本发明属于食品安全领域，涉及牛奶样品中二[4-(氧化缩水甘油)苯基]甲烷有害物质的检测，特别是检测中牛奶样品的前处理方法。
背景技术：
二[4-(氧化缩水甘油)苯基]甲烷作为一类外源性激素，越来越受到人们的关注。该化合物都具有与雌激素相类似的作用，可导致内分泌紊乱，性早熟等危害。由于自然环境或外包装材料中都可能含有该物质，从而导致它们迁移到牛奶当中的几率是非常大，因此它们对人体的健康威胁是巨大的。该物质熔点15℃(lit.)，密度1.19 g/mL at 25℃(lit.)，折射率n20/D 1.579(lit.)，分子结构式如下：
牛奶样品组分比较复杂，有害有机物含量极低，一般在ppm和ppb，而且还存在目标待测物的同系物、异构体、降解产物、代谢产物和轭合物影响，要想除去与目标物同时存在的杂质，减少色谱干扰峰，避免检测器和色谱柱污染，样品预处理十分重要，大约占工作量的70%左右。
现有关于脂肪、蛋白质含量较高的食品中二[4-(氧化缩水甘油)苯基]甲烷的检测主要集中在肉类样品，暂未见有关牛奶样品的检测，该类样品的预处理主要采用固相萃取法（SPE），预处理过程一般是为：叔丁基甲醚提取--提取液吹干--正己烷/水萃取--固相萃取相，如“高效液相色谱-串联质谱法同时测定肉类罐头中双酚-二缩水甘油醚”，赵晓亚等，色谱，2012年第30卷第10期；“石墨烯固相萃取-液相色谱-质谱联用法测定食品接触材料中9 种双酚-二环氧甘油醚的迁移量”，龚强等，食品与生物技术学报，2014 年第33卷第12期；“多壁碳纳米管固相萃取－高效液相色谱－串联质谱法测定食品接触材料中双酚－二环氧甘油醚的迁移量”，吴新华等，色谱，2010年第28卷第11期。这种预处理方法由于使用时间比较长，工艺比较成熟，但是也存在步骤繁琐，固相萃取柱造价高，溶剂消耗量大的缺点，科研人员一直在寻找更加高效的替代方法。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有脂肪含量较高的食品中二[4-(氧化缩水甘油)苯基]甲烷检测过程样品预处理过程繁琐、成本高的缺陷，提供了一种牛奶样品中二[4-(氧化缩水甘油)苯基]甲烷的提取净化方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种牛奶样品中二[4-(氧化缩水甘油)苯基]甲烷的提取净化方法，步骤如下：
（1）牛奶样品用甲酸乙腈溶液提取；
（2）向步骤（1）的提取液中加入无水硫酸镁和氯化钠，振荡，离心，得到上清液；
（3）向步骤（2）得到的上清液中加入N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷键合硅胶和无水硫酸镁，振荡，离心，得到提取净化的二[4-(氧化缩水甘油)苯基]甲烷样品。
优选地，步骤（1）中，所述甲酸乙腈溶液的甲酸浓度为0.1vt%。
优选地，步骤（1）采用超声提取，提取时间为10min。
优选地，步骤（2）中，所述无水硫酸镁和氯化钠的质量比为1:2。
优选地，步骤（3）中，所述N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷键合硅胶和无水硫酸镁的质量比为1:1:2.5。
一种检测牛奶样品中二[4-(氧化缩水甘油)苯基]甲烷含量的方法，步骤如下：
（1）牛奶样品用甲酸乙腈溶液提取；
（2）向步骤（1）的提取液中加入无水硫酸镁和氯化钠，振荡，离心，得到上清液；
（3）向步骤（2）得到的上清液中加入N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷键合硅胶和无水硫酸镁，振荡，离心，液体吹干，得到的二[4-(氧化缩水甘油)苯基]甲烷样品再用乙腈溶液溶解，滤膜过滤，得待测样品；
（4）待测样品采用带有荧光检测器的高效液相色谱仪检测，色谱柱为C18柱，流动相采用水和浓度为0.1vt%的甲酸乙腈溶液，激发波长235nm，发射波长为305nm。
本发明的牛奶样品预处理过程简单快捷、效率高、溶剂消耗量小，符合绿色化学和环保化学的要求、花费较少、节省大量的人力物力，适合于牛奶样品中二[4-(氧化缩水甘油)苯基]甲烷的快速检测。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是提取净化后二[4-(氧化缩水甘油)苯基]甲烷的色谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
1、仪器和试剂
（1）仪器：高效液相色谱仪-荧光检测器、waters公司色C18谱柱、离心机、涡旋仪、振荡仪、氮吹仪、离心管、复合过滤头，注射器。
（2）试剂：乙腈、甲酸、超纯水、N-丙基乙二胺（PSA）和十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、氯化钠、无水硫酸镁。
2、样品提取净化步骤
用移液管准确量取牛奶样品(5±0.02 mL)装入15mL具塞离心管中，加入5 mL含有0.1%甲酸的乙腈，超声提取之后，加入1.0g无水硫酸镁和2.0g氯化钠，振荡5min。以10000 rpm的转速在10℃下离心5min。上清液转入另一含有PSA和 C18以及250 mg 无水硫酸镁的离心管中，涡旋30s，振荡2min之后，以10000 rpm的转速在10℃下离心5min。液体转移到另一干净离心管中，在50℃下氮吹到近干，再用1mL浓度55vt%的乙腈水溶液复溶，过0.22um复合滤膜到进样瓶中，上高效液相色谱仪测试。
3、仪器方法的条件
使用带有荧光检测器的高效液相色谱仪仪，色谱柱为Waters Xcharge C18 column (250mm×4.6mm, 5 µm,100A)，流动相由水和含有0.1vt%甲酸的乙腈组成，流速为1.0 mL/min。荧光检测器激发检测波长为215-240 nm，发射波长为295-315。 进样体积为 20 µL，柱温为35±5℃。
4、样品提取净化和检测器条件优化
C18 净化牛奶中的脂肪，色素和维生素，PSA 能够净化牛奶中的碳水化合物和有机酸，乙腈可以使得牛奶中蛋白质析出，另外无机盐氯化钠和硫酸镁都具有盐析作用，可以进一步除去残存的蛋白质。
（1）净化剂PSA和 C18用量
以处理牛奶样品都为5.0±0.02 mL为例，实验中PSA和 C18按照1:1的质量比投料，其他条件相同，设置为5个PSA投料水平：0.025，0.05，0.1，0.2 和0.4 g。通过实验我们发现当PSA用量为0.1g时，目标化合物有最大的回收率。当用量较少的时候，净化效果不好，当用量过多的时候，对目标化合物的吸附作用较大，造成了不必要的损耗。最后选择净化5.0±0.02 mL牛奶样品时，使用PSA和C18的量分别为0.1g作为最优条件。
（2）超声萃取时间
超声萃取具有耗时短、效率高、简单、快捷的优点，我们对超声萃取时间进行了优化。采用单因素试验，其他条件不变，设置超声萃取时间为5个水平：5，10，15，20和25min。通过实验我们发现当萃取时间为10min，效率最高。时间缩短或者延长都会对实验效果产生不利影响。
（3）荧光检测器波长
荧光检测激发波长被设定为215, 220, 225, 230, 235, 240 和245 nm共7个水平，发射波长被设定为295, 300, 305, 310 和 315nm共5个水平，分别采用单因素实验，在保持其他条件不变的情况下，采用加标回收实验，改变激发波长和发射波长，测定目标化合物二[4-(氧化缩水甘油)苯基]甲烷的色谱峰高，当峰高最高的时候，该方法有最佳的灵敏度。通过实验发现。当激发波长为235nm时，目标化合物有最大峰高；当发射波长为305nm，目标化合物有最大峰高。因此，最后选定激发波长235nm，发射波长为305nm，为我们的最佳条件。
（4）最佳样品提取净化条件和检测器条件
用移液管准确量取牛奶样品(5±0.02 mL)装入15mL具塞离心管中，加入5 mL含有0.1%甲酸的乙腈，超声提取10min之后，加入1.0g无水硫酸镁和2.0g氯化钠，振荡5min。以10000 rpm的转速在10℃下离心5min。上清液转入另一含有PSA和 C18各0.1g以及250 mg无水硫酸镁的离心管中，涡旋30s，振荡2min之后，以10000 rpm的转速在10℃下离心5min。液体转移到另一干净离心管中，50℃下氮吹到近干，再用1mL 浓度为55%的乙腈水溶液复溶，过0.22μm复合滤膜到进样瓶中，上机测试。
流动相由水和含有0.1vt%甲酸的乙腈组成，流速为1.0 mL/min， 进样体积为 20 µL，柱温为35±5℃，荧光检测器激发波长235nm，发射波长为305nm。
目标化合物二[4-(氧化缩水甘油)苯基]甲烷的色谱图如图1所示。
5、方法的验证
（1）准确度
方法的准确度由加标回收试验确定。我们采用空白加标试验，选择空白的牛奶样品，按照高中低3个浓度（10, 50 and 100 μg/L）加入目标物标准溶液，利用建立起来的方法对加标样品进行前处理，并上高效液相色谱仪测定，按照测得浓度，计算加标回收率。通过日内和日间加标实验，我们得到目标化合物的回收率为75.82-93.86%，满足残留分析一般75-120%的要求。
（2）精确度
精确度由相对标准偏差（RSD，relative standard deviation）来确定。在日间实验（，每天平行测定6个水平加标样品，连续测定3天）和日内实验数（单日连续测定18个样品）据来确定，结果为3.6-10.9%，满足残留分析一般小于15%。
（3）灵敏度
灵敏度由最低检出限（LOD，limit of detection）和最低定量限（LOQ，limit of Quantitation）来确定，LOD定性分析时用3倍性噪比表示，LOQ定量分析使用10倍信噪比表示。通过加标实验，得到最低检出限（LOD）为2.5μg/L，最低定量限（LOQ）为8.4μg/L，符合残留检测的要求。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。