HPLC检测醋酸去氨加压素有关物质的方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种HPLC检测醋酸去氨加压素有关物质的方法。

背景技术：

去氨加压素是天然精氨加压素的结构类似物，系对天然激素的化学结构进行两处改动而得，即1-半胱氨酸脱去氨基和以8-D-精氨酸取代8-L-精氨酸。去氨加压素的肽序结构为:Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH₂(其中Mpa与Cys通过二硫键成环)。

去氨加压素主要用于治疗中枢性尿崩症、夜间遗尿及血友病等，也用于肾尿液浓缩功能的测试，还可用作术后止血。

目前，关于醋酸去氨加压素的有关物质分析方法，多采用磷酸盐溶液和乙腈作为流动相，通过梯度洗脱分离醋酸去氨加压素各个杂质。其中，《中国药典2015版》中醋酸去氨加压素质量标准中，采用磷酸盐溶液（取0.067mol/L磷酸氢二钾与0.067mol/L磷酸二氢钾等体积混合，调节pH值至7.0）为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表梯度洗脱：

该方法存在流动相配制复杂，检测时间较长，对仪器要求高，不利于快速分析等不足。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种HPLC检测醋酸去氨加压素有关物质的方法，能够快速的检测醋酸去氨加压素的有关物质情况。

本发明提供的一种HPLC检测醋酸去氨加压素有关物质的方法，包括以下步骤：

（1）取醋酸去氨加压素标准品采用水制备醋酸去氨加压素标准溶液，取醋酸去氨加压素各已知杂质对照品采用水制备醋酸去氨加压素杂质标准溶液；

（2）取待测样品采用水制备待测样品溶液；

（3）系统适用性试验：取醋酸去氨加压素适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1mL中含醋酸去氨加压素0.5mg的溶液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1.0mL置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，配制成系统适用性溶液，取系统适用性溶液进样20μL，醋酸去氨加压素峰与各杂质峰分离度R>1.5；

（4）检测限试验：取醋酸去氨加压素已知杂质，精密称定，加水溶解并稀释制成1.0~1.5μg/mL的稀溶液，依次改变进样量，当信噪比（S/N）约为3∶1时样品的量为检测限；

（5）取步骤（2）配制的待测样品溶液10~20μL注入液相色谱仪，流动相流速为0.6~1.0mL/min，检测波长为：210nm；检测器：DAD；柱温：33~37℃；

所述流动相包括A相和B相，A相为乙酸-水；B相：乙酸-乙腈；所述的A相中乙酸与水的体积比为0.1:100；B相中的乙酸与乙腈的体积比为0.1:100；A相与B相的体积比为78:22。

采用步骤（5）检测条件测定步骤（1）配置的标准溶液或混合标准溶液，能都达到有效分离。

根据上述的HPLC检测醋酸去氨加压素有关物质的方法，其特征在于：步骤（1）所述醋酸去氨加压素标准溶液浓度为0.5~1.0mg/mL;混合标准溶液质量浓度为0.004~0.01mg/mL。

根据上述的HPLC检测醋酸去氨加压素有关物质的方法，步骤（1）混合标准溶液配制方法为，分别取醋酸去氨加压素及其杂质对照品适量，配制成0.5mg/mL的标准品溶液，分别取上述各标准品溶液100μL置于10mL容量瓶中，用水稀释定容，得到浓度为5μg/mL的混合标准溶液。

根据上述的HPLC检测醋酸去氨加压素有关物质的方法，步骤（2）所述待测样品溶液的质量浓度为0.3~0.8mg/mL。

根据上述的HPLC检测醋酸去氨加压素有关物质的方法，步骤（1）和步骤（2）所述标准溶液、混合溶液和待测样品溶液注入液相色谱仪之前通过孔仅为0.2~0.4μm的过滤膜过滤。

根据上述的HPLC检测醋酸去氨加压素有关物质的方法，步骤（5）中所使用的色谱柱型号为Diamonsil，柱长250mm，直径4.6mm，粒度5µm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径100A。

根据上述的HPLC检测醋酸去氨加压素有关物质的方法，步骤（1）所述的醋酸去氨加压素杂质包括已知杂质和未知杂质，未知杂质即合成过程中产生的副产物、中间体和降解产物。

本发明HPLC检测醋酸去氨加压素有关物质的方法，具有如下优点：

1、在同一色谱条件下，可满足醋酸去氨加压素与相邻杂峰的分离度要求，可准确判定醋酸去氨加压素样品中的有关物质水平；

2、以乙酸水溶液和乙酸乙腈溶液为流动相，配置过程简单，方便快捷。流动相中不含盐，降低对色谱柱造成损害，延长色谱柱使用寿命；

3、采用等梯度洗脱，无需梯度洗脱，对检测设备要求低，检测方法简单、易操作，检测结果真实可靠，有利于普遍推广。

附图说明

图1本发明实施例1条件下系统适用性溶液的高效液相图谱

图2本发明实施例1条件下醋酸去氨加压素的高效液相图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

醋酸去氨加压素有关物质检测。

一、试剂和溶液

1、醋酸去氨加压素对照品：以去氨加压素（C46H64N14O12S2）计为87.0％

2、去氨加压素EY对照品：100.0%（HPLC法，面积归一法）

3、去氨加压素F对照品：91.0%（HPLC法，面积归一法）

4、去氨加压素D对照品：88.3%（HPLC法，面积归一法）

5、去氨加压素Y对照品：96.4%（HPLC法，面积归一法）

6、待测样品溶液的制备

称取醋酸去氨加压素10.02mg，置于10mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀备用

7、系统适用性试验：取醋酸去氨加压素适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1mL中含醋酸去氨加压素0.5mg的溶液作为供试品溶液；分别取各杂质对照品适量，配制成0.5mg/mL的供试品溶液，精密量取供试品溶液0.1mL置10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，配制成系统适用性溶液。

二、仪器与设备

1、分析天平：感量为0.0001g

2、微孔滤膜：孔径0.45μm

3、高效液相色谱仪（配有紫外检测器）。

三、分析步骤

1、液相色谱条件

色谱柱：Diamonsil，柱长250mm，直径4.6mm，粒度5µm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；

流动相：A相为乙酸-水；B相：乙酸-乙腈；所述的A相中乙酸与水的体积比为0.1:100；B相中的乙酸与乙腈的体积比为0.1~100；A相与B相的体积比为78:22；

流速：0.8mL/min；

检测波长：210nm

进样量：20μL

2、液相色谱测定

取系统适用性溶液进样20μL，醋酸去氨加压素及各已知杂质与相邻杂质之间的分离度>1.5。取待测样品溶液，过0.45μm滤膜，精密量取10μL注入液相色谱仪，记录图谱。

实施例2

检测限试验。

一、试剂和溶液

1、去氨加压素EY溶液： 0.116ng/μL

2、去氨加压素F溶液： 0.112 ng/μL

3、去氨加压素D溶液： 0.12 ng/μL

4、去氨加压素Y溶液： 0.108 ng/μL。

二、仪器与设备

1、分析天平：感量为0.0001g

2、微孔滤膜：孔径0.45μm

3、高效液相色谱仪（配有紫外检测器）。

三、分析步骤

1、液相色谱条件

色谱柱：Diamonsil，柱长250mm，直径4.6mm，粒度5µm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；

流动相：A相为乙酸-水；B相：乙酸-乙腈；所述的A相中乙酸与水的体积比为0.1:100；B相中的乙酸与乙腈的体积比为0.1~100；A相与B相的体积比为78:22；

流速：0.8mL/min；

检测波长：210nm

进样量：20μL~5μL

2、检测结果

结果表明：去氨加压素EY检测限为0.58ng（S/N≈3）。去氨加压素F检测限为0.56ng（S/N≈3）。去氨加压素D检测限为0.6ng（S/N≈3）。去氨加压素Y检测限为0.54ng（S/N≈3）。