点衰变分析获得，但信号电平远高于传统flim系统。最后，寿命测量设备在最低系统成本和复杂性方面具有优势。
附图说明
下面参考附图描述本发明的更多细节和优点，附图示出了：
图1：根据本发明的发射寿命测量设备的一优选实施例的示意图；
图2：被包括在图1的发射寿命测量设备中的参考光学元件的示意图；
图3和4：示出了根据本发明的发射寿命测量设备的实施例的激发和响应曲线；
图5：示出了使用矩形激发脉冲进行信号采集的激发源和检测器功能的时间函数；和
图6和7：利用本发明技术获得的实验结果。
具体实施方式
下面通过示例性参考第一和第二实施例来描述本发明，其中使用具有线性斜坡区段或恒定强度的脉冲区段的至少一个激发光脉冲。本发明不限于这些实施例，而是可以使用包括线性斜坡区段和具有恒定强度的脉冲区段的组合的第三实施例的变体来实现。此外，示例性参考本发明的应用，其中至少检测器装置被集成到具有摄像检测器的显微镜中。本发明不限于此应用，而是可以以与扫描显微镜或没有成像模式的光学装置相对应的方式实现，如在传统寿命测量中那样。
发射寿命测量设备的实施例
图1示意性地示出了根据本发明的发射寿命测量设备100的一优选实施例，所述发射寿命测量设备包括激发源装置10、检测器装置20和分析装置30。
激发源装置10包括两个激光二极管11，每个激光二极管11都具有使得能够控制脉冲电流、宽度和形状的驱动器电路12以及准直光学器件13。激光二极管11(制造商：例如osram，例如型号tb450b)以不同的波长发射，所述波长例如选自405nm、450nm、520nm和661nm。驱动器电路12(制造商：例如picolas，highlandtechnologies或thorlabs)与检测器装置20的检测器处理器22相连接。激光二极管11的准直输出利用二向色镜14组合到公共光束路径，该公共光束路径经由循环器15(示出为旋转90°)和激光散斑抑制器和扩压器16(制造商：optotune)和非球面冷凝器17(未详细示出)导向包括物镜和滤波器的显微镜19、例如奥林巴斯ix71中的样本1。当前工作的激光二极管11的输出使用快速光电二极管脉冲监测器18(制造商：newfocus，例如型号1621)进行光学监测，经由未涂覆的分束器和聚焦光学器件接收一部分激光二极管输出。该检测器的输出由示波器(未示出)监测。根据本发明的替代实施例，发射寿命测量设备100可以设置有单个激光二极管或多于两个激光二极管或至少一个其它源元件、如led或脉冲激光器。
有利地，激光二极管比基于被配置用于产生非常窄的(10-1000)ps信号的激光二极管或飞秒激光器的商业系统更通用且更便宜。此外，本发明的设备中可实现的脉冲能量大1至2个数量级，使得光子噪声大大降低并且图像质量提高。
激光二极管11的输出优选通过采用pam设置(programmablearraymicroscopysetup，可编程阵列显微镜设置，未详细示出)耦接到显微镜19。pam设置，详见devries等人在“spieproc.”9376-12,2015中的描述，其包括可编程微镜阵列(德州仪器数字镜像装置，dmd)，以在荧光显微镜中产生系统的激发模式并进行相关检测。该系统在生成活的固定的细胞和组织的大幅面、光学切片图像时非常快速和灵敏。所有的发射参数(强度、光谱、偏振、寿命)都可以使用。
显微镜19设置有检测器装置20，检测器装置20包括耦接到显微镜19的侧端口的选通增强摄像装置21和集成的检测器处理器22。选通增强摄像装置21优选具有gen-iii增强器和优化的双重增益机构；选通宽度降至0.5ns；具有接通-ccd(on-ccd)积累的高选通重复率(高达1mhz)；和/或具有可忽略读出噪声的电子倍增ccd(emccd)检测器。选通增强摄像装置21的其它有利特征是高线性、光子计数能力和大的1k×1k格式；用于配置采集和读出的多功能电子设备和软件、包括脉冲式激发源装置10的同步；以及10ps的定时分辨率和35ps的定时抖动。精确的信号积分是选通增强摄像装置21的固有特征，特别是在选通宽度和位置的严格控制的情况下。
检测器处理器22的第一输出、例如pi-max4定时单元的辅助输出与驱动器电路12耦接，而检测器处理器22的第二输出与分析装置30耦接。经由第一输出，将触发和脉冲宽度控制信号提交给驱动器电路12，从而控制用于辐照样本1的激发光脉冲的时间位置和脉冲宽度。经由第二输出，向分析装置30提交检测器响应函数，以用于计算样本1的平均寿命。此外，分析装置30被配置为用于提供激光二极管11的二极管电流控制。
分析装置30包括计算机电路，所述计算机电路特别地运行控制软件、如lightfield操作控制软件，并与定时发生器、如集成到摄像装置21中的supersynchro定时发生器耦接。涉及脉冲宽度和/或延迟的自动化的连续增量的复杂方案可以用检测器定时电路和处理器22来实现。
选通增强摄像装置21是例如pi-max41024emd摄像装置(制造商：普林斯顿仪器公司)。pi-max4摄像装置特别是在每秒采集帧数(在10mhz的数字化的情况下在10至300范围内)和采集时间方面具有优势(在2帧没有平均的情况下在7至230ms的范围内，在2帧和10次重复的情况下65-2300毫秒，或在200帧和5次重复的情况下3到115秒，)。此外，pimax-4还具有双重图像功能，使得摄像装置能够在延迟约450ns(荧光体衰变时间受限)的情况下拍摄两帧图像。
然而，本发明不限于pi-max4摄像装置，而是可以用其它选通增强摄像装置以及包括单个或多个(<100)元件的检测器来实现。
发射寿命测量方法的实施例
为了执行本发明的发光寿命测量方法，显微镜19中的样本1被来自激发源装置10的至少一个激发光脉冲辐照。以时间分辨率检测来自样本1的发射响应、例如荧光响应。时间分辨式检测利用单个激发脉冲或例如重复率高达1mhz的激发脉冲的采样序列获得。根据摄像装置21的选通宽度，收集的时间性检测器响应函数包括来自样本1的与时间相关的发射响应或积分式与时间相关的发射响应。基于所收集的时间性检测器响应函数，如下所述计算样本1的电子激发态的平均寿命。
激发态的寿命可以解释为发射光子在δ脉冲激发后的平均到达时间。也就是说，寿命构成了激发信号和发射信号之间的延迟。本发明人已经发现，该延迟不仅可以在δ脉冲激发之后测量，而且可以在样本1的具有线性增加的或恒定数量的电子激发态的平衡激发稳态下测量。这种情况、即对这种延迟的直接测量构成了本发明的发射寿命测量方法的基础。
优选地，激发光脉冲具有线性斜坡区段2(本发明的第一实施例，参见图3)或恒定强度的脉冲区段3(本发明的第二实施例，参见图4)，从而创建样本1的平衡激发稳态，并且检测器响应函数具有如下所述的具有恒定斜率的线性响应函数区段。
根据图3，虚线表示根据本发明第一实施例的激发光脉冲的斜坡区段2。在样本1的平衡激发稳态下，样本的与时间相关的发射响应rf也具有线性响应函数区段(线性增加斜坡形状)。图3a中的绘制线rf1和rf2示出了具有2ns(rf1)和5ns(rf2)的荧光寿命的样本的两个示例。由于荧光寿命较长，发射响应rf2的线性响应函数区段与发射响应rf1的线性响应函数区段相比具有更陡的斜率和更高的最终值。发射响应rf1和rf2相对于激发光脉冲并相对于彼此移位。在图3b中用归一化的检测器响应函数进一步展示的移位与样本的平均寿命线性相关，在与具有0寿命或已知的有限寿命的参考样本进行比较时与寿命相等。
紧接着激发光脉冲2的初始上升和最终下降之后的响应函数曲线是指数的并且提供用于根据传统技术获得寿命的附加数据。
以线性响应函数区段的时间位置中的至少一个相对于所述至少一个激发光脉冲的参考时间和线性响应函数区段的斜率为基础来估算平均寿命在如下第一实施例的实例的情况下执行(时间单位：ns)。激发光脉冲(斜坡脉冲)从t1＝10开始并在60结束。rf的线性响应函数区段(约8τ至10τ)对应于t≈50至60。
rfirf[t]＝(t-t1)·sirfnrf1＝rf1·sirf/s1
s1＝rf1的斜率＝0.0016nrf2＝rf2·sirf/s2
s2＝rf2的斜率＝0.0024
sirf＝rfirf的斜率＝0.004
(irf：仪器响应函数，即τ＝0的发射响应，对应于激发光脉冲的斜坡区段2)
分析方法仅需要rf数据，并且理论上在线性响应函数区段中仅需要2个点。对于绘图(但对于寿命计算而言不需要)，可以通过将它们的斜率s1和s2(在线性响应函数区段中)的比率除以irf曲线的比率(sirf)来归一化发射响应曲线，从而得到图3b。
寿命由线性响应函数区段中的水平移位给出。
现在，给定t处的nrf1等于相应tirf处的rfirf；这同样适用于nr1。
这使得：
τ＝t-tirf＝t-t1-rf[t]/s(通过相约，仅需要原始rf值和它们在线性区域中的斜率)。实验上，t1由irf曲线确定：
t1＝t-rfirf[t]/sirf
例如在t＝55时，rf1＝0.0688和rf2＝0.096
τ1＝55-10-0.0688/0.0016＝2ns和
τ2＝55-10-0.096/0.0024＝5ns
因此确认了在本例中的寿命的输入值被再现。
在本发明的第一实施例中，记录信号(以及进而的可实现的snr)必然低于第二实施例(见下文)中的记录信号，因为必须使用窄的选通宽度进行逐点测量。尽管如此，与传统窄脉冲激发相比更高(例如3x)的信号电平仍然是可行的。
根据图4a，虚线表示根据本发明的第二实施例的激发光脉冲的具有恒定强度的脉冲区段3。扩展的矩形激发光脉冲3提供激发能量的快速增加，接着是恒定的电平，该电平维持对应于被测量的寿命的若干倍的区间。响应函数在激发光脉冲3的初始上升和最终下降之后立即呈指数曲线并且提供用于根据传统技术获得寿命的附加数据。
图4a中的绘制线rf1和rf2示出了具有2ns(rf1)和5ns(rf2)的荧光寿命的样本的两个示例。在样本1的平衡激发稳态下，样本的与时间相关的发射响应rf具有平坦的形状(图4a)，而样本的在实验中实际记录的时间积分式发射响应rfi1、rfi2分别都有线性响应函数区段(根据积分时间或选通宽度线性增加的斜坡形状，图4b)。获得在达到稳态之后的随着积分时间的线性变化(检测器装置、例如摄像装置21的检测选通宽度)，以及在该线性区域中的时间轴上的正好对应于寿命差异的分离(例如对于2和5ns信号为3ns)。
线性rfi响应的起点可以从以下数学计算得出。对阶跃(或矩形)激发的响应是指数递增函数，τ·(1-exp[-t/τ])。这个信号的积分由τ·[t-τ·(1-exp[-t/τ])]给出，这对于t＞＞τ而言减小到τ[t-τ]，t中的线性函数反映达到稳态激发态平衡。该线性响应的幅度(斜率)随着τ(以及探针浓度和光谱性质以及各种仪器参数)而变化，而线性区域的位置在时间(选通宽度)轴上移位的值等于τ，即由发射的随机性引起早先提到的延迟。
如图4c所示，所有通过它们各自的结束(平台)值归一化的rfi响应——即在激发脉冲停止之后——不管在τ和幅度上不同的组分的数量如何都表现出相同的线性响应。归一化积分响应函数的通用恒定斜率由脉冲参数(对于图4a中的矩形脉冲，斜率＝1/脉冲宽度)唯一规定，并且时间移位对应于平均τ值(或它们的差值)。这些移位也可以通过将非归一化的rfi外推到对应于0信号强度的时间轴来计算。通过将参考光学元件23集成到由线性偏振器和四分之一波长延迟器构建并集成在实验eeflim系统的显微镜19中的光学装置、如“irf(仪器响应函数)立方体”来帮助计算绝对寿命(图1)。参考光学元件从由样本玻片表面反射的激发光产生具有“零”寿命的参考信号。具有已知寿命的样本也可以提供标定参考。
参考光学元件23的一个示例在图2中示出。参考光学元件23包括线性s偏振器23.1、宽带分束器23.2(例如80％t，20％r)、四分之一波片23.3、显微镜物镜23.4、显微镜台上的反射镜23.5、线性p偏振器23.6和中性密度滤波器23.7。反射镜23.5处反射的部分提供稳定的参考信号(“0”寿命)，特别地用于绝对寿命测量。
(使用最终的信号值)归一化并不是严格必要的，因为2点使得能够确定斜率。它相对于归一化的参考信号(irf)的值可用于调整信号值以便与参考的信号值相兼容，从而使得能够计算等于寿命的时间“移位”。
以线性响应函数区段的时间位置中的至少一个相对于所述至少一个激发光脉冲的参考时间和线性响应函数区段的斜率为基础来估算平均寿命在如下第二实施例的实例的情况下进行。
矩形脉冲从t1＝10开始并且到50结束。rf的线性响应函数区段(约6τ到8τ)对应于t≈40到50。
fr＝最终rfi1＝4(＝amp1·τ1)nrfi1＝rfi1/fr
fb＝最终rfi2＝15(＝amp2·τ2)nrfi2＝rfi2/fb
firf＝最终rfiirf＝5(＝ampirf)nrfiirf＝rfiirf/firf
s1＝rfi1斜率＝0.1(＝rf1,max)nsirf＝sirf/firf
(rfiirf的归一化斜率)
s2＝rfi2斜率＝0.375(＝rf2,max)
sirf＝rfiirf斜率＝0.125(＝rfirf,max)
分析方法仅需要rfi数据，并且理论上仅需2个点，一个在线性的线性响应函数区段，另一个在最终衰减结束时。如图4c所示，通过除以相应的最终rfi值来对线性区域中的rf数据进行归一化。rf的斜率现在都是相等的。
对于每个nrf1或nrf1点(在它们各自的时间t处)都存在具有其tirf(<t)的值的相应的nirf值。因此，给定t处的nrfi1＝相应的tirf处的nrfiirf；这同样适用于nrfi2
τ＝t-tirf＝t-t1-nrf[t]/nsirf
例如在t＝45时，nrf1＝0.825，nrf2＝0.75。
nsirf＝0.025
τ1＝45-10-0.825/0.025＝2ns，以及
τ2＝40-10-0.75/0.025＝5ns
在本发明中也可以使用不同于矩形、即具有不同的形状(有限的上升时间)的脉冲形状(第三实施例)。已经为许多示例计算了用于对应的rfi曲线的响应曲线和分析数学表达式。在所有情况下，都在达到稳态后观察到rfi信号的相同行为，即如针对矩形脉冲的图4b中所示。
使用根据第二实施例的实际测量(使用具有恒定强度的脉冲区段3)，积分在激发光脉冲3之前开始，然后保持选通宽度增加(始终从相同点开始)直到激发完成(激发光脉冲结束)。使用100-200点(帧)详细定义了积分响应函数。在矩形激发光脉冲3的情况下，立即的“动态响应”(激发态的群体动力学)发生在由寿命决定的时间尺度上。经过多次寿命后，系统达到由恒定激发率(辐照度*吸收截面)和衰变率(反激发态寿命)组合所定义的稳态。由于辐照度恒定，因此发射率也恒定，由此使得积分响应随着时间的推移而线性增加。当脉冲结束(“耗尽”)时，系统会像在使用δ函数激发时那样“正常”衰变。理论上(和实践中)在线性响应函数区段中获得的两点足以确定寿命。
图5示出了使用矩形激发光脉冲的图像采集。每个面板a至d中的上部的迹线示出了监测激发光脉冲的光电二极管18的信号。下部的迹线示出了增强器选通(来自摄像装置21的监视器输出)。图5a示出了图像采集的开始。增强器选通延伸到激发光脉冲(图5b)并通过激光脉冲迁移(图5c)，直到它包围整个激发光脉冲(图5d)。封闭区域是恒定照明强度的区域。
处理后的积分响应函数如图6所示，其中示出了来自irf和三种荧光染料溶液的平均归一化rfi信号。来自irf的rfi信号是从显微镜焦平面反射的激发光获得的。荧光寿命由平行的线性响应函数区段的对应于恒定照明的周期(封闭区域；参见图4)的移位给出。插图突出显示了测量的染料罗丹明b(1.6ns)、香豆素6(2.5ns)和双阴离子荧光素(4.1ns)的水平(时间)移位(等于寿命)。
图7示出了用氟硼吡咯fl-类鬼笔环肽(bodipyfl-phallacidin)对其肌动蛋白细胞骨架染色的3t3细胞的显微图像的示例。图7a描绘了最后获取的帧(最大为200个选通宽度增量，每个0.3ns)的总积分rfi信号，并且图7b示出了τ值的图像。
本发明的在以上说明书、附图和权利要求书中的特征对于在其各种实施例中实现本发明而言具有重要意义，无论是单独的方式还是以组合或子组合的方式。