本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及检测蛋白电荷变异体的方法及确定生物制品生产工艺的方法。
背景技术：
：目前，人用重组dna蛋白制品或人用重组单克隆抗体制品大多是采用哺乳动物细胞表达系统进行生产，在产品的生产、储存、运输等过程中，往往会发生产品的聚集、降解及各种翻译后修饰，从而导致产品的分子大小、电荷、糖基化修饰等不均一性及其相应的变体产生。这些变体的形成可能发生在产品的整个生命周期内的任何阶段，有资料显示，仅翻译后修饰(如n-末端谷氨酸环化、c-末端赖氨酸截除、n-末端谷氨酰胺/谷氨酸环化、脱酰胺、氧化、唾液酸修饰等)的异质性即可达2.85×108。几乎所有这些翻译后修饰均可改变单抗的表面电荷分布特性，而电荷异质性对单抗的稳定性及其生物学功能发挥具有重要的影响而成为关键质量属性(cqa)，并且电荷异质性可反映其生产工艺的稳定性，所以受到生物技术产业界及监管机构密切关注。人用药物注册技术要求国际协调会ich出台的指导原则中q6b部分根据单抗变体对产品安全性、有效性的影响程度，将其分为产品相关物质及产品相关杂质，对产品相关物质及产品相关杂质的鉴别、质量研究及质量控制具有重要意义。在生产过程中，尤其是在生产工艺改变后，还需进一步监测电荷变体的形成原因及其对产品安全性、有效性的影响。通过改变工艺条件、制剂方法等方式来减少电荷变体，并对抗体的电荷变体进行评估，以确定是否需要作为放行标准以及将其作为产品一致性的参考标准。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够快速、准确、灵敏地检测蛋白电荷变异体的方法。需要说明的是，本申请所述的蛋白电荷变异体是指蛋白翻译后修饰(如唾液酸化)致使蛋白电荷量发生改变而形成的异构体。另外，需要说明的是，ph-iec离子交换色谱法(phgradientionexchangechromatography，ph梯度离子交换色谱法)的分离原理是，ph梯度可以改变检测物质电荷、偏离等电点的程度,从而影响带正/负电荷的分子或离子与色谱柱固定相的结合能力,使洗脱时的难易程度发生改变,从而改变了分离的选择性，最终实现各组分分离。在本发明的第一方面，本发明提出了一种检测蛋白电荷变异体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括，通过ph-iec离子交换色谱法对待测蛋白进行分析，以便获得色谱图；以及基于所述色谱图，确定所述待测蛋白电荷变异体的含量。利用根据本发明实施例的检测蛋白电荷变异体的方法可实现对蛋白电荷变异体的快速、准确、灵敏地检测。本申请所述的方法尤其适用于pi值为7.0～9.0的重组dna的蛋白制品或重组单克隆抗体制品中蛋白电荷变异体的检测。根据本发明的实施例，所述检测蛋白电荷变异体的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述ph-iec离子交换色谱法所采用的流动相为哌嗪、咪唑、tris和水的混合溶液，其中，所述哌嗪、咪唑和tris的质量比为1:0.1:0.3。发明人在实验中发现，采用哌嗪、咪唑和tris的质量比为1:0.1:0.3的混合溶液作为流动相，蛋白电荷变异体的出峰时间适宜。根据本发明的实施例，所述哌嗪的浓度为1g/l，所述咪唑的浓度为0.1g/l，所述tris的浓度为0.3g/l。发明人在实验中发现，采用前述哌嗪、咪唑和tris的浓度，变异体峰与主峰分离度好且峰形尖锐对称，可实现对蛋白变异体的准确定量。根据本发明的实施例，所述ph-iec离子交换色谱法所采用的色谱柱为强阳离子交换色谱柱scx或强阴离子交换色谱柱sax。发明人在实验中，相比于采用弱离子交换色谱柱，如弱阳离子交换色谱柱wcx，采用scx或sax可有效控制蛋白电荷变异体峰之间以及蛋白电荷变异体峰和主峰之间的分离度，控制未知杂峰的出峰。根据本发明的实施例，所述ph-iec离子交换色谱法所采用的色谱柱为强阳离子交换色谱柱scx，流动相a的ph为5.5，流动相b的ph为10.5。发明人在实验中发现，在上述的流动相的ph下，ph梯度大，蛋白电荷变异体峰和主峰保留时间适宜，分离度良好。根据本发明的实施例，所述ph-iec离子交换色谱法所采用的色谱柱为强阴离子交换色谱柱sax，流动相a的ph为10.5，流动相b的ph为5.5。发明人在实验中发现，在上述的流动相的ph下，ph梯度大，蛋白电荷变异体峰和主峰保留时间适宜，分离度良好。根据本发明的实施例，所述ph-iec离子交换色谱法的洗脱时间为45min，洗脱斜率为2.2％。发明人在实验中发现，在上述洗脱时间和斜率下，蛋白电荷变异体峰实现完全分离、出峰时间恰当且分辨力更优。根据本发明的实施例，所述ph-iec离子交换色谱法所采用的流动相a和流动相b的体积比为1:1，并且所采用的洗脱程序为：时间ab010002.5100047.5010052.50100541000601000发明人发现，在上述洗脱程序下(洗脱相对缓慢)，蛋白电荷变异体峰可与主峰实现完全分离，且峰形对称不产生包峰现象，便于定量分析。根据本发明的实施例，ph-iec离子交换色谱法的上样浓度0.1～1.0mg/ml，上样量10ul～30ul，流速0.5～1.0ml/min，柱温25～40℃，检测波长280nm。发明人发现，在上述色谱条件下，可确保色谱柱载量适中，色谱信号强度适宜，峰形对称，可实现对蛋白电荷变异体的准确定量，同时为上游工艺部门工艺开发提供重要质控证据和技术支撑。根据本发明的实施例，基于所述色谱图，确定所述待测蛋白电荷变异体的含量可通过如下方式进行：基于色谱图中蛋白电荷变异体峰面积在总峰面积的比值，确定蛋白电荷变异体在总蛋白中的含量，在已知待测蛋白总重量的情况下，确定蛋白电荷变异体的重量。根据本发明的实施例，进一步包括对待测蛋白进行唾液酸酶酶切处理；以及基于酶切前后所得色谱图中酸性电荷变异体峰的变化，确定待测蛋白中唾液酸酸性电荷变异体的含量。唾液酸酶具有特异性识别唾液酸修饰蛋白位点的特点，依据此对待测蛋白进行唾液酸酶酶切处理，进而观察酶切后电荷变异体峰相比于酶切前电荷变异体峰的变化，可特异性评估唾液酸酶酸性电荷变异体的含量。在本发明的第二方面，一种检测蛋白电荷变异体的方法，其特征在于，通过ph-iec离子交换色谱法对待测蛋白进行分析，以便获得第一色谱图；对待测蛋白进行唾液酸酶酶切处理，通过ph-iec离子交换色谱法对唾液酸酶酶切处理后产物进行分析，以便获得第二色谱图；以及基于所述第一色谱图和所述第二色谱图中酸性电荷变异体峰的变化，确定所述待测蛋白电荷变异体的含量，所述待测蛋白电荷变异体的含量为所述待测蛋白中唾液酸酸性电荷变异体的含量，其中，所述ph-iec离子交换色谱法所采用的流动相为哌嗪、咪唑、tris和水的混合溶液，所述哌嗪、咪唑和tris的质量比为1:0.1:0.3，所述哌嗪的浓度为1g/l，所述咪唑的浓度为0.1g/l，所述tris的浓度为0.3g/l。所采用的色谱柱为强阳离子交换色谱柱scx，流动相a的ph为5.5，流动相b的ph为10.5；或所采用的色谱柱为强阴离子交换色谱柱sax，流动相a的ph为10.5，流动相b的ph为5.5，洗脱时间为45min，洗脱斜率为2.2％，上样浓度0.1～1.0mg/ml，上样量10ul～30ul，流速0.5～1.0ml/min，柱温25～40℃，检测波长280nm流动相a和流动相b的体积比为1:1，并且所采用的洗脱程序为：时间ab010002.5100047.5010052.50100541000601000利用根据本发明实施例的检测蛋白电荷变异体的方法可实现对蛋白电荷变异体的快速、准确、灵敏地检测。本申请所述的方法尤其适用于pi值为7.0～9.0重组dna的蛋白制品或重组单克隆抗体制品中蛋白电荷变异体的检测。在本发明的第三方面，本发明提出了一种确定生物制品生产工艺的方法，其特征在于，包括：(1)采用候选工艺，制备生物制品，所述生物制品为蛋白制品；(2)利用前面所述的方法确定所述生物制品中电荷变异体的含量；以及(3)基于所述生物制品中电荷变异体的含量，确定最终生物制品的生产工艺。利用根据本发明实施例的确定生物制品生产工艺的方法能够对生物制品的生产进行严格的监控，保证放行生物制品的安全性、有效性和质量可控性。根据本发明的实施例，上述确定生物制品生产工艺的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，在步骤(3)中，当所述生物制品中电荷变异体的含量小于80％，则选择所述候选工艺为最终生物制品的生产工艺。所述生物制品中电荷变异体的含量小于80％，则所述生物制品中的主峰面积大于20％，所得蛋白生物制品的活性不受影响或影响处于安全水平，生产该生物制品的候选工艺是可以选择的。根据本发明的实施例，所述电荷变异体为酸性电荷变异体。根据本发明的实施例，所述酸性电荷变异体为唾液酸酸性电荷变异体。根据本发明的实施例，当所述生物制品中电荷变异体的含量不小于80％，则对所述候选工艺进行优化处理，并重复步骤(1)～(3)直至所述生物制品中电荷变异体的含量小于80％。所述生物制品变异体峰面积不低于80％，如唾液酸修饰变异体的峰面积不低于80％，所得生物制品的活性受到影响或影响处于不安全水平，则生产该生物制品的候选工艺需要调整和改进，直到生产出的生物制品的电荷变异体处于安全水平，才可放行。根据本发明的实施例，所述优化处理包括对下列处理至少之一的参数进行调整：发酵工艺、纯化工艺、制剂处方和储存条件。根据本发明的具体实施例，制剂处方包括盐离子种类、离子强度、ph值等工艺条件，如储存条件所采用的发酵纯化后的原液冻存于-80℃，成品置于2～8℃避光。发明人发现，发酵工艺、纯化工艺、制剂处方和储存条件是影响蛋白药物电荷变异体修饰的关键参数，通过调整上述参数，可使产出的蛋白药物的电荷变异体处于安全水平。附图说明图1为根据本发明实施例的pit体系流动相组分(质量比30:1:3)ph-hplc色谱图；图2为根据本发明实施例的pit体系流动相组分(质量比5:1:3)ph-hplc色谱图；图3为根据本发明实施例的pit体系流动相组分(质量比10:1:3)ph-hplc色谱图；图4为根据本发明实施例的pit体系流动相(a相5.5b相8.5)ph-hplc色谱图；图5为根据本发明实施例的pit体系流动相(a相5.5b相10.5)ph-hplc色谱图；图6为根据本发明实施例的pit体系流动相(洗脱时间15min)ph-hplc色谱图；图7为根据本发明实施例的pit体系流动相(洗脱时间20min)ph-hplc色谱图；图8为根据本发明实施例的pit体系流动相(洗脱时间30min)ph-hplc色谱图；图9为根据本发明实施例的pit体系流动相(洗脱时间45min)ph-hplc色谱图；图10为根据本发明实施例的pit体系流动相(propacwcx-10色谱柱)ph-hplc色谱图；图11为根据本发明实施例的pit体系流动相(propacsax-10色谱柱)ph-hplc色谱图；图12为根据本发明实施例的蛋白a酶切前ph-hplc色谱图；以及图13为根据本发明实施例的蛋白a酶切后ph-hplc色谱图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。以下实施例中所用实验材料、待测样品以及仪器如下所述：主要试剂信息如表1所示。表1：样品及仪器信息如表2和表3所示。表2：名称规格厂家单克隆抗体a1mg/ml自制表3：实施例1发明人前期进行了大量试验方法摸索(包括流动相组成、流动相ph值、洗脱时间和色谱柱筛选)，最终确定了试验方法关键参数，并成功应用于蛋白电荷变异体的检测分析，为工艺部门关键工艺参数(cpps)的确定提供了理论依据和参考，确保了临床用药的安全性和有效性。1.1流动相组分摸索条件1：pit流动相组成如表4所示。表4：色谱条件如表5所示。表5：条件内容名称/指标液相色谱仪agilent1260或者waterse2695检测器/检测波长280nm色谱柱proteomixscx-np5(4.6*250mm，5μm，sepax)流速1.0ml/min上样浓度1.0mg/ml进样量20μl采集时间35min柱温30℃洗脱程序如表6所示，洗脱时间为20min。表6：时间％a％b010002.5100022.5010027.50100291000351000所得色谱图如图1所示。结果显示，pit体系流动相组分质量比为30:1:3色谱图显示出峰时间过早(不利于变异体的分离)，且各变异体峰未实现完全分离，需调整流动相组分配比，使出峰时间适当延后。条件2：pit流动相组成如表7所示。表7：色谱条件如表8所示。表8：洗脱程序如表9所示，洗脱时间为20min。表9：时间％a％b010002.5100022.5010027.50100291000351000所得色谱图如图2所示。结果显示，通过调整pit体系流动相组分，各变异体峰分离度得到改善，但出峰时间仍较早，对样品质控分析不利，仍需进一步调整相关参数以便获得理想结果。条件3：pit流动相组成如表10所示。表10：色谱条件如表11所示。表11：洗脱程序如表12所示，洗脱时间为20min。表12：时间％a％b010002.5100022.5010027.50100291000351000所得色谱图如图3所示。结果显示，通过调整pit体系流动相组分，出峰时间适宜，但各变异体峰已重叠(出现包峰现象)，缺乏分辨力，因此仍需进一步调整相关参数以便获得良好分辨力和适宜出峰时间。2.2流动相ph值摸索条件1：pit流动相组成如表13所示。表13：色谱条件如表14所示。表14：洗脱程序如表15所示，洗脱时间为20min。表15：时间％a％b010002.5100022.5010027.50100291000351000所得色谱图如图4所示。结果显示，pit流动相体系在a相5.5，b相8.5条件下，各变异体峰分离度符合要求，但出峰时间太晚，表明该方法下ph梯度较小(即b相ph值偏低)，不利于变异体峰的分离，后续应增大ph梯度，使出峰时间适当提前。条件2：pit流动相组成如表16所示。表16：色谱条件如表17所示。表17：条件内容名称/指标液相色谱仪agilent1260或者waterse2695检测器/检测波长280nm色谱柱proteomixscx-np5(4.6*250mm，5μm，sepax)流速1.0ml/min上样浓度1.0mg/ml进样量20μl采集时间35min柱温30℃洗脱程序如表18所示，洗脱时间为20min。表18：时间％a％b010002.5100022.5010027.50100291000351000所得色谱图如图5所示。结果显示，通过调整a、b相ph值，使ph梯度增大，保留时间适宜，符合预期，但各变异体峰分离度未达到可接受标准，后续需结合调整流动相洗脱时间(即改变洗脱斜率)，提高洗脱峰分辨力，实现各变异体峰的完全分离。1.3流动相洗脱时间摸索条件1：pit流动相组成如表19所示。表19：色谱条件如表20所示。表20：条件内容名称/指标液相色谱仪agilent1260或者waterse2695检测器/检测波长280nm色谱柱proteomixscx-np5(4.6*250mm，5μm，sepax)流速1.0ml/min上样浓度1.0mg/ml进样量20μl采集时间30min柱温30℃洗脱程序如表21所示，洗脱时间为15min。表21：所得色谱图如图6所示。结果显示，洗脱时间为15min(即洗脱斜率为6.7％)，目标蛋白电荷变异体的分离表现为单峰，完全无分辨力(包峰现象)，需适当降低洗脱斜率，实现各峰的良好分离。条件2：pit流动相组成如表22所示。表22：色谱条件如表23所示。表23：条件内容名称/指标液相色谱仪agilent1260或者waterse2695检测器/检测波长280nm色谱柱proteomixscx-np5(4.6*250mm，5μm，sepax)流速1.0ml/min上样浓度1.0mg/ml进样量20μl采集时间35min柱温30℃洗脱程序如表24所示，洗脱时间为20min。表24：所得色谱图如图7所示。结果显示，洗脱时间为20min(即洗脱斜率为5.0％)，目标蛋白电荷变异体的分离度得到改善，具有一定分辨力，但仍需适当降低洗脱斜率，实现各峰的良好分离。条件3：pit流动相组成如表25所示。表25：色谱条件如表26所示。表26：条件内容名称/指标液相色谱仪agilent1260或者waterse2695检测器/检测波长280nm色谱柱proteomixscx-np5(4.6*250mm，5μm，sepax)流速1.0ml/min上样浓度1.0mg/ml进样量20μl采集时间45min柱温30℃洗脱程序如表27所示，洗脱时间为30min。表27：时间％a％b010002.5100032.5010037.50100391000451000所得色谱图如图8所示。结果显示，洗脱时间为30min(即洗脱斜率为3.3％)，目标蛋白电荷变异体的分离度得到较大改善，分辨力较好，但仍需适当降低洗脱斜率，实现各峰的完全分离。条件4：pit流动相组成如表28所示。表28：色谱条件如表29所示。表29：条件内容名称/指标液相色谱仪agilent1260或者waterse2695检测器/检测波长280nm色谱柱proteomixscx-np5(4.6*250mm，5μm，sepax)流速1.0ml/min上样浓度1.0mg/ml进样量20μl采集时间60min柱温30℃洗脱程序如表30所示，洗脱时间为45min。表30：时间％a％b010002.5100047.5010052.50100541000601000所得色谱图如图9所示。结果显示，洗脱时间为45min(即洗脱斜率为2.2％)，目标蛋白电荷变异体峰实现完全分离，分辨力好。因此，该法可用于蛋白电荷变异体的质量控制。3.4色谱柱的筛选发明人在前期使用强阳离子交换色谱柱scx(strongcationexchange)对目标蛋白进行了电荷变异体的分离，获得了理想的分离效果。后续又采用弱阳离子交换色谱柱wcx(weakcationexchange)对电荷异质性进行了分析，未到达预期效果。发明人在对前述发明成果和离子交换色谱原理深刻理解基础上，采用强阴离子交换色谱柱sax再次对目标蛋白电荷变异体进行了分析(流动相a和b相的ph值相反)，结果与scx结果一致，进一步验证了该法的适用性。条件1(色谱柱wcx)：pit流动相组成如表31所示。表31：色谱条件如表32所示。表32：条件内容名称/指标液相色谱仪agilent1260或者waterse2695检测器/检测波长280nm色谱柱propacwcx-10(4*250mm，10μm，thermo)流速1.0ml/min上样浓度1.0mg/ml进样量20μl采集时间60min柱温30℃洗脱程序如表33所示，洗脱时间为40min。表33：时间％a％b010002.5100042.5010047.50100501000551000所得色谱图如图10所示。结果显示，发明人采用弱阳离子交换色谱柱进行电荷变异体的分离，未获得理想分离度，且出现未知杂峰，影响质控分析。条件2(色谱柱sax)：pit流动相组成如表34所示。表34：色谱条件如表35所示。表35：条件内容名称/指标液相色谱仪agilent1260或者waterse2695检测器/检测波长280nm色谱柱propacsax-10(4*250mm，10μm，thermo)流速1.0ml/min上样浓度1.0mg/ml进样量20μl采集时间60min柱温30℃洗脱程序如表36所示，洗脱时间为40min。表36：时间％a％b010002.5100042.5010047.50100501000551000所得色谱图如图11所示。结果显示，发明人采用强阴离子交换色谱柱sax进行蛋白变异体的分析，同样可获得良好分离效果，表明ph-iec在电荷变异体分离上具有较好的适用性。实施例2电荷变异体峰鉴别发明人在对目标蛋白(蛋白a、单克隆抗体a)各变异体峰进行完全分离基础上，采用唾液酸酶(神经氨酸苷酶)酶切对变异体峰进行了鉴别，鉴别结果如图12和图13所示。其中，图12显示了蛋白a酶切前ph-hplc色谱图，图13显示了蛋白a酶切后ph-hplc色谱图。由图12和图13结果可知；目标蛋白a采用唾液酸酶酶切后，21.2min之前变异体峰全部消失，说明前面各变异体峰均为酸性变异体峰，推测该目标蛋白a翻译后修饰主要表现为唾液酸修饰。根据上述试验结果，确定目标蛋白a酸性电荷变异体的控制范围应＜80％，即主峰面积应＞20％，产品方可放行。发明人采用实施例1不同条件对蛋白电荷变异体进行对比分析，研究不同色谱条件下电荷变异体的分离效果，以筛选出最优的方法用于蛋白电荷变异体检测，进一步对电荷变异体进行了酶切鉴别，确定电荷变异体的类别，指导上游工艺部门，进而确定关键工艺参数(cpps)，确保药物生产的批间一致性，监控临床用药的安全性与有效性。综上，本申请所述的ph-iec法(无论采用scx色谱柱或是采用sax色谱柱)适用于重组蛋白或单克隆抗体的电荷变异体分析，可用于该类药物的质量控制领域。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12