血清分子标志物组合作为肺癌诊断和疗效监测标志物的应用的制作方法

本发明涉及血清分子标志物组合作为肺癌诊断和疗效监测标志物的应用，采用了Luminex蛋白芯片诊断技术，检测肺癌患者血清的多种蛋白分子标志物的含量，通过多种蛋白分子标志物的配合比较分析，可用于肺癌诊断和疗效监测，属于免疫诊断领域。

技术背景

癌症是导致死亡的主要原因之一，随着全球范围内的人口增长和老龄化，生活方式的转变，环境气候的影响，癌症的负担会持续增加，癌症问题一直是全球面临的一项重大问题。肺癌(Lung cancer，LC)是全球常见的恶性肿瘤之一，临床上一般分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，NSCLC约占所有肺癌的80％，SCLC约占所有肺癌的20％。相对于女性而言，肺癌在男性中发病几率更加高，且患者5年的存活率约为15％。

尽管在早期检测和治疗方法上都有了提高和进步，但癌症治疗所表现出的耐药性使得肺癌患者的预后诊断仍然较差。利用生物标记物进行早期诊断可以对治疗方案的选择进行指导，并能对治疗结果进行早期评估从而为肺癌患者提供更好的帮助。

在治疗开始后，按周期对治疗效果进行评估，对于肺癌患者来说有着重要的意义。一方面，终止失败的治疗方案可以让患者去考虑选择其他的治疗方案。另一方面，这能避免由无响应的治疗所造成的不必要的副作用。利用生物标记物在治疗前和治疗后的监测可以达到这一目的，并且在多种癌症治疗领域内这一方法也已在应用之中。

目前多种癌症抗原被广泛了解和研究，包括癌胚抗原(CEA)，细胞角蛋白抗原19片段(CYFRA21-1)，神经元特异性烯醇化酶(NSE)，其均被发现在一些肺癌患者体内他们的含量都高于正常值。而其他很多蛋白分子标志物也在不断地寻找中，不断的为人们所认知。

一些与非特异性的急性炎症有关的蛋白标志物，如血清淀粉样蛋白(SAA)，C反应蛋白(CRP)和α1酸性糖蛋白(AGP)也与恶性疾病相关，他们都是当受到一些细胞因子如IL-1,IL-6和TNF-α的刺激时被分泌。炎症反应也是癌症的主要特点之一，慢性的炎症反应会增加肿瘤恶化的风险。肿瘤的生长会诱导炎症微环境的形成，同时癌细胞会加大炎症蛋白的产生，因此，炎症反应相关的蛋白或许可作为潜在可用的生物标志物去预测各种癌症的侵略性和严重性，帮助癌症患者们去识别肿瘤转移或复发的风险。多种癌症患者血清中SAA和CRP的水平都高于正常人，包括肺癌患者。然而其它许多疾病的发生也会导致这几种炎症反应蛋白水平的升高，因此其独立使用时不可以用于肺癌的诊断和预后评价。

骨钙素(OPN)是一种多功能的钙结合磷酸化糖蛋白，它有参与很多生物进程，例如炎症反应、血管生成、肿瘤的形成和转移。研究发现，多种癌症患者中血清、血浆中的OPN水平都高于正常值，包括肺癌，血清中高水平的OPN与肺癌患者的低存活率是相关的。但是OPN本身不足以独立应用于临床。

技术实现要素：

为了克服上述缺陷，本发明提供血清分子标志物组合作为肺癌诊断和疗效监测标志物的应用，采用了Luminex蛋白芯片诊断技术，检测肺癌患者血清的多种蛋白分子标志物的含量，通过多种蛋白分子标志物的配合比较分析，可用于肺癌诊断和疗效监测。

为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：血清分子标志物组合作为肺癌诊断和疗效监测标志物的应用，其特征在于：血清蛋白标志物组合包括骨钙素(OPN)、血清淀粉样蛋白(SAA)、C反应蛋白(CRP)、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白抗原19片段(CYFRA21-1)、巨噬细胞移动游走抑制因子(MIF)、α1酸性糖蛋白(AGP)、肝细胞生长因子(HGF)、E选择素(E-selectin)、生长相关性癌基因(GRO)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。

血清蛋白分子标志物组合的含量测定方法，其特征在于：采用Luminex蛋白芯片。

八个血清蛋白分子标志物(OPN，SAA，CRP，CYFRA21.1，CEA，NSE，AGP和HGF)的组合作为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)诊断和疗效监测标志物的应用。

OPN对非小细胞肺癌有较高的诊断价值，AUC＝0.92；CEA、CYFRA21.1的AUC值分别为0.81和0.77，SAA和CRP的AUC约为0.83。

血清分子标志物组合作为非小细胞肺癌诊断和疗效监测标志物的应用，所述的血清分子标志物组合由OPN、CEA和另一蛋白组成，另一蛋白为CRP，SAA，CYFAR21.1或NSE。

血清分子标志物作为铂类药物化疗疗效监测标志物的应用，所述的血清分子标志物为CYFRA21.1、CRP、SAA、NSE、OPN、MIF的一种或几种。

本发明确立了十一种候选血清蛋白(OPN,SAA,CRP,CEA,CYFRA21.1,MIF,AGP,HGF,E-selectin,GRO和NSE)，收集对218例NSCLC患者，34例SCLC患者和171例正常对照组的血清，采用了Luminex蛋白芯片诊断技术获得十一种血清蛋白的浓度，通过数据处理，数据分析，得到相关的实验结论，证实了其在肺癌诊断和疗效监测中的应用价值。

本发明确立的十一种候选血清蛋白为骨钙素(OPN)、血清淀粉样蛋白(SAA)、C反应蛋白(CRP)、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白抗原19片段(CYFRA21-1)、巨噬细胞移动游走抑制因子(MIF)、α1酸性糖蛋白(AGP)、肝细胞生长因子(HGF)、E选择素(E-selectin)、生长相关性癌基因(GRO)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)。

本发明的实验样本为218例NSCLC患者，34例SCLC患者和171例正常对照组的血清。其中肺癌患者的选择标准如下：(1)是病理上确诊的患者(所有患者都是通过对支气管镜检，活组织切片检查或手术得到的材料进行显微镜检查而确认的)；(2)患者没有其他的肿瘤病史。血样是在患者诊断过程中，且尚未接受任何治疗(手术或化疗)时采集的。此外，每月采集一次接受了手术和化疗的患者血样。样本在4℃下3000rpm离心10分钟，随后收集血清至于-80℃下冻存至使用。

本发明的实验方法为Luminex蛋白芯片诊断技术。其实验步骤为：

1确定试剂：试剂盒为单人单孔，在核对试剂量和标本量无误后开始操作。

2样本处理：样本为室温下的血清样本。

3标准品处理(在冰上操作)：取测试缓冲液，按试剂盒标注的体积加入标准品管中，充分溶解待用；用去离子水对标准品按试剂盒标注的倍数进行稀释，共做6个标准品样品待用。

4阴性质控品处理：以去离子水为阴性质控品。

5阳性质控品处理(在冰上操作)：取测试缓冲液，按试剂盒标注的体积加入QC1和QC2管中，充分溶解，待用。

6加样操作：

(1)将试剂盒提供的塑料珠与缓冲液混合均匀，向标本检测板中加入塑料珠混悬液。

(2)向标本检测板中加入标准品、阴性质控品、阳性质控品和待测标本。

(3)向标本检测板中加入检测缓冲液。

(4)在室温下避光振摇标本检测板2小时或者16小时。

(5)用洗液洗板两次。

(6)向标本检测板中加入检测抗体。

(7)在室温下振摇标本检测板1小时。

(8)向标本检测板中加入。

(9)在室温下振摇标本检测板半小时。

(10)用洗液洗板两次。

(11)向标本检测板中加入洗液。

(12)在室温下振摇5分钟。

7蛋白质全定量检测(Luminex法)：

(1)开机并预热半小时。

(2)运行开机程序。

(3)按照检测试剂盒的指定的参数设定仪器检测方法并保存。

(4)将标本检测板放入检测池，运行检测程序，检测结果将自动生成文件保存。

(5)待检测结束后运行关机程序。

8结果分析：将检测产生的数据，用软件Xponent4的5参数法进行分析。

本发明的数据处理方法：蛋白浓度在统计分析前转换成对数以获取正态分布。两组间的差异通过非配对样本t检验或Mann-Whitney验检测得到。三组以上数据的比较是先通过方差检验分析，再接着进行Bonferroni post hoc检验分析。统计的显著性差异设定为P<0.05。利用含有年龄和性别作为共变量的逻辑回归，对病情状况和血清蛋白水平间的关系进行分析。利用Pearson相关分析对数据的相关性进行分析。利用分层聚类分析法和热图实现相关矩阵的聚集和可视化。通过受试者工作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)的计算可以评估单个蛋白或组合的诊断能力。所有的统计分析都是在R语言和统计计算环境下完成的(R version 2.15.1；R Foundation for Statistical Computing)。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：检测肺癌患者血清的多种蛋白分子标志物的含量，通过多种蛋白分子标志物的配合比较分析，可用于肺癌诊断和疗效监测。

附图说明：

图1正常的(N)，小细胞癌(SC)，非小细胞的(NSC)肺癌患者的治疗前的血清样本中血清蛋白的测定；

图2 NSCLC和正常对照组间受试者工作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)的比较；

图3 NSCLC组治疗后、治疗前蛋白水平(Log 2)的线条图；

图4每个NSCLC患者在治疗后、治疗前的蛋白水平(Log 2)线条图；

图5三个不同的治疗组中治疗应答指数(TRI)的点阵图(P＝培美曲塞，T＝紫杉烷，G＝吉西他滨)；

图6治疗应答指数(TRI)与蛋白水平(Log 2)相关性的点阵图；

图7有远端转移和无远端转移的NSCLC病人蛋白表达间的差异示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

十一种候选血清蛋白为骨钙素(OPN)、血清淀粉样蛋白(SAA)、C反应蛋白(CRP)、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白抗原19片段(CYFRA21-1)、巨噬细胞移动游走抑制因子(MIF)、α1酸性糖蛋白(AGP)、肝细胞生长因子(HGF)、E选择素(E-selectin)、生长相关性癌基因(GRO)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)。八个血清蛋白分子标志物(OPN，SAA，CRP，CYFRA21.1，CEA，NSE，AGP和HGF)在非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)病人中有显著的升高。从单个蛋白水平上来判断，OPN对NSCLC来说有较高的诊断价值(AUC＝0.92)，并且CEA、CYFRA21.1、SAA和CRP也具有较好的AUC值，CEA、CYFRA21.1的AUC值分别为0.81和0.77，两个急性期蛋白(SAA和CRP)的AUC约为0.83。由OPN、CEA和另一蛋白(CRP，SAA，CYFAR21.1或NSE)组成的三蛋白检测组合对NSCLC有极好的诊断潜力。肺癌患者在接受治疗后CYFRA21.1,NSE,CRP和SAA蛋白水平降低，可作为肺癌治疗后疗效评价的指标。在铂类药物化疗后，CYFRA21.1，CRP，SAA和NSE这四种蛋白的水平有显著的减少，同时OPN，MIF和NSE这三种蛋白的水平也有一定程度的降低，这几种血清蛋白标志物可用于指导铂类药物化疗效果的评价。对3-5种血清蛋白分子标志物的治疗反应指数(TRI)的计算认为：约25％的NSCLC患者对于治疗的反应良好，并且TRI与治疗前血清蛋白分子标志物水平具有显著相关性，因此血清蛋白分子标志物的治疗反应指数(TRI)可用作为肺癌患者的疗效评价。虽然NSCLC患者的治疗应答是可以被有效的测得的，但不同病人可能需要选择个性化的生物标记物来进行监督。

在本研究中，我们对218例NSCLC患者，34例SCLC患者和171例正常对照组的血清样本中多种蛋白进行了定量分析。肺癌患者的选择标准如下：(1)是病理上确诊的患者(所有患者都是通过对支气管镜检，活组织切片检查或手术得到的材料进行显微镜检查而确认的)；(2)患者没有其他的肿瘤病史。血样是在患者诊断过程中，且尚未接受任何治疗(手术或化疗)时采集的。此外，每月采集一次接受了手术和化疗的患者血样。样本在4℃下3000rpm离心10分钟，随后收集血清至于-80℃下冻存至使用。

(一)肺癌患者血清中血清蛋白分子标志物的表达情况

对218例NSCLC患者，34例SCLC患者和171例正常对照组的血清样本中的11个候选蛋白(OPN,SAA,CRP,CEA,CYFRA21.1,MIF,AGP,HGF,E-selectin,GRO和NSE)进行测量。

如图1A所示。与对照组相比，在NSCLC和SCLC患者组中，有5种蛋白(OPN,SAA,CRP,CEA和CYFRA21.1)有显著地升高。NSCLC和SCLC患者的平均OPN水平值比对照组高约4倍(p＜10^-59和p＜10^-11)。NSCLC和SCLC患者的平均SAA水平值比对照组高出5倍多(p＜10^-36和p＜10^-6)，平均的CRP水平值也高出7倍多(p＜10^-37和p＜10^-5)。NSCLC和SCLC患者组的平均CEA水平值各比对照组分别高出4.9倍和2.9倍(p＜10^-29和p＜0.001)。NSCLC和SCLC患者组的平均CYFR21.1水平值也各比对照组分别高出6.1倍和4.8倍(p＜10^-18和p＜0.001)。然而，MIF,AGP,HGF,sE-selectin和GRO在NSCLC或SCLC患者组中，与对照组相比，并未有显著的不同或只有少量差异。SCLC患者组和NSCLC患者组之间的唯一的最主要的差别是NSE，在SCLC患者组中NSE的水平值比对照组高出8.7倍(p＝0.0011)，但NSCLC患者组仅比对照组高1.6倍(p＝0.000013)。

(二)不同蛋白与肺癌(NSCLC和SCLC)之间的相关性

混杂变量也许会导致患者和对照组之间的差异，为了排除由混杂变量导致的影响，我们用Logistic回归进行分析处理，因变量是蛋白质浓度，性别和年龄作为协变量。

如表1A所示，在调整过年龄和性别后，这8种蛋白与NSCLC表现出明显的关联性。这些结果表明，这些蛋白与NSCLC的关联性是会受其他的协变量影响的。

如表1B所示，在年龄和性别调整后，这8种在NSCLC中表现出显著变化的蛋白中的5种，也在SCLC中表现出了显著的差异。此外，NSE在SCLC患者中升高(OR＝2.4,P_adj＝0.01)，但在NSCLC中却没有(OR＝1.3，P_adj＝0.08)。

表1:非小细胞肺癌和小细胞肺癌患者血清蛋白的Logistic回归分析。

A

B

如图7所示：转移患者组中的CEA明显高于非转移患者组(FC＝2.1,p<0.004)；而MIF略低于非转移患者组(FC＝0.8,p＝0.1)。除此之外，没有其他的显著差异。

(三)不同血清蛋白彼此之间的相关性

对三个不同的组的十一中血清蛋白水平进行了分析，并用聚类分析的方法对不同蛋白的水平彼此之间的相关性进行分析，确定相关蛋白组合。

如图1B中的热图所示。在对照组中只有CRP和SAA相关联。在两个肺癌患者组中都有两个子集的相关蛋白。第一个子集CRP,SAA,AGP,GRO,HGF和OPN，第二个子集包括了HGF,OPN,CYFR21.1,sE-selectin,MIF和NSE。

(四)血清蛋白对NSCLC的诊断价值

利用ROC曲线的曲线下面积(AUC)对血清蛋白作为LC生物标记物的潜在效用进行评估。

如图2A所示，我们对11种蛋白区分正常人和NSCLC患者的能力进行了评估。一些蛋白具有优秀的AUC值，但并非完美。最好的蛋白是OPN(AUC＝0.919),CRP(AUC＝0.832),SAA(AUC＝0.823)和CEA(AUC＝0.805)。癌症抗原CYFRA21.1和NSE的AUC值分别是0.77和0.60。

如图2B所示，我们对OPN,CEA,CRP,SAA,CYFRA21.1和NSE中的三到四种蛋白组合应用，区分正常人和NSCLC患者的能力进行了评估。三到四种蛋白组合应用后对NSCLC的AUC值有所提升。其中出现了4组三种蛋白组合的AUC值近乎完美(～0.96)。这4组组合都含有OPN和CEA，外加NSE，CYFRA21.1，CRP，SAA这四种蛋白中的一种。

如表2所示，以4个不同的特异性阈值(90％,95％,99％和100％)表现不同蛋白的灵敏度值。在个别蛋白之中，OPN的性能最佳，其灵敏度在90％,95％,99％和100％这四个特异性阈值中达到了78％,72％,58％和29％。CEA,CRP和SAA的性能虽不如OPN，但也是不错的。在最高的特异性要求为99％和100％时，4组由三种蛋白(OPN-CEA加CYFRA21.1,NSE,CRP或SAA)组合灵敏度等级达到了约70％和60％。

以上均表明：4组由三种蛋白(OPN-CEA加CYFRA21.1,NSE,CRP或SAA)组合具有极佳的诊断潜力。

表2：不同蛋白在不同的特异性阈值(90％,95％,99％and 100％)下表现的灵敏度值

(五)肺癌患者治疗后血清蛋白的变化

68位接受铂类药物化疗的NSCLC患者被考察治疗前后的血清样本血清蛋白的变化。按照治疗方案不同分为三组：第一组中的43位患者使用铂类加培美曲塞(PEM)，第二组中的17位患者接受了铂类加紫杉醇的治疗(TAX)，第三组的8位患者采用铂类加吉西他滨(GEM)的治疗方法。

如图3所示：为三组的平均比率(每一位患者的每一个蛋白在治疗后和治疗前水平的比率都已被计算出)。数据表明在所有三组中有一些蛋白在治疗后有所降低。降低的较多的蛋白有CYFRA21.1,NSE,CRP和SAA。然而CEA的平均水平在使用吉西他滨和紫杉醇的组中有所降低，但在培美曲塞组中却增高。

如图4所示：表明了这三个组中每个病人体内蛋白水平的变化。治疗后多数患者同样也表现出了CYFRA21.1,NSE,CRP和SAA的水平的急剧降低，并且与使用Taxane和PEM治疗的患者相比，在用GEM治疗的患者中更明显。

(六)通过蛋白水平对治疗应答的评估

为了评估血清蛋白的总变化，我们计算了治疗应答指数(TRI)，TRI为多种蛋白在治疗前后浓度的比率再取Log 2后的结果的总和。我们集中计算了四蛋白组合(CYFRA21.1-CRP-SAA-NSE)和五蛋白组合(4proteins+CEA)

如图5所示：为TRI的点阵的形式图。在三个月治疗过程中的整个患者群体中，27％的患者的蛋白水平有明显的降低(TRI<2^-10或1/1028)，17.5％的患者有适度的降低(TRI＝2^-5-2^-10)，剩余55.5％的患者有少量的降低、不变或少量的上升。与对照组相比，NSCLC患者体的血清蛋白水平有所上升，治疗后血清蛋白水平有所下降，表明了治疗后肿瘤负荷的降低，这一下降的程度可能反映了治疗的成功程度。在3到5个月的治疗后，有62.5％接受吉西他滨治疗的患者与使用培美曲塞的患者相比得到了更好的治疗效果(OR＝5.1，p＝0.04和OR＝10.8，p＝0.01,)。在紫杉醇治疗组中，在治疗3个月和5个月中的12％和18％的患者具有较好的响应，这与使用吉西他滨治疗的患者组相比来说具有显著的不同(OR＝10.8,p＝0.01and OR＝7.0,p＝0.06)。但与培美曲塞的患者组相比没有显著差异。这些结果可能表明了铂类药物对NSCLC有更好的治疗效果。

我们也分析了是否可以用治疗前的蛋白水平去预估治疗应答中蛋白水平的改变。

如图6A所示，为TRI和治疗前每个蛋白的水平间的相关性。这些结果表明，具有较好疗效的患者的CRP，SAA和CYFRA21.1蛋白水平较高。尽管具有更高的蛋白表达水平的患者其治疗疗效更好，但不是所有的高蛋白表达的患者的治疗效果都更好。

如图6A所示，为TRI和治疗前四蛋白(CRP-SAA-CYFRA21.1-NSE)组合的的水平间的相关性。TRI和多蛋白组合的总蛋白水平间的相关性很高，证明具有更高的蛋白水平的患者得到了更好的治疗疗效。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。