本发明涉及生物医药工程技术领域的一种特殊抗体分泌细胞检测方法，特别涉及一种检测外周血乙肝表面抗体分泌细胞的方法。
背景技术：
乙肝表面抗体(抗-HBs)是机体对乙型肝炎病毒(HBV)获得免疫保护的标志，在HBV的清除及预防再感染过程中具有十分重要的作用。外周血中抗-HBs由浆细胞分泌，机体在受到乙肝表面抗原(HBsAg)刺激后，B细胞成熟分化为分泌抗-HBs的浆细胞和不分泌抗体的记忆B细胞，浆细胞寿命短暂，而记忆B细胞则可在无抗原刺激的情况下长期存活，但其数量在外周血中极少。在机体再次受到HBsAg刺激后，记忆B细胞迅速增殖分化为浆细胞分泌抗-HBs。
在健康人群中，经正规免疫预防接种HBV疫苗后，血清抗-HBs水平会逐渐下降，当血清抗-HBs低于检测水平时，其对于人体是否仍有免疫保护作用仍存在争论。目前有证据表明，经正规免疫预防接种HBV疫苗的健康个体即使抗-HBs下降至无法检测到的水平，机体获得的免疫保护仍然持续存在，这是由于体内存在着不易被检测到的记忆性B细胞，因而外周血抗-HBs分泌细胞数量可能比血清抗-HBs水平更能反映机体对HBV的持续性免疫反应。
在本发明做出之前，目前外周血抗-HBs分泌细胞的检测困难之处在于：
(1)外周血抗-HBs分泌细胞数量少，检出率低，实验重复性差；
(2)有限稀释法检测抗体分泌细胞操作繁琐、耗时长、难度大，且需要采取的外周血量多，难以进行推广应用；
(3)外周血中除了浆细胞直接分泌抗体之外，记忆B细胞需经过刺激活化才能分化为抗体分泌细胞，因而在未经充分活化时，外周血抗-HBs分泌细胞极难检出，而现有活化及检测外周血抗-HBs分泌细胞的技术存在诸多不足，例如CPG、CD40L、美洲商陆丝裂原等B细胞体外活化方法，均存在活化效率不高的问题，不能使B细胞充分转化为抗体分泌细胞，降低了抗-HBs分泌细胞的检出率。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述缺陷，建立一种检测外周血乙肝表面抗体分泌细胞的方法。
本发明的技术方案是：
一种检测外周血乙肝表面抗体分泌细胞的方法，其主要技术特征在于通过体外刺激活化人外周血单个核细胞(PBMC)，再采用预处理的PVDF板检测PBMC中抗-HBs分泌细胞，检测到一百万个PBMC中的一个抗-HBs分泌细胞。
具体包括以下步骤：(1)无菌收集人外周血；(2)淋巴细胞分离液分离人外周血，获得PBMC；(3)将PBMC采用特殊方法培养活化；(4)收集培养细胞，加入预处理的PVDF板中，放入5％CO2、37℃、饱和湿度的孵育箱内培养；(5)取出PVDF板，洗去细胞，显色；(6)检测和计数斑点，分析外周血抗-HBs分泌细胞比例。
所述步骤(3)中采用1μg/mlR848，10ng/ml IL-2，2μg/ml HBsAg刺激活化PBMC，细胞培养天数为5天。
所述步骤(4)中采HBsAg预处理包被的PVDF板孵育细胞，细胞培养时间为16-24小时。
所述PVDF板采用经乙醇预处理，每孔加10μg/ml HBsAg 200μl，设加15μg/ml的抗人IgG阳性对照孔和加PBS的阴性对照孔，4℃孵育过夜。
本发明的优点和效果在于用R848、HBsAg和IL-2刺激活化人外周血B细胞，并用HBsAg预包被的PVDF板捕获人外周血抗-HBs分泌细胞，减少了检测用血量，提高了检测的敏感度，缩短记忆B细胞活化及乙肝表面抗体分泌细胞检测所需时间。
本发明的其它具体优点和效果将在下面继续说明。
附图说明
图1——本发明中人外周血抗-HBs分泌细胞检测结果示意图：
其中，a为阳性对照：人外周血总IgG分泌细胞/每2500个外周血单个核细胞(PBMC)示意图；b为检测到的人外周血抗-HBs分泌细胞/每200000个PBMC示意图；c为检测到的人外周血抗-HBs分泌细胞/每400000个PBMC示意图；d为阴性对照示意图。
具体实施方式
本发明的技术思路是：
用R848、HBsAg和IL-2刺激外周血人外周血单个核细胞(PBMC)，活化B细胞后采用PVDF板捕获人外周血抗-HBs分泌细胞，经显色处理后进行计数分析。
下面具体说明本发明：
一、B细胞刺激活化
(1)无菌收集人外周血；
(2)淋巴细胞分离液分离获得PBMC；
(3)将PBMC用含10％胎牛血清，1μg/ml R848，2μg/ml HBsAg，10ng/ml IL-2的1640培养液重悬细胞，细胞浓度2×106/ml，放入5％CO2、37℃、饱和湿度的孵育箱内培养5天。
二、PVDF板检测人外周血抗-HBs分泌细胞
(1)10μg/ml的HBsAg包被PVDF板，同时设加15μg/ml的抗人IgG阳性对照孔和加PBS的阴性对照孔，4℃过夜；
(2)收集培养5天的细胞，含10％胎牛血清的1640培养液重悬，加入PVDF板中，每孔细胞数为1-4×105，放入5％CO2、37℃、饱和湿度的孵育箱内培养16-24小时；
(3)弃去细胞，PBS洗板，加入1μg/ml的检测抗体抗人IgG(与包被抗人IgG不同亚型及克隆号)，室温孵育2小时；
(4)弃去多余抗体，PBS洗板，加入1∶1000稀释的Streptavidin-HRP，室温孵育1小时；
(5)PBS洗板，加TMB显色反应，直到明显的斑点出现，大量水冲洗终止显色反应；
(6)避光晾干板，计数抗人IgG对照孔、HBsAg包被孔和阴性对照孔斑点数，计算抗-HBs分泌细胞个数及比例。
本发明的优点和效果在于采用R848、HBsAg和IL-2高效刺激活化人外周血B细胞，并用HBsAg预包被的PVDF板捕获人外周血抗-HBs分泌细胞，提高了检测的敏感度，缩短记忆B细胞活化和检测乙肝表面抗体分泌细胞所需时间。
具体而言：
一、B细胞刺激活化
1.无菌收集人外周血10ml(肝素抗凝)，用淋巴细胞分离液分离获得PBMC，用1640培养液重悬，并计数，可得到PBMC 1×107；
2.在室温下1500转/min离心5分钟，去上清，以洗涤细胞；
3.用含10％胎牛血清，1μg/mlR848，2μg/ml HBsAg，10ng/ml IL-2的1640培养液重悬细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，放入5％CO2、37℃、饱和湿度的孵育箱内培养5天。
二、PVDF板检测人外周血抗-HBs分泌细胞
A.包被PVDF板(无菌)
1.PVDF板每孔加50μl 70％乙醇预湿不超过2分钟，迅速洗板；
2.无菌水200μl/孔洗板5次；
3.每孔加10μg/ml HBsAg，阳性对照孔加15μg/ml抗人IgG，阴性对照孔加PBS，4℃孵育过夜。
B.细胞孵育(无菌)
1.无菌PBS 200μl/孔洗板5次，洗去过量的抗原或抗体；
2.每孔加200μl含10％FBS+2％白蛋白的1640培养基封闭。室温孵育2小时；
3.收集培养5天的细胞，1500转/min离心5分钟，弃上清。1640培养液洗涤细胞，细胞计数；
4.含10％FBS的1640培养液重悬细胞。将细胞悬液加入PVDF板中，每孔细胞数1-4×105；
5.将板放入5％CO2、37℃、饱和湿度的孵育箱内孵育16-24小时，期间避免移动板。
C.检测抗-HBs分泌细胞斑点：(不需无菌)
1.PBS 200μl/孔洗PVDF板5次，洗去细胞；
2.加入100μl/孔1μg/ml的检测抗体抗人IgG(与包被抗人IgG不同亚型及克隆号)，室温孵育2小时；
3.洗板同1；
4.加入100μl/孔1∶1000稀释的Streptavidin-HRP，室温孵育1小时；
5.洗板同1；
6.加100μl/孔TMB显色反应，直到明显的斑点出现；
7.大量水冲洗以停止显色反应；
8.避光晾干板，计数抗人IgG对照孔、HBsAg包被孔和阴性对照孔斑点数，计算抗-HBs分泌细胞个数及比例。
在HBsAg、R848及IL-2刺激培养人外周血PBMC，使外周血B细胞活化，记忆B细胞分化为浆细胞，5天后预包被HBsAg的PVDF板捕获人外周血抗-HBs分泌细胞，显色处理后如图1所示，a为阳性对照，b、c分别为每2×105个PBMC、每4×105个PBMC检测出的抗-HBs分泌细胞，d为阴性对照。