本发明涉及可溶性目标蛋白准确定量技术领域，尤其是涉及一种基于血清的elisa标准品稀释液的制备方法。
背景技术：
elisa(酶联免疫吸附试验)是进行样本中可溶性目标蛋白准确定量的一种方法。elisa试剂盒的核心组件标准品稀释液的功能就是保证elisa试剂盒的准确度。理论上标准品稀释液的组分应该是除不含目标蛋白外其他组分与待检样本的组分完全相同，但实际情况是这是不可能的，特别是人的血清、血浆样本。
教科书上的标准品稀释液为含0.5％bsa的pbs-t溶液，此溶液用于细胞培养上清、组织研磨液、组织裂解液等低蛋白浓度的样本类型的应用效果还是可以的，加标回收通常在80-120％之间。但对于血清、血浆这样高蛋白浓度组分复杂的样本，加标回收只有20-30％，这样得到的结果与实际浓度相差太大，是非常不准确的。也有使用人的复钙血浆做样本稀释液，效果是好些，问题是潜在传染性、数量有限、价格昂贵，还有法律的禁制。
技术实现要素：
为解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种基于血清的elisa标准品稀释液的制备方法，旨在解决现有普通标准品稀释液对高蛋白浓度组分复杂的样本加标回收效果差，回收效果较好的标准品稀释液价格昂贵，潜在问题严重。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种基于血清的elisa标准品稀释液的制备方法，包括以下步骤，
a.用缓冲液配制若干动物血清，血清浓度为5％-95％，浓度梯度为5％，在各个浓度的动物血清中加入目标蛋白，取若干健康的人血清样本，加入目标蛋白，配置后目标蛋白浓度与动物血清中接近；所述缓冲液的ph为7.2～7.4；
b.对加入目标蛋白后的各个浓度的动物血清与人血清样本做常规elisa实验操作；
c.制作od曲线：excel表横轴为动物血清浓度，纵轴为od值制作od曲线；
d.确定与人血清样本od平均值相交的动物血清浓度，即人血清中目标蛋白在elisa实验中的反应性状与该交点所示浓度的动物血清相近；
e.利用d中所得浓度的动物血清做加标回收实验，确认回收率是否在80％到-120％，如有偏差，上下微调该动物血清浓度即可。
作为优选，所述动物血清中目的蛋白浓度为200pg/ml。
为了消除由于试剂不纯或试剂干扰等所造成的误差，还包括以下步骤，对步骤a中的各个浓度的动物血清与健康的人血清做空白加样，所得数据作为步骤d的数据背景。
为了方便采集并降低成本，所述动物血清采用山羊血清、兔血清或胎牛血清中的一种。
作为优选，所述缓冲液为0.5％tween20bps或tbs-t。
本发明的有益效果：加标回收效果好，价格较低，制作方便。
附图说明
图1为本发明的实施例1的od曲线图。
具体实施方式
实施例1，一种基于血清的elisa标准品稀释液的制备方法，
a.用0.5％tween20bps系列配制山羊血清，浓度梯度5％，浓度分数分别为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，每个山羊血清浓度95ul中加入5ul浓度为4000pg/ml的h-il-6标准蛋白，标准蛋白终浓度为200pg/ml；取4个健康人血清，95ul中加入5ul浓度为4000pg/ml的h-il-6标准蛋白(一般健康人血清h-il-6的浓度在20pg/ml以下，加标后血清的标准蛋白浓度约为200pg/ml，如果遇到h-il-6表达较高的，剔除其数据)；
b.将加标后的各浓度山羊血清和加标后的人血清样本，加入预包被的h-il-6酶标板50ul/孔，再加入50ul/孔的h-il-6检测抗体，室温300转/分钟振荡2小时孵育，然后洗涤液洗涤5次，加入100ul/孔的辣根过氧化物酶，随后洗涤液洗涤5次，加入100ul/孔tmb显色底物，显色10分钟，2m的硫酸终止反应；所得酶标仪检测波长450nm，参考波长630nm读取od值；
c.制作od曲线；
d.由od曲线图可知，人血清样本200pg/ml加标的平均od值与山羊血清加标的od曲线相交于60％处，即人血清中h-il-6在elisa实验中的反应性状与60％浓度山羊血清相近。
e.以60％浓度山羊血清作为h-il-6的标准品稀释液，10个人血清样本做加标回收实验，回收率范围99％-115％，平均回收率106％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。