根据更广泛的方面，本发明涉及用于对全血样品的血浆级分中的物质进行光学检测的传感器。在另外一个方面，本发明涉及用于分析血液的系统，该系统包括用于对全血样品的血浆级分中的物质进行光学检测的传感器。根据本发明的另外一个方面，提供了用于对全血样品的血浆级分中的物质进行光学检测的多孔反射镜。根据本发明的又一个方面，提供了用于对全血的血浆级分中的物质进行光学检测的方法。此外，用于分析全血样品的方法包括对全血样品的血浆级分中的物质进行光学检测。
背景技术：
溶血是全血、血清或血浆样品中经常遇到的现象，并且可影响用于血液分析的实验室测试参数。术语“溶血”是指红细胞的破裂，从而引起血红蛋白和其他内部组分释放到周围流体中。溶血可由与患者病症相关的内在因素引起，或可由与患者病症无关的外在因素引起。体内溶血可因诸如自身免疫性溶血性贫血或输血反应的病理状况引起。体外溶血可因不正确的试样样品采集、试样样品处理或试样样品运输引起。具体地讲，溶血可由高压降和高剪切或延伸率引起，这可例如在样品穿过多孔过滤介质的过滤过程中发生。溶血的其他重要因素是细菌污染、压力、温度、渗透环境、ph值、与表面的接触、摩擦力、或未分离的全血样品的血液老化和储存时间。明显的溶血可在视觉上检测为血浆中的红色着色。
溶血影响血液参数分析仪中所确定的多个血液参数的测量结果。忽视血液样品中的游离血红蛋白的水平可因此误导未意识到的人，故而基于受影响的血液参数值提供错误诊断。然而，可靠地确定存在于全血样品的血浆级分中的游离血红蛋白水平迄今为止涉及一个复杂的过程，该过程需要将血浆级分与细胞组分分离以及随后分析经分离的血浆级分。此类程序是耗时的，并且在有时仅极少样品可用的情况下，诸如在连续监测婴儿血液参数的新生儿护理中，此类程序是不容许的。用于测量存在于全血的血浆级分中的组分的其他方法涉及在通过例如微流体装置中的微滤技术将血浆级分与细胞组分分离之后，在微流体装置的专用测量中分析血浆级分。例如，archibong等人发表于sensingandbio-sensingresearch3(2015),p.1-6(《传感和生物传感研究》，第3卷，2005年，第1-6页)中的最近科学论文公开了用于对已从全血样品分离的血浆级分进行光学分析的微型测量室。在这种类型的装置中，微型微流体室附接到光纤的接口。微流体室的底部由多孔膜组成，该多孔膜允许流体和化学化合物在装置内流动，与此同时滤除非期望的粒子。可在垂直入射的反射几何结构中通过单根光纤对接收滤液的微流体室的内部进行光学探测。
然而，此类基于过滤的方法在用于分析全血样品时具有若干缺点。过滤装置固有地依赖于至少滤液穿过过滤器的孔从样品进料到达滤液分析/测量室的流体流。在通流几何结构中，渗余物(此处为红细胞)逐渐堵塞过滤孔。在错流几何结构中，渗余物沿着过滤膜的表面引导，从而减轻但无法消除堵塞问题，尤其是在系统旨在重复使用的情况下(超过10-100个样品)。错流几何结构也会引起渗余物与过滤装置表面之间的摩擦和剪切相互作用。当分析全血样品时，此类基于微滤的装置中的对应压力梯度、剪切和流型往往会引起体外溶血，从而影响不同物质、特别是游离血红蛋白的测量。实际上，在一些情况下，可由此使全血样品的血浆级分中的组分的分析完全无用。此外，所公开的装置最适合作为一次性用品，而不适合持续重复使用，这是由于测量之后样品的完全洗出可能较困难或至少非常耗时且不可靠，还存在后续样品之间交叉污染的风险。在该特定类型的装置中，可带来由光学探测得出定量结果的附加挑战，原因在于过滤膜出现压力引起的变形，导致用于探测滤液的光学路径发生改变。
因此需要通过以快速且可靠的响应确定全血样品中的游离血红蛋白的水平来检测溶血的改进装置和方法。更一般地讲，需要用于以快速且可靠的响应检测全血样品的血浆级分中的物质的改进装置和方法。
本发明的目的是提供克服用于检测全血样品的血浆级分中的物质、特别是用于检测全血样品中的游离血红蛋白的已知传感器、系统和方法的至少一些缺点的改进检测。
技术实现要素：
本发明的第一方面涉及用于对全血样品中的游离血红蛋白进行光学检测的传感器，该传感器包括具有前侧面和背离前侧面的背侧面的半透明板材，其中该前侧面适于与全血样品接触；在半透明板材的前侧面处的反射层，该反射层适于将到达反射层的光从半透明板材反射出；以及被配置用于对半透明板材进行光学探测的光源和检测器，其中该光源适于照明至少孔，其中该检测器被布置为接收响应于光源的照明而从孔出射的光，并且其中该检测器适于生成代表所检测的光的信号；其中该半透明板材设置有从前侧面处的相应开口穿过反射镜延伸到半透明板材中的死端孔，其中孔的开口的横截面尺寸被设定为以便防止红细胞进入孔，同时允许游离血红蛋白进入孔。
术语“全血”是指由血浆和细胞组分构成的血液。血浆占体积的约50％-60％，并且细胞组分占体积的约40％-50％。这些细胞组分是红血球(红细胞)、白血球(白细胞)和凝血细胞(血小板)。优选地，术语“全血”是指人类受试者的全血，但也可指动物的全血。红血球占所有血细胞的总数的约90％-99％。在未变形状态下，它们的形状呈直径为约7μm且厚度为约2μm的双凹圆盘。红血球具有高度弹性，这允许红血球穿过非常窄的毛细血管，从而将红血球的直径减小到低至约1.5μm。红血球的一种核心组分是血红蛋白，该血红蛋白结合要运输到组织的氧气，然后释放氧气并结合要作为废物输送到肺的二氧化碳。血红蛋白引起红血球呈红色，并因此引起血液整体呈红色。白血球占所有血细胞的总数的少于约1％。白血球具有约6至约20μm的直径。白血球参与身体的免疫系统，例如抵御细菌或病毒入侵。凝血细胞是最小的血细胞，其长度为约2至约4μm并且厚度为约0.9至约1.3μm。凝血细胞是含有对凝血重要的酶和其他物质的细胞碎片。具体地讲，凝血细胞形成暂时的血小板栓，从而帮助封堵血管中的裂口。
术语“血浆”是指血液和淋巴液的液体部分，其占血液体积的约一半(例如，约50体积％-60体积％)。血浆不含细胞。血浆含有所有凝血因子、特别是纤维蛋白原，并且含有按体积计约90％-95％的水。血浆组分包括电解质、脂质代谢物质、例如传染病或肿瘤的标记物、酶、底物、蛋白质以及另外的分子组分。
术语“溶血”是指例如因化学、热或机械影响所致红血球的破裂，从而引起血红蛋白和其他内部组分释放到周围流体中。术语“游离血红蛋白”表示全血样品的血浆相中的血红蛋白，即，不被红细胞结合或包含的血液中的血红蛋白。全血样品中的游离血红蛋白的量是全血样品中的溶血水平的指示。根据本发明的传感器提供了允许选择性地测量全血样品的血浆相中的游离血红蛋白含量的技术。于是可基于检测器的输出，校正、标记或丢弃全血样品及从其获得的血液参数的任何测量结果。
术语“半透明”是指允许光穿过的材料特性。术语“透明”是指允许光穿过材料而不散射的材料特性。因此术语“透明”被视为术语“半透明”的子集。
传感器的核心是多孔反射镜，该多孔反射镜包括半透明板材以及施加到半透明板材的前侧面上的反射层。半透明板材含有较小的死端孔，这些孔从前侧面穿过反射层延伸到半透明板材中。传感器使用光源和检测器，所述光源和检测器被布置为对孔的内容物进行光学探测，并且生成代表全血样品中的游离血红蛋白含量的对应信号输出。
每个小孔在半透明板材的前侧面处具有开口，该小孔可通过该开口与样品空间连通。因此这些孔穿透反射层以允许这些孔与样品空间之间的流体连通。这些孔从前侧面处的相应开口沿朝向背侧面的方向延伸到半透明板材中。这些孔是“死端的”，意味着这些孔在半透明板材内终止。这些孔并不一直延续穿过半透明板材到达背侧面或到达板材内部的任何公共储存器或接收器。这些孔仅在半透明板材的前侧面处与样品空间流体连通。应当注意，在一些实施方案中，死端孔可为十字形，并且因此至少一些孔可彼此连接，从而形成x形、y形、v形或类似的互连形状。构型被等同地视为死端，因为这些孔仅从前侧面填充并且即使这些孔彼此交叉，在操作下也不会发生穿过这些孔的显著净质量运输。通过适当地设定前侧面处的孔的开口的尺寸，可以防止多孔反射镜的前侧面上的全血样品的红细胞进入孔，同时允许全血样品的血浆中的相关组分进入孔，其中相关组分是存在于全血样品的血浆相中的待使用传感器测量/检测的物质。具体地讲，游离血红蛋白是相关组分。
在操作下，半透明板材的前侧面与全血样品接触。半透明板材中的小孔通过前侧面中的开口与全血样品连通。孔开口的尺寸被设定为选择性地提取全血样品的血浆相的子样品。红细胞不可穿过半透明板材的前侧面上的开口进入孔。正如所述，这些孔是死端的，仅与半透明板材的前侧面连通，即，提取子样品以在孔内进行光学探测，并且在测量之后再次通过半透明板材的前侧面中的相同开口排出子样品。子样品体积对应于孔的总内体积。未发生任何滤液穿过含孔层的过滤和净质量运输-既未进入任何公共滤液接收器，也未到达任何滤液出口。然后仅对孔中所含的子样品进行光学检测。反射层将半透明板材中的光学探测区域与含有全血样品的样品空间进行光学分离。通过将探测区域与样品空间进行光学分离，可有效抑制全血样品的完整红细胞向探测信号的任何分布。因此该测量特定于全血样品中的游离血红蛋白的含量。
可以以任何合适的方式将具有相关组分的代表性含量的该较少子样品转移到孔。然而，应当小心，不要因转移机制引起溶血。这些较小的死端孔允许借助于毛细作用力和/或扩散通过前侧面中的开口从全血样品中非常有效而快速地提取用于光学探测的子样品。
在典型的操作模式中，在使半透明板材的前侧表面与冲洗流体接触之后，使前侧面与待分析的全血样品接触。由此，这些孔“充注”有与全血样品相容的预充液体，特别是与血浆相相容的液体，诸如通常用于血液分析仪中的冲洗、校准和/或质量控制目的的水性溶液。用于例如全血分析仪系统中的洗出的典型冲洗液可用作此类液体。冲洗液是包含与人类血浆相对应的浓度的k+、na+、cl-、ca2+、o2、ph、co2和(hco3)-的水性溶液。下面进一步给出了通常用于冲洗、校准和/或质量控制目的的合适溶液的非限制性示例。然后当使全血样品与充注有血浆相容性液体的前侧表面进行接触时，借助于相关组分的扩散以非常有效而温和的方式将全血样品的血浆相中的组分的代表性子样品提取并转移到预充孔中。具体地讲，孔中的全血样品与参考液体之间的游离血红蛋白的含量的任何浓度梯度驱动扩散性转移，从而在孔中产生具有代表全血样品中的游离血红蛋白浓度的游离血红蛋白浓度的子样品。
在另一种操作模式中，还可设想使干传感器的前侧面与全血样品直接接触。进一步优选地在该操作模式中，孔的内表面是亲水性的，从而借助于毛细作用力在半透明板材的前侧面处从全血样品提取子样品到孔中。当在该模式中操作传感器时，可经由批次校准进行校准，因为由相同批次的多孔膜材料制成的传感器往往具有相等的灵敏度(当使用由来自形成半透明板材的相同批次的多孔膜材料的不同片制成的传感器对相同样品进行测量时，具有相等的光吸收)。或者，半透明板材的孔可含有吸收特性不同于血红蛋白的校准染料。校准染料可用于对光学探测信号进行归一化/校准，同时可与待检测/测量的血浆中的物质(例如，游离血红蛋白)在光谱上区分开。由于校准染料将不存在于实际样品中，校准物染料将在测量期间扩散出传感器，与此同时游离血红蛋白扩散到传感器的孔中。通过在获取样品之前和之后对这些孔进行光学探测，可由校准基准与样品物质信号的比较来形成待检测的物质(例如，血红蛋白)的定量量度。
可方便地从半透明板材的背侧面，或更一般地讲，从面向半透明板材的反射层的侧面对孔的内容物进行光学探测，其中反射层将包含孔的光学探测区域与接触半透明板材前侧面的全血样品进行光学分离。反射层适于将到达反射层的光从半透明板材的内部反射出，从而防止探测光到达反射镜的前侧面处的全血样品并与反射镜的前侧面处的全血样品相互作用。因此仅选择性地对孔内的子样品进行光学探测。
将入射光引导/导向到光学探测区域以确保光穿越这些孔并与其中的子样品相互作用。优选地，以相对于反射层的平面上的表面法线的倾斜入射将探测光发送到探测区域中，以确保光穿越填充有待探测的流体的孔，从而确保光学相互作用路径长度最长。
响应于照明而从孔出射的光已与孔中的子样品相互作用，从而传送有关子样品的信息。随后可针对该信息分析出射光和/或代表出射光的信号，以便产生代表全血样品中的游离血红蛋白含量的值。分析可包括对出射/所检测的光进行光谱分析，和/或信号/数据处理，例如以便将所获得的信号与校准/参考样品上获得的信号进行比较，以便进行噪声过滤，以便应用校正，以及以便去除伪影。
在特别有利的实施方案中，光学探测的是游离血红蛋白引起的血浆的微红色着色，例如通过使用光谱分辨的吸光度测量，或通过在指示游离血红蛋白在液体子样品中的存在的光谱范围内(诸如在波长380nm-450nm的光谱范围内，诸如在波长500nm-600nm的光谱范围内，或在约416nm处)在预定带宽内测量光谱积分吸光度。
进一步根据本发明的传感器的一个实施方案，孔的开口的横截面尺寸为约1μm或更小、约800nm或更小、优选地约500nm或更小、或甚至约400nm或更小，和/或在沿着孔的轴向方向上的孔的长度小于100μm、小于50μm、优选地小于30μm、或约25μm。
通过使用在半透明板材的前侧面的平面中具有最大横截面尺寸为约1μm或更小、或优选地在诸如约800nm或更小、诸如约500nm或更小、或甚至约400nm或更小的亚微米范围内的开口的孔，防止了包括红血球、白血球和凝血细胞(血小板)在内的任何细胞组分进入孔。
还令人惊讶的是，与更大的孔相比，具有横截面尺寸为约500nm或更小的开口的孔具有提高的灵敏度，所述更大的孔诸如为具有横截面尺寸为约800nm或以上的开口但具有相同总孔体积/体积孔隙度的孔。例如，与具有相同总孔体积的800nm孔的(25μabs/(mghb/dl))相比，400nm孔的吸光度测量的灵敏度可提高几乎两倍(46μabs/(mghb/dl)
最优选地，孔具有最小开口且具有相应最小孔体积，从而允许有效提取足够大的子样品，该子样品仍可以以可接受的信噪比进行探测。有利地，孔具有为约30nm或更大、或50nm或更大、或100nm或更大、或约200nm或更大的开口。
合适的孔可例如由具有所谓轨迹蚀刻的孔的透明聚合物膜制成，这些透明聚合物膜类似于可购自公司it4ip(it4ips.a./avenuejean-etiennelenoir1/1348louvain-la-neuve/belgium)的那些，修改的地方是这些孔在一端处封闭。可例如通过以下方式封闭膜中的贯穿孔：将背衬片材层合到多孔膜的背侧面，或使离子减速使得离子轰击轨迹及因此沿着这些轨迹蚀刻的孔终止于透明聚合物膜内而形成死端孔。该膜通常由坚硬透明元件支撑以便为半透明板材提供足够的机械强度。
进一步根据本发明的传感器的一个实施方案，给定体积的含孔半透明板材的孔隙度介于50体积％与5体积％之间，介于30体积％与10体积％之间，或为约15体积％。
这些孔形成半透明板材中(或半透明板材的给定区域中)的孔隙度，且具有分布有孔的开口的对应前侧表面积。可根据由孔在半透明板材中形成的空隙的体积(即，孔体积)来表征孔隙度，其中孔体积是指孔所穿透的半透明板材的体积。该体积在此处被定义为分布有孔的前侧面积与向半透明板材中移位到孔在半透明板材中的最大穿透深度(如在与半透明板材的前侧面垂直的轴向方向上可以看出)的相同平行面积之间的体积。
除此之外，还可根据积分孔体积来表征孔隙度，该积分孔体积等于可用于光学探测的子样品体积。孔体积可方便地表示为等效孔体积深度delta，该等效孔体积深度delta是涉及分布有孔开口的对应前侧面积的孔体积。因此，半透明板材的孔隙度可按如下方式换算为等效孔体积深度delta。在给定前侧面积a内具有开口的孔具有总孔体积v。然后将等效孔体积深度计算为总孔体积除以给定前侧面积：delta＝v/a。
有利地根据一些实施方案，等效孔体积深度delta小于20μm、或小于15μm、或小于10μm、或在3μm至5μm的范围内，其中等效孔体积深度delta被定义为孔总体积v除以分布有孔的开口的前侧面积a。从而，获得具有代表性浓度的相关组分的较少子样品。需要较少子样品体积来促进快速子样品交换，从而减少传感器的响应时间以及采用传感器进行的测量的周期时间。还需要较少子样品体积以便避免在与半透明板材的前侧面接近的全血样品中的血浆级分的边界层的耗尽效应。否则可在较少的静置样品中发生此类耗尽效应，其中例如如果等效孔体积深度超过临界值，则红细胞可妨碍相关组分从全血样品的体积朝向半透明板材的前侧面处的边界层的有效扩散交换。
优选地，等效孔体积深度delta为至少1μm、或者至少2μm、或在3μm至5μm的范围内，其中等效孔体积深度如上所定义。需要更大的子样品体积来实现更好的信噪水平，这是由于更大的子样品体积对有关血浆中的相关组分的光学探测信息有贡献。
进一步根据一些实施方案，对于在1μm至20μm范围内、优选地在2μm至10μm范围内或约4μm-5μm的等效孔体积深度delta而言，发现了一方面在较少静置全血样品中减少响应时间、减少周期时间和/或避免耗尽效应与另一方面所要求或所需的信噪比之间的有效折衷。
有利地根据一个实施方案，半透明板材由附接到半透明板材的背侧面的半透明背衬支撑。从而，实现了增强的机械稳定性。
进一步根据本发明的传感器的一个实施方案，孔的内壁表面是亲水性的，例如涂覆有亲水性涂层。从而，实现了液体在干孔中的有效毛细驱动填充。此外，亲水性涂层防止某些疏水物质诸如疏水染料、血红蛋白和其他蛋白质沉积在孔内，否则将导致传感器的逐渐结垢，从而难以用水性溶液洗出。
进一步根据本发明的传感器的一个实施方案，光源被配置用于从半透明板材的背侧面提供倾斜入射的照明光束，其中照明角度被定义为入射光束相对于由半透明板材的前侧面限定的参考平面的表面法线的角度。从而，实现了增加的光学相互作用长度，因此在入射光离开探测区域以便供检测器检测之前增强了入射光与孔的内容物的相互作用。此外，防止了探测光经过孔开口穿透到全血样品中，这是由于减小了孔开口的表观横截面，以及增加了向探测区域中的散射传播光，而不是穿过孔开口进入反射层的另一侧面上的样品空间。
进一步根据本发明的传感器的一个实施方案，检测器被配置为收集从半透明板材的背侧面倾斜出射的光，其中检测角度被定义为出射光朝向检测器的传播相对于由半透明板材的前侧面限定的参考平面的表面法线的角度。检测器被配置为收集响应于光学探测装置的光源的照明而出射的光。检测从半透明板材的背侧面倾斜出射的光减少了对来自从全血样品出射并穿过反射层漏回到探测区域中的光的所检测的信号的贡献。
进一步根据本发明的传感器的一个实施方案，入射平面和检测平面在表面法线处相交以围成至少0度且小于180度、优选地小于160度、优选地小于130度、或优选地约90度的方位角，其中入射平面由照明光束的方向和参考平面的表面法线跨越，并且其中检测平面由出射光朝向检测器传播的方向和参考平面的表面法线跨越。由此，减少了对在穿过探测区域之前在光学接口处部分反射出的眩光的所检测的信号的贡献。未与探测区域中的子样品相互作用的光的此类眩光不包含相关信息，并因此不利于信噪比。
光学探测光可由任何合适的光学探测装置来执行。这种光学探测装置可包括仅将一束光导向到半透明板材的背侧面并且将光学检测器的输入导向到经照明的区域。光学装置可包括另外的光学元件，这些另外的光学元件改善探测光向半透明板材中的耦合并且改善从半透明板材出射的光向检测器输入中的耦合。此类光学元件可包括直接附接/胶合到半透明板材的背侧面的一个或多个棱镜和/或透镜装置。优选地，耦合光学器件适应光学探测的“反射”性质，其中入射的探测光和所检测的出射光保持在反射层的相同侧面上。可在增强探测光与孔的光学相互作用方面寻求进一步改进，例如通过将探测光在第一端处耦合到半透明板材中，迫使探测区域中的光基本上在与半透明板材的前侧面平行的方向上沿着反射表面传播并穿越孔，并且从半透明板材的另一端(其可在第一端的横向或相反方向)收集出射光。
进一步根据本发明的传感器的一个实施方案，半透明板材设置有另外的反射元件，这些另外的反射元件布置在孔内、其口部中、与半透明板材的前侧面处的开口相邻。附加反射元件作为反射涂层施加在孔的内壁上，附加反射元件从每个孔的开口处开始并延伸到孔中。然而，仅覆盖与孔的开口接近的口部。在孔的开口周围提供附加反射元件改善了探测光与样品室的光学分离，从而防止了对来自样品室的全血样品中的红细胞的探测信号的错误贡献。反射涂层可为如下所讨论的任何合适的金属涂层。可在与反射层覆盖半透明板材的前侧面相同的步骤中产生附加反射元件。
进一步根据本发明的传感器的一个实施方案，另外的反射元件作为仅覆盖开口附近的孔的口部的一部分圆周的反射涂层提供，其中该部分为约70％或更小，并且优选地约50％或更小。通过仅部分覆盖孔的圆周，在每个孔中提供具有面向孔内部的凹形反射表面的小反射器。该部分覆盖可例如通过金属层的定向沉积来产生，其中半透明板材的前侧面相对于沉积方向倾斜。半透明板材的前侧面的平面中的孔的开口充当阴影掩模。阴影掩模仅允许阴影掩模的口部区域中(即，与开口接近)的孔的圆周内壁的一部分上的沉积。从而可产生全在相同方向上取向的小凹面反射镜元件的阵列。
当从凹形侧面照明这些小反射镜元件时，所得的出射光在优先方向上导向。通过将检测器放置在该优先方向上，实现了与其他方向相比以及与没有此类附加小定向反射镜元件的实施方案相比经改善的信噪比。
根据具有小反射镜元件(即，具有带有定向特性的另外的反射元件)的一些实施方案，与具有无定向特性的附加反射元件的实施方案相比，观察到出射光的强度增大约3倍。除此之外，已令人惊讶地观察到，当使用在其口部处施加到孔的内表面上的小反射镜元件时，例如在探测吸光度时，会发生相关信号进一步增强约50％或更大。因此这引起了信噪比令人惊讶地总体改善至少约4至5倍。
应当注意，也在使用另外的反射元件时，仍然需要半透明板材的前侧面处的反射层，以便确保包含孔的半透明板材中的光学探测区域与含有全血样品的样品室的光学分离。也需要半透明板材的前侧面上的反射层，例如以便同时从背侧面照明和检测。
通常，小反射镜元件相对于中心反射镜平面是对称的。有利地，入射平面(如由入射光束确定)和检测平面(如由检测方向确定)也相对于该中心反射镜平面对称地布置。根据一个简化实施方案，入射平面和检测平面重合，并且平行于小反射镜元件的中心反射镜平面。
有利地根据一个实施方案，反射层和/或另外的反射元件由金属制成。可以相对具有成本效益又受控良好的方式施加具有足够反射率的此类金属涂层。
有利地根据一个实施方案，反射层由铂、钯或者包含作为主要组分的铂或钯的合金制成。这些材料在与游离血红蛋白的检测(例如，通过吸光度探测)相关的电磁谱的光谱范围(深紫色至蓝色)内表现出良好反射率。此外，这些材料具有生物相容性，不会例如产生人工溶血。此外，这些材料具有化学稳定性并且处于全血样品的化学环境中。
或者，根据一些实施方案，反射层可由银或铝制成。进一步有利地根据一些实施方案，面向样品体积的反射层的表面由附加钝化层包封，从而提高了装置的寿命，特别是在使用银或铝作为反射层的材料时。合适的钝化层可由例如sio2薄层制成，该薄层优选地被制成透明的并且必须足够薄以便不阻塞孔的开口。这些材料还可提供相关光谱范围(红色)内的良好反射率，在环境中具有生物相容性和化学稳定性。
有利地根据一个实施方案，反射层的厚度在10nm-100nm之间，具体取决于所使用的金属。这种层厚度允许通过蒸镀技术施加反射层，而不会堵塞半透明板材的前侧面处的孔的开口。与此同时，层厚度必须足以提供传播到样品体积的光的足够衰减，以便确保探测区域与含有全血样品的样品体积之间的正确光学分离。优选地，在检测的光谱范围内，即在由其形成代表相关血浆组分的信号的光谱范围内，诸如在380nm至700nm、380至450nm的范围内、或在约416nm处，透射光小于5％、小于1％或甚至小于0.1％。
有利地根据一个实施方案，检测器包括分光光度计，并且光学探测装置被配置用于从半透明板材中的探测区域出射的光的分光光度分析。这允许在从探测区域中的子样品出射的光中分辨一种或多种相关组分的光谱特征。
进一步根据特别有利的实施方案，光学探测装置被配置用于测量吸光度。从而，使用相对简单的光学设备获得令人惊讶的显著信号。这允许传感器与更复杂的分析设备(诸如血液分析仪系统)轻松集成在一起。
有利地根据一些实施方案，传感器或包括传感器的血液分析系统还包括处理器，该处理器被配置用于将检测器所生成的信号与预定校准基准进行比较，以形成全血样品中的游离血红蛋白水平的定量量度。
进一步有利地根据一些实施方案，在基于染料的校准溶液，诸如包含酒石黄染料的水性溶液上获得校准基准。优选地，基于染料的水性溶液由添加有校准物染料诸如酒石黄的典型冲洗液制备。
有利地根据一些实施方案，包括传感器的血液分析系统还包括血氧定量测量系统，其中血氧定量测量系统的结果用作处理器的输入，从而形成全血样品中的游离血红蛋白水平的定量量度。附加血氧定量测量系统可被配置为附加测量单元，该附加测量单元与包括根据任何上述实施方案的游离血红蛋白检测器在内的测量单元并联或串联地操作。血氧定量测量通常执行使所接收的全血样品溶血的步骤。该溶血可以以任何合适的方式例如以机械或化学方式来实现。优选地，该溶血借助于施加到全血样品的超声波以机械方式来实现。原本浑浊的全血样品此时变透明，并且测量溶血后的样品的吸收光谱。根据该吸收光谱，可确定多个参数，这些参数可用作解释/分析本发明的游离血红蛋白检测传感器所生成的信号的第一手信息。因此操作血氧定量测量系统可包括确定全血样品中存在的氧合状态、血红蛋白类型、胆红素水平以及任何医用染料的存在和/或水平。然后包括所确定的组成和/或浓度的血氧定量输出可用于使用本发明的传感器针对干扰(例如，胆红素干扰和/或医用染料干扰)来校正游离血红蛋白的测量结果。因此游离血红蛋白传感器与血氧定量测量系统的组合允许对所检测的信号进行更具选择性的分析，从而提高灵敏度。
根据本发明的另外一个方面，用于分析全血样品的系统包括(a)样品室，该样品室具有用于进料和排出全血样品的入口端口和出口端口；(b)第一检测器，该第一检测器适于提供代表全血样品中的游离血红蛋白水平的第一信号；和(c)一个或多个另外的检测器，每个另外的检测器适于提供相应另外的信号，该相应另外的信号代表全血样品的血液参数；其中第一检测器和另外的检测器可操作以从相同全血样品获得第一信号和一个或多个另外的信号，其中第一检测器被配置为根据本文所公开的任何实施方案的用于对游离血红蛋白进行光学检测的传感器。
优选地，用于分析全血样品的系统包括处理器，该处理器被配置为基于第一信号来提供关于另外的信号中的一个或多个信号的附加输出。有利地，该附加输出是另外的信号相对于游离血红蛋白的所检测水平的校正、指示全血样品中的游离血红蛋白水平的标记、和/或丢弃另外的信号中的一个或多个信号的指令。因此处理器适于基于从第一信号得出的游离血红蛋白水平来校正、标记或丢弃从一个或多个另外的信号中的至少一个另外的信号得出的测量结果。具体地讲，另外的信号可指示受溶血影响的任何血液参数，诸如k+、na+、ca2+、mg2+、乳酸脱氢酶、铁、脂肪酶、α-谷氨酰转移酶、肌酸激酶、天冬氨酸转氨酶或碱性磷酸酶的浓度。
本发明的又一个方面涉及用于对全血样品中的游离血红蛋白进行光学检测的多孔反射镜，该反射镜包括半透明板材，该半透明板材具有前侧面和背离前侧面的背侧面，其中该前侧面适于与全血样品接触；和反射层，该反射层施加到半透明板材的前侧面上，该反射层适于将到达反射层的光从半透明板材反射出；其中半透明板材具有穿透反射层并且从前侧面朝向背侧面延伸的死端孔，其中每个孔具有半透明板材的前侧面中的相应开口，并且其中孔的开口的横截面尺寸被设定为以便防止红细胞进入孔，同时允许血红蛋白进入孔。
如上文已经讨论，利用该设计，实现了仅仅通过使多孔反射镜的前侧表面与全血样品接触，就可从前侧面在孔中填充包含代表性量的血浆的相关组分的子样品，并且由此提取的子样品可方便地与全血样品分别进行光学探测。相关组分是存在于全血样品的血浆相中且要使用传感器测量/检测的物质。可借助于扩散和/或毛细作用力将血浆相的代表性子样品从全血样品提取并转移到孔中。也如上文所讨论，孔优选地预充有与血浆相相容的液体，诸如通常用于血液分析仪中的冲洗、校准和/或质量控制目的的水性溶液。下面进一步给出了合适的溶液的非限制性示例。在孔中充注此类已知的液体允许通过单独的扩散将代表血浆中的相关组分的子样品提取到孔中。
有利地根据本发明的一个方面，提供了对全血样品中的游离血红蛋白进行光学检测的方法，如下面所详述。该方法至少实现了与上文针对用于检测游离血红蛋白的传感器或包括这种传感器的系统的相应实施方案所讨论的相同优点。
根据一些实施方案，对全血样品中的游离血红蛋白进行光学检测的方法包括以下步骤：提供如上所公开的多孔反射镜；使多孔反射镜与参考液体接触以便在孔中填充参考液体；使多孔反射镜的前侧面与全血样品接触；等待一段扩散时间以允许血浆中的组分从样品室向孔中的扩散达到稳定；从背离样品室的反射层的侧面对孔内的液体进行光学探测；以及基于光学探测的结果，确立全血样品的游离血红蛋白水平。优选地，参考液体是与全血样品相容、特别是与其血浆级分相容的水性溶液，诸如用于冲洗、校准和/或质量控制的液体。在一些实施方案中，可设想省略在引入全血样品之前使反射镜的前侧面与参考液体接触的步骤。然而，包括该步骤允许纯粹扩散性的子样品提取，这是非常有效的并且引起令人惊讶的快速检测响应以及令人惊讶的短测量周期时间。最有利地，通过因所提取的子样品中存在代表性量的游离血红蛋白而引起的颜色变化，在孔中对游离血红蛋白进行光学检测。
有利地根据一些实施方案，光学探测包括使用探测光从背侧面照明半透明板材，并且执行作为对探测光的光学响应而从半透明板材的背侧面出射的光的分光光度分析。
有利地根据一些实施方案，光学探测是测量吸光度。
有利地根据一些实施方案，该方法还包括将光学响应与预定校准基准进行比较以形成全血样品中的游离血红蛋白水平的定量量度的步骤。
进一步有利地根据该方法的一些实施方案，在基于染料的校准溶液诸如包含酒石黄染料的水性溶液上获得校准基准。优选地，基于染料的水性溶液由添加有校准物染料诸如酒石黄的典型冲洗液制备。
进一步有利地，本发明的一个方面涉及分析全血样品的方法，其中该方法包括对如上所公开的全血样品的游离血红蛋白水平进行光学探测；在相同全血样品上，测量存在于全血样品中的另外的组分；以及基于全血样品的溶血水平来校正、标记或丢弃另外的组分的测量结果。
附图说明
将结合附图更详细地描述本发明的优选实施方案，这些附图示出如下视图：
图1示意性地示出了根据一个实施方案的处于操作条件下的传感器装置，
图2示意性地示出了根据一个实施方案的具有附加反射元件的孔的横截面细部；
图3a/b示意性地示出了根据另外一个实施方案的具有附加反射元件的孔的细部的两个横截面侧视图；
图4示意性地示出了测量单元的横截面侧视图；
图5示出了图4的测量单元的顶部正视图；
图6a/b示意性地示出了根据另外一个实施方案的具有透明背衬的棱镜状外部的测量单元的两个横截面侧视图；
图7示出了图6a的测量单元的顶部正视图；
图8示出了坐标图，该坐标图示出具有不同游离血红蛋白含量的样品的吸收光谱的示例；
图9示出了坐标图，该坐标图示出根据本发明的一个实施方案使用传感器获得的游离血红蛋白测量结果与使用参考方法得出的测量结果进行比较的示例；
图10示出了坐标图，该坐标图示出对干扰物质的响应的示例；
图11示出了坐标图，该坐标图给出在较长时间段内的校准灵敏度的稳定性的示例；
图12示出了坐标图，该坐标图示出检测器的启动阶段中校准灵敏度的动态；并且
图13示出了坐标图，该坐标图示出使用染料作为分光光度测量的校准和质量控制基准的示例。
具体实施方式
图1示意性地示出了根据一个实施方案的在传感器装置中操作的多孔反射镜1的剖视图。多孔反射镜1包括具有前侧面3和背侧面4的半透明板材2。前侧面3设置有反射层5。半透明板材2还包括死端孔6，这些死端孔从前侧面3处的开口7穿过反射层5延伸到半透明板材2的本体中，这些死端孔在此终止。虽然如图1的示意图中那样示出，但孔不必垂直于前侧面3或彼此平行。在操作下，具有孔开口7的多孔反射镜的前侧面3与全血样品99接触。全血样品具有包含红细胞98的细胞级分以及包含待检测的相关组分(此处为游离血红蛋白96)的血浆级分97。孔6的开口7的横截面尺寸被设定为以便防止红细胞98进入孔6，同时允许血红蛋白96进入孔6。
孔6可预充有冲洗溶液8，该冲洗溶液与全血样品99相容，特别是与血浆级分97相容。当全血样品99接触具有预充孔6的多孔反射镜1的前侧面3时，发生游离血红蛋白96向孔6中的扩散性转移，从而确立孔6内具有代表全血样品99中的游离血红蛋白96的浓度的游离血红蛋白96的浓度的子样品。
用于对孔6进行预充的冲洗溶液8可为与全血样品99相容的任何水性溶液。合适的冲洗溶液包括通常用于血液参数分析仪中的冲洗、校准和/或质量控制目的的那些冲洗溶液。此类溶液组合物通常包括有机缓冲液、无机盐、表面活性剂、防腐剂、抗凝血剂、酶、着色剂以及有时的代谢物。这提供了具有如下表1中给出的近似浓度的以下物质。
表1
使用具有光源10和检测器20的光学探测装置从背侧面进行光学检测。光源10从背离全血样品99的反射层5的侧面照明半透明板材2的多孔部分中的探测体积。探测光11是与孔6中的子样品9相互作用的倾斜入射光束。出射光21由检测器20检测，该检测器也被布置为以倾斜角度观察探测区域。检测器20生成代表出射光的信号，特别是因与孔6中的子样品9相互作用而含有有关游离血红蛋白96的浓度的信息。处理所生成的信号允许形成全血样品中的游离血红蛋白水平。使用校准时，全血样品中的游离血红蛋白水平可为定量的。用于以下示例中的所有测量的光学探测技术使用电磁谱可见范围内(例如波长在约380nm与700nm之间、在约380nm与450nm之间的范围内或为约416nm)的光谱分辨的吸光度测量。
测量周期的最后是使用冲洗溶液(诸如用于对孔6进行预充的冲洗溶液8)洗出全血样品。从而，使传感器装置重新初始化并准备好接收下一个全血样品。举例而言，表2给出了在暴露于包含5％完全溶血的全血(即，约1000mg/dl)的测试样品之后极快恢复的指示。
表2
从表2中可以看出，包括两个传感器(以下示例中也称传感器1和传感器2)的测量单元在测量具有1000mg/ml特别高的浓度的游离血红蛋白的样品之后完全恢复，并且在开始冲洗后的1分钟内或甚至更快准备好接收下一个样品。
图2示出了根据另外一个实施方案的多孔反射镜的细部。示意性地示出了半透明板材2中的单个孔6。孔6包括通过将反射材料沉积到孔6的开口7处的口部中而产生的反射套环51的形式的附加反射元件。
图3a和图3b示出了根据又一个实施方案的多孔反射镜的细部的两个剖视图。同样，示意性地示出了半透明板材2中的单个孔6。孔6包括通过将反射材料定向沉积到孔6的开口7处的口部中而产生的小反射镜元件52的形式的附加反射元件，其中该反射镜仅覆盖开口/口部的一部分圆周，如图3a、b的两个视图中所指示。从孔的内部观察，小反射镜元件52是凹形的。通过合适的反射材料(优选地金属)在倾斜多孔半透明板材2上的定向蒸镀产生小反射镜元件，使所有反射镜元件52同时形成并且指向相同方向。从而，当探测光11从小反射镜元件52的凹侧面入射时，实现了出射光21的优先方向。因此，显著改善了由在优先方向上出射的光生成的信号的信噪比。
下面给出的所有实施例均已使用具有通过如下方式获得的附加小反射镜元件的传感器构型进行测量：以相对于前侧面3上的表面法线的25度倾斜角的蒸镀方向将pd定向溅射蒸镀到半透明聚合物板材2的前侧面上，直到获得半透明板材2的前侧面3上厚度为30nm的反射层5。半透明板材2由半透明的、优选地透明的聚合物材料制成，并且包括具有基本上圆形横截面的轨迹蚀刻的死端孔6。这些孔具有开口7，直径为400nm，深度为25μm，并且以15体积％的孔隙度分布。合起来，给定前侧表面积a内分布的孔具有总体积v并且具有等效孔体积深度delta＝v/a。对于用于以下给出的示例中的测量的以上指定样品而言，等效孔体积深度delta为约4μm。
图4和图5示意性地示出了测量单元100，该测量单元包括具有多孔反射镜1的传感器装置，该多孔反射镜的前侧面3具有面向测量单元100内的样品体积101的孔开口7。样品体积与流体输入端口和输出端口(未示出)连通，以便进料和排出样品并且执行充注、冲洗和洗出步骤。多孔反射镜的背侧面由透明背衬载片30进行机械稳定，该透明背衬载片也充当光从多孔反射镜的背侧面4进入探测区域的窗口。使用如上文结合图1所述的具有光源10和检测器20的装置进行光学探测，其中探测光束和检测方向以与多孔反射镜1的前侧面3的平面上的表面法线所成的相应角度倾斜。此外，如图5最佳所示，入射探测光11和检测21的平面优选地以小于180度的角度彼此相交以避免眩光效应，并且优选地以约90度或以下的锐角相交。在下面给出的实施例的测量中，入射探测光11和出射光21检测的平面相对于与小反射镜元件52的对称平面平行的方向对称地布置。
图6a、图6b和图7示意性地示出了与多孔反射镜1的半透明板材2的背侧面4直接接触的透明背衬载片31。当入射探测光11进入在60°棱镜32处具有表面的半透明板材2的背侧载片4时，空气与聚合物之间的折射率偏移不会影响入射探测光11，并且光进入半透明板材2的孔6(未示出)而不改变光的角度，且出射光21到达检测器20。图6b示出了在出射光21到达检测器20之前入射探测光11可在透明背衬载片31中反射若干次。此外，如图7最佳所示，入射探测光11和出射光21的平面优选地以小于180度的角度彼此相交以避免眩光效应，且优选地以约90度或以下的锐角相交，并且棱镜32不会影响入射探测光11，也不会影响出射光21。
实施例
下面参见图8至图13，来自测试运行测量的数据作为实施例给出，这些实施例示出了根据本发明的一个实施方案的传感器的性能的不同方面。
用于这些实施例的实验的传感器由透明petp膜制成，总厚度为49μm，且设置有单面轨迹蚀刻的线性孔。孔具有25μm的孔深度以及0.4μm的孔径，且经过亲水性pvp处理。孔面密度为1.2e8/cm^2。因此孔为死端的，在petp膜的一个侧面处具有开口，且基本上在进入充当半透明板材的petp膜的一半处终止。使用钯以25度的角度和30nm的近似层厚度对膜(半透明板材)的多孔侧面进行溅射涂覆。这给出了膜(半透明板材)的多孔前侧面上的金属涂层以及孔内部的一个侧面上的小涂层，从而在与其朝向前侧面的开口相邻的孔的口部中形成小凹面反射镜。使用双面胶带将溅射多孔petp膜层合到定制比色杯，使得孔中的小反射镜的凹侧面指向来自光源的光导与来自分光计输入的光导之间的一半处。将一滴大约10μl的硅橡胶移取到膜上，然后将盖玻片固定到膜的背侧面作为传感器膜(半透明板材)的机械背衬。将传感器安装在试验台中以便自动处理液体、时间间隔和数据采样。数据采集持续大约3s并且延迟直到样品采集后的14s。
试验台配备有作为光源的两个发光二极管(紫色和“白色”led)以及作为检测器的小型分光计。小型分光计中的标准狭缝已被更换为125μm狭缝以便增加光和灵敏度。由于该测量是反射测量，光源和检测器均布置在多孔膜的背侧面(无孔侧面)上。膜的多孔金属涂覆侧面定位在测量室的内部上，因此反射镜和孔直接暴露于室中的样品。通过公共光纤光导引导来自这两个发光二极管的光，该公共光纤光导在端部处具有透镜，以便将光准直为多孔反射镜膜的小光斑(大约2mm×2mm)。参见笛卡尔坐标系，膜的平面(半透明板材的前侧面)可被限定为坐标系的zx平面。光以相对于y轴(即，zx平面的表面法线(且在坐标系的yz平面中))的45°角进入膜外表面(半透明板材的背侧面)。检测器以相对于y轴的60°极角定位，并且相对于yz平面转动一定方位角，该方位角相对于光源的入射平面(例如，在yx平面中)成90°。光入射和检测方向相对于y轴的相对较高角度使得血红蛋白的检测灵敏度提高，因为所收集的光已穿过孔中的子样品的更大长度。
通过以指定的混合比率混合溶血和未溶血的人类血液来制备样品。通过在-80℃下冷冻30分钟来制备溶血的血液。通过用干扰物在血浆中掺加到指定值来制备基于血浆的干扰溶液。通过在1500g下离心15分钟来产生血浆。作为参考，还在perkinelmerlambda19uv-vis分光计上测量所测试的所有全血样品的离心所得血浆的吸收光谱。
光谱图8示出了具有不同游离血红蛋白(hb)浓度的四个样品的光谱分辨的吸光度数据。在约416nm的波长处，观察到明显的峰值，其中不同样品的吸光度最大值明显根据其游离血红蛋白含量线性地缩放。在416nm峰值处选取从顶部到底部的吸光度轨迹得出，样品的标称浓度为200mghb/dl(cal1)、100mghb/dl(0.4％溶血的全血)、50mghb/dl(0.18％溶血的全血)以及约4mghb/dl(全血)。
由具有多孔反射镜的光学传感器(传感器1、传感器2)得出的游离血红蛋白含量的值的线性缩放和正确校准已通过使用参考方法测量相同样品来验证(图9)。参考方法涉及通过离心将全血的血浆级分与细胞级分分离，并且通过对分离的血浆相进行分光光度测量来确定游离血红蛋白的相应浓度。参考分光光度技术也是使用perkinelmerlambda19uv-vis分光计得出的光谱吸光度测量结果。使用两个标称相同的传感器装置(即，传感器1和传感器2)得出的独立测量结果被示出为大部分重合的。已将每个传感器的相应线性趋势线添加到坐标图。这些趋势线强调了使用根据本发明的传感器1和2得出的游离血红蛋白浓度值的高精度和可靠性。
图10示出了使用根据本发明的传感器得出的游离血红蛋白测量结果对抗可存在于血浆中的其他组分的干扰的稳健性。同样，并排示出了来自传感器1(实心柱)和传感器2(空心柱)的数据。为确定干扰而测量的四个不同样品从左到右为：0.4％溶血的全血(第一组柱)，0.4％溶血的全血的离心所得血浆(第二组柱)，加有340μm胆红素的0.4％溶血的全血的离心所得血浆(第三组柱)，以及加有4％英脱利匹特的0.4％溶血的全血的离心所得血浆(第四组柱)。所有信号都显示游离血红蛋白的含量介于77与93mghb/dl之间，如使用多孔反射镜传感器(传感器1和2)所测量。作为参考，当使用上述参考方法时，在0.4％溶血的全血的离心所得血浆上测量的信号得出约85mghb/dl的含量(未示出)。第一组柱和第二组柱的比较显示红细胞对血红蛋白信号的贡献轻微，但不显著。第二组柱和第三组柱的比较显示胆红素信号与血红蛋白信号的干扰明显，但不显著。第二组柱和第四组柱的比较显示血红蛋白信号与任何英脱利匹特信号的干扰不可检测。
图11示出了在一个月的较长时间段内重复的对标称相同的样品的测量。未观察到信号灵敏度的显著变化，如由每mghb/dl的吸光度所确定。因此，使用多孔反射镜的传感器得出了高度稳定且可再现的结果。
图12示出了由类型相同但在相对较短的时间段内进行的测量得出的结果，从而说明了原始传感器的启动动态。在整个时间段内未观察到显著变化。在自传感器多孔表面的首次润湿起已经3分钟内，观察到稳定且可再现的信号，因此说明了快速响应而没有显著的启动延迟。
图13示出了具有在基于染料的校准溶液上及为作比较而在冲洗溶液上获得的一系列光谱分辨的吸光度数据的示例。在彼此紧接的连续周期中获得光谱。基于染料的校准溶液是每1l冲洗液添加有0.5g酒石黄的冲洗溶液。所测量的溶液的序列如下：首先是冲洗溶液，然后是基于染料的校准溶液，接下来又是冲洗溶液，又是相同的基于染料的溶液，并且三个连续测量的序列均对冲洗溶液执行。所有光谱均在相同标度上绘制并且在彼此顶部上。该实验再次显示所得结果的极好稳定性和再现性。然而更重要的是，数据显示在彼此顶部上重合的两个基于染料的溶液光谱以及也在彼此顶部上重合的所有五个冲洗溶液光谱的令人惊讶的清晰分离。应当注意，这些光学数据均在多孔反射镜传感器的探测体积中探测。这指示也在使用基于染料的分光光度校准溶液(诸如上述酒石黄染色的冲洗溶液)时在孔中提取和洗出子样品的非常有效且完全的扩散交换。
虽然已结合游离血红蛋白的检测具体地讨论了本发明的装置和方法，但根据更广泛的方面，本文所讨论的装置和方法同样可适用于全血样品的血浆级分中的其他光学活性物质的检测，其中术语“光学活性”是指可直接通过分光光学探测技术检测的物质。此类物质可包括但不限于代谢物质、药用物质、药物或维生素。