本发明属于免疫检测领域，具体地涉及一种抑制tnf-α的生物制剂血药浓度检测方法及检测试剂。
背景技术：
肿瘤坏死因子(tumournecrosisfactor，tnf)，按其结构分两型：tnf-α和tnf-β，其中由活化的巨噬细胞、单核细胞和t细胞产生的能使肿瘤坏死的因子称为tnf-α；而把由活化的t细胞和nk细胞产生的淋巴毒素(lymphotoxin，lt)称为tnf-β。目前研究较多的是tnf-α，它是一种由157个氨基酸组成、相对分子质量为17kd的可溶性多肽，成熟型tnf-α的活性形式为三聚体。
tnf-α具有双重生物学效应，在浓度较低时，tnf-α主要作为白细胞和内皮细胞的自分泌及旁分泌的调节物，参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染，促进组织修复及调节炎症反应，引起肿瘤细胞凋亡等；在高浓度时，过量的tnf-α在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起产生多种病理损伤。tnf-α对众多的组织器官产生生物学效应，是细胞因子网络中一个重要的多功能成员，是机体维持内部自稳、抵御各种致病因子必不可少的免疫调节因子。
靶向tnf-α的治疗性单抗是目前用于自身免疫性疾病最成功的一类生物制剂，可用于治疗类风湿性关节炎、多发性硬化症、克罗恩病及强直性脊柱炎。目前，抑制tnf-α的治疗性单抗或生物制剂包括英夫利西单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、依那西普(etanercept)、赛妥珠单抗(certolizumabpegol)和戈利木单抗(golimumab)。这些生物制剂都能结合游离的以及膜结合的tnf-α，抑制其与受体结合，阻断其生物效应，但是不同形式的生物制剂通过不同的机制发挥作用。
这些生物制剂的应用，会出现自身抗体的诱导、不良药物反应(adr)、生物利用度和抗体清除等问题，因此，检测患者血清中抑制tnf-α的生物制剂药物浓度，对于患者的用药有较大的指导意义，更有利于患者选择有针对性的治疗方法。
检测tnf-α抑制剂的生物制剂血药浓度难点在于，结合tnf-α的不同抗体药物均不同程度地实现人源化，而且tnf-α有多个不同结合位点，使得检测某种抗体药很容易受到内源性抗体的干扰。国外在中国申请的专利no.102695955a公开了一种检测tnf-α抑制剂的方法：荧光标记tnf-α，然后检测样中加入一定量的标tnf-α标记物，标记物与样品中的抗体血药形成标记复合物，再进一步排阻层析，通过积分复合物峰曲线下面积测得tnf-α抑制剂的浓度，此种方法比较繁锁而且检测速度慢。邹有土、白羊、葛平辉等发表了《阿达木单抗elisa定量检测方法的建立》(《中国医药生物技术》2015年第2期)，其检测阿达木的方法是以htnf抗原为包被抗原，羊抗人igg-hrp为检测抗体，建立了定量测定阿达木单抗的elisa方法，但这种方法对于tnf-α不抑制的抗体药存在明显的非特异性。本发明在抗制备生物制剂的抗体时，为了使制备的抗体具有高度特异性，针对性地把生物制剂的人源化序列置换为所免疫动物免疫球蛋白的相应恒定区序列，从而使本发明试剂比现有试剂具有更好的特异性。中国专利cn201410619644.9公开了一种重组人ii型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度测定方法，其特征是，通过利用链霉亲和素偶联的磁珠及生物标记的抗tnfrii单克隆抗体纯化正常人血清，去除内源性tnf-αrii的正常人血清作为待测样品的稀释液，以此来提高定量的灵敏度，但此方法显然也很繁锁，人血清存在风险，而且来源有限，不适宜商品化的诊断试剂生产，也不适用于其它生物制剂血药检测。
因此检测tnf-α抑制剂的血药浓度需要建立一种简便、快速、特异性高的方法。
技术实现要素：
定义：
本文中术语“生物制剂”指通过抑制或阻断tnf-a的抗体或重组蛋白。
术本文中语“抗体”以最广义使用，且明确涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段。
本文中术语“样品”指自患者获得的出于体外评估目的获得的生物学样品，所述样品是全血、血清或血浆。
方法：
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种生物制剂血药浓度的检测方法，克服已有方法操作复杂、特异性不强的弱点。
本发明提供一种生物制剂血药浓度的检测方法，其特征在于，包括步骤，1)用抗生物制剂的抗体或亲和肽捕获血中的生物制剂，形成生物制剂与抗体的复合物，或生物制剂与亲和肽的复合物；2)用该生物制剂的抗原检测步骤1)的复合物。
在一个较优地实施方案中，本发明所述的抗生物制剂的亲和肽，其特征在于，用噬菌体展示技术筛选获得的能与生物制剂特异性结合的多肽。
在一个较优地实施方案中，本发明所述的亲和肽，其特征还在于，亲和肽的序列与生物制剂的抗原序列完全不同，或同源性80％以下。
在一个实施方案中，本发明所述的抗生物制剂的抗体，其特征在于，用生物制剂的特点序列(单抗的可变区序列)作为免疫源获得的单克隆抗体或多克隆抗体。
在一个实施方案中，本发明所述所述的抗生物制剂的多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体为鸡源、兔源、羊源、马源、驴源中的一种，优选地，所述多克隆抗体为鸡源卵黄抗体igy。
在一个实施方案中，本发明所述的生物制剂血药浓度检测试剂盒，其特征在于，包括不同浓度生物制剂制成的标准品、结合了抗生物制剂抗体的固相载体、酶标记的生物制剂的抗原、酶底物及显示剂。
在又一个实施方案中，检测标准品获得检测数据，用曲线拟合获得标准曲线，将标准曲线信息存储在芯片或二维码中。
建立在抗原-抗体特异性反应的免疫检测方法，关建是获得特异度高的抗体，但为了延长在体内的半衰期和减少不良药物反应(adr)，新一代的各种抑制tnf-α的生物制剂均不同程度地实现人源化，这使想要获得待测生物制剂的特异性抗体变得困难。通过基因工程技术获得待测抗体药物特异度高的抗原表位肽，再用高特异度的抗原表位肽通过传统抗体技术或基因工程抗体技术制备获得亲和肽、单抗或多抗。
本发明具有如下优点：
本发明避免内源性干扰，可实现高信噪比，有效排除样品基质的干扰，具有灵敏度高，特异性强、稳定性好等特点。
具体实施方式
实施例1具有阿达木可变区特异性的鼠单抗的制备
根据已公开阿达木氨基酸序列，通过ncbi数据库比对，得到阿达木人恒定区氨基酸序列，将其与已知小鼠igg1恒定区置换。通过构建真核共表达载体，在cho-s细胞中瞬转，通过亲和层析纯化，获取高纯度鼠源化阿达木作为抗原，对balb/c小鼠进行免疫。通过杂交瘤技术筛选具有阿达木特异性的单克隆抗体细胞株，制备抗体捕获或检测血样中阿达木浓度。
实施例2具有依那西普特异性的鼠单抗的制备
根据已公开依那西普氨基酸序列，通过ncbi数据库比对，获取依那西普-tnf-α受体ii肽序列，通过构建真核表达载体，用鼠igg相应恒定区序列替换依那西普重链和轻链的恒定区序列，在cho-s细胞中瞬转，表达出具有依那西普最小活性单位肽，通过亲和层析纯化，获取高纯度最小活性肽。该活性肽该与klh和bsa载体蛋白偶联，分别作为免疫抗原和筛选包被抗原，免疫原对balb/c小鼠进行免疫，通过杂交瘤技术筛选具有依那西普特异性的抗体的单克隆抗体细胞株，制备抗体捕获或检测血样中依那西普浓度。
实施例3噬菌体展示筛选具有英夫利西单抗可变区特异性的亲和肽
一些病人服用英夫利西单抗一段时间后，体内产生大量针对英夫利西单抗的抗体。通过抽取病人外周血，使用淋巴细胞分离液获取病人淋巴细胞。使用rna提取液，提取淋巴细胞中mrna。设计针对人抗体重链和轻链引物，通过pcr获取抗体重链和轻链文库。设计柔性肽将重链和轻链连接，抗体以融合蛋白形式在丝状噬菌体衣壳表面表达。通过噬菌体展示技术，获取针对英夫利西单抗可变区特异性的抗体可变区基因。通过构建真核表达载体，cho-s细胞中瞬转，表达出完整的英夫利西单抗可变区特异性的亲和肽，可捕获或检测血样中英夫利西单抗浓度。
实施例4具有赛妥珠单抗可变区特异性的兔多抗制备
根据已公开赛妥珠单抗氨基酸序列，通过ncbi数据库比对，获取赛妥珠单抗重链和轻链可变区氨基酸序列，用兔相应免疫球蛋白恒定区序列替换赛妥珠单抗重链和轻链的恒定区序列，通过构建真核表达载体，设计重链+柔性态+轻链组合，在cho-s细胞中瞬转，表达出具有赛妥珠单抗最小单位，通过亲和层析纯化，获取高纯度最小活性单位作为抗原，对大耳白兔进行免疫。通过对兔子股动脉采血，获取阳性血清使用辛酸-硫酸铵对血清中抗体进行沉淀、离心、复溶。将赛妥珠单抗偶联在nhs活化层析填料上，通过亲和纯化获取具有赛妥珠单抗可变区特异性的兔多抗，可捕获或检测血样中赛妥珠单抗。
实施例5具有戈利木单抗可变区特异性的卵黄抗体制备
根据已公开戈利木单抗氨基酸序列，通过ncbi数据库比对，获取戈利木单抗重链和轻链可变区氨基酸序列，用鸡免疫球蛋白相应序列替换恒定区序列，通过构建真核表达载体，设计重链+柔性态+轻链组合，在cho-s细胞中瞬转，表达出具有戈利木单抗最小单位，通过亲和层析纯化，获取高纯度最小活性单位作为抗原，对蛋鸡进行免疫，使用水稀释法将蛋黄中抗体提取。将戈利木单抗偶联在nhs活化层析填料上，通过亲和纯化获取具有戈利木单抗可变区特异性的卵黄抗体，可捕获或检测血样中戈利木单抗。
实施例6生物制剂血药浓度的板式酶促化学发光检测免疫检测
在本实施例方案中，板式酶促化学发光免疫检测系统包括化学发光仪和化学发光检测试剂盒。所述的检测试剂盒包括：用抗生物制剂药物的抗体或亲和肽包被的不透明的微孔板，用辣根过氧化物酶标记的tnf-α抗原试剂，鲁米诺类发光底物，不同浓度生物制剂药物制成的标准品以及洗液。
本实施例方案所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，其中，所述单克隆抗体为鼠源、骆驼源或兔源中的一种，所述多克隆抗体为鸡源、兔源、羊源、马源、驴源中的一种。
本实施例方案检测如下生物制剂血药浓度：英夫利西、阿达木、依那西普、赛妥珠、戈利木单抗，但不限于上述生物制剂的其它抗体药的板式酶促化学发光检测免疫检测。
应用本实施例方案检测戈利木单抗血药浓度，本实施方案所述的多克隆抗体优选为鸡卵黄抗体igy。
将实施例5获得戈利木单抗卵黄抗体igy包被不透明的微孔板，辣根过氧化物酶标记的tnf-α抗原，发光底物为鲁米诺类衍生物。检测时，将含样本加入微孔板，孵育后，样本中的戈利木单抗与微孔板结合形成免疫复合物，进行洗涤，辣根过氧化物酶标记的tnf-α抗原试剂，孵育后得到抗体-戈利木单抗-酶标记物的免疫复合物，洗涤，再加入鲁米诺类发光底物，放板式酶促化学发光检检测，通过拟合的标准曲线计算出样品中的戈利木单抗血药浓度。
实施例7生物制剂血药浓度的磁珠酶促化学发光检测免疫检测
在本实施方案中，磁珠酶促化学发光检测免疫系统包括化学发光仪和化学发光检测试剂盒。所述的检测试剂盒包括：用抗生物制剂药物的抗体或亲和肽包被的磁珠，用碱性磷酸酶标记的tnf-α抗原试剂，金刚烷(amppd)为发光底物，不同浓度生物制剂药物制成的标准品以及洗液。
本实施方案所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，其中，所述单克隆抗体为鼠源、骆驼源或兔源中的一种，所述多克隆抗体为鸡源、兔源、羊源、马源、驴源中的一种。
本实施方案检测如下生物制剂血药浓度：英夫利西、阿达木、依那西普、赛妥珠、戈利木单抗，但不限于上述生物制剂的其它抗体药的磁珠酶促化学发光检测免疫检测。
应用本实施方案检测赛妥珠血药浓度，本实施方案所述的抗体为兔源多克隆抗体。
通过实施例4获得赛妥珠单抗可变区特异性的兔多抗包被纳米磁珠，碱性磷酸酶标记tnf-α抗原，发光底物为金刚烷(amppd)，检测时，将含样本与纳米磁珠试剂混合，样本中的赛妥珠与纳米磁珠的免疫复合物，进行洗涤，再加入碱性磷酸酶标记tnf-α试剂，得到纳米磁珠-赛妥珠-酶标记物的免疫复合物，进行洗涤，再加入amppd发光底物，测定发光结果，通过拟合的标准曲线计算出样品中的赛妥珠血药浓度。
实施例8生物制剂血药浓度的直接化学发光检测免疫检测
在本实施例方案中，基于磁微粒化学发光检测原理来实现生物制剂血药浓度检测，其检测系统包括全自动化学发光仪和化学发光检测试剂盒。所述的检测试剂盒包括：用抗生物制剂的抗体或亲和肽包被的纳米磁珠试剂，用吖啶酯标记的tnf-α试剂，以naoh、h2o2作为发光底物，不同浓度生物制剂制成的标准品。
在本实施例方案的检测原理为：将含生物制剂的样本与纳米磁珠试剂混合，得到样本与纳米磁珠的免疫复合物，进行洗涤，再加入吖啶酯标记tnf-α试剂，得到纳米磁珠-血药-酶标记物的免疫复合物，进行洗涤，再加入发光底物，测定发光结果，通过拟合的标准曲线计算出样品的血药浓度。
本实施例方案所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，其中，所述单克隆抗体为鼠源、骆驼源或兔源中的一种，所述多克隆抗体为鸡源、兔源、羊源、马源、驴源中的一种。
本实施例方案所述的亲和肽，为用噬菌体展示技术筛选获得的能与生物制剂特异性结合的多肽。
本实施例方案所述的纳米磁珠试剂中，磁微粒的直径为0.1-0.5μm，所述磁微粒试剂具有超顺磁性。
本实施例方案检测如下生物制剂血药浓度：英夫利西、阿达木、依那西普、赛妥珠、戈利木单抗，但不限于上述生物制剂的其它抗体药的吖啶酯化学发光免疫检测。
应用本实施例方案检测英夫利西血药浓度，本实施例方案所述的亲和肽为实施例3所得。
按本实施例方案制备的检测英夫利西血药浓度化学发光检测试剂盒，其性能评估如下：
(1)灵敏度：本发明的英夫利西单抗血药浓度化学发光检测试剂盒的lod为6ng/ml。
(2)线性：将一份高值血清按照1/4、1/16、1/64、1/256，用抗tnf-α生物制剂抗体检测试剂盒检测稀释样本，将理论浓度与实际检测浓度做线性回归，r2＝0.998。
(3)准确度：通过加样回收评估其准确度。以一份高值血清、一份中值血清、一份低值血清按照1∶9(体积比)添加到两份基础血清中，计算其浓度。血清加样回收率在85％-115％之间。
添加回收实验(加样回收率＝添加后样本值/(0.1*样本a+0.9样本b)*100％。
(5)精密度：对三种不同浓度的质控品进行检测，每天两次，分上下午检测，每次进行4个重复，共检测10天，每种浓度共测定80次，计算变异系数，结果表明变异系数在15％以内。
(6)稳定性：将本发明英夫利西单抗血药浓度检测试剂盒37℃放置7天后，测定高、中、低3个浓度的质控，结果表明3种质控的检测浓度均在质控的浓度范围内。
(7)特异性：对高、中、低不同浓度值的血清添加不同浓度的胆红素、血红蛋白、类风湿因子、脂，检测结果显示，添加物质对本发明英夫利西单抗血药浓度检测结果没有影响。
实施例9生物制剂血药浓度的时间分辩荧光免疫层析检测(方法一)
在本实施例方案中，制备荧光免疫层析试纸条，试纸条支撑片上顺次搭接粘贴的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的结合垫上包被有检测荧光微球和质控荧光微球，检测荧光微球上标记有抗生物制剂的抗体或亲和肽，质控荧光微球荧光微球上标记抗鸡igy抗体所述的硝酸纤维素膜上有检测带t线位和质控带c线，包被有检测带t线位置包被tnf-α，质控带c线位置包被鸡igy。
在本实施例方案中，用检测荧光微球捕获血中的生物制剂，形成生物制剂与抗体微球复合物，经层析作用，生物制剂与抗体微球复合物在检测带t线位置与包被tnf-α结合，荧光微球标记抗鸡igy抗体与质控带c线位置包被鸡igy结合，荧光分析仪检测t线和c线的荧光信号，最终以t/c计算结果。本方案用检测标准品获得检测数据，用曲线拟合方式获得算法，把计算公式存储在芯片或生成的二维码中，从标曲线可获得检测的血药浓度。
本实施例方案制备检测试剂盒包括：时间分辩荧光免疫层析试纸条，存储有标准线信息的芯片或二维码，样品稀释液。
在本实施方案所述的时间分辨荧光微球粒的径范围为150～300nm，优选粒径为210nm；所述时间分辨荧光微球的微球材料为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物，优选为聚苯乙烯；
所述时间分辨荧光微球的荧光发光物为铕、钐、铽或镝等稀有元素，优选为铕元素；微球表面基团为氨基、羧基、巯基或羟基等基团，优选为羧基。
所述时间分辨荧光微球的激发波长为300～500nm，优选为360nm；发射波长为500～700nm，优选为615nm。
所述样品结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯膜经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥而得。
本实施方案所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，其中，所述单克隆抗体为鼠源、骆驼源或兔源中的一种，所述多克隆抗体为兔源、羊源、马源、驴源中的一种。
本实施方案检测如下生物制剂血药浓度：英夫利西、阿达木、依那西普、赛妥珠、戈利木单抗，但不限于上述生物制剂的其它生物制剂的荧光免疫检测。
应用本实施例方案，检测阿达木单抗血药浓度，本实施例方案所述的单克隆抗体为实施例1所制得。
按照本实施例方案制备阿达木单抗血药浓度时间分辨检荧光免疫层析定量检测试剂盒，其制备方法如下：
(1)时间分辨荧光微球的标记
取时间分辨荧光微球微球1000ul(210nm)(1％原液)，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入1000ul去离子水超声10s混匀；离心，弃上清，加入mesbuffer(50mm，ph6.0)1000ul，超声10s混匀；离心，弃上清，加入mesbuffer1000ul，超声混匀，称量50mgedc，缓慢加入微球混合液中，混匀，反应中会有部分团聚，及时超声混匀，室温反应15分钟；离心，弃上清，加硼酸盐缓冲液(20mm，ph8.0)1000ul，超声10秒混匀；离心，弃上清，加硼酸盐缓冲液1000ul，超声10秒混匀，加入抗阿达木单克隆抗体120ug，室温摇床中速反应2小时；离心，弃上清，加入1000ul封闭液，冰水超声混匀，室温摇床中速反应1小时；离心，弃上清，加入1000ul硼酸盐缓冲液(20mmph8.0)，冰水超声10-30秒混匀，做好标签，4℃保存待用。
(2)样品垫、结合垫的处理
玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：100mmph7.4pb，其中含有2％nacl，2％bsa、0.5％酪蛋白、0.1％吐温-20、0.5％s9和5％蔗糖)浸泡进行预封闭后，37℃干燥过夜，制备得到样品垫；取制备好的样品垫，通过金标hm3035喷金划膜仪的喷头，将标记有时间分辨荧光微球的tnf-α和兔抗鸡igy抗体按照8μl/cm的量超声喷雾至预处理过宽为1cm的样品垫上，37℃(湿度小于30％)干燥，干燥时间至少3小时，制备得到结合垫。
(3)硝酸纤维素膜(nc膜)处理
将nc膜贴至背衬底板的制定位置，用50mm的ph7.4磷酸盐缓冲液将tnf-a稀释至1mg/ml，用于制备t线；50mm的ph7.4磷酸盐缓冲液将鸡igy抗体稀释至0.5mg/ml，用于制备c线；按1μl/cm划液量，通过金标hm3035喷金划膜仪将上述两种稀释后的抗体均匀的划至nc膜上制备t线和c线；将划好的nc膜放置于37℃干燥箱中，干燥过夜。
本实施例之中，所述时间分辨荧光物质乳胶微球为含铕乳胶微球，即时间分辨荧光物质为镧系元素铕与乳胶的结合物；根据需要，所述时间分辨荧光物质可以调整为镧系元素、镧系元素与乳胶的结合物、镧系元素的螯合物中的一种；镧系元素可以为铕，铽，钐或镝中的一种。
(4)组装
将步骤2)得到的结合垫叠压在步骤3)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，最后将步骤2)得到的样品垫叠压在结合垫另一端，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。
(5)检测
检测标准品获和样品得，用曲线拟合方式获得算法，把计算公式存储在芯片或生成的二维码中，从标曲线可获得检测的阿达木单抗血药浓度。
实施例10生物制剂血药浓度的时间分辩荧光免疫层析检测(方法二)
在本实施例方案中，制备荧光免疫层析试剂盒包括：荧光免疫层析试纸条，含有检测荧光微球和质控荧光微球的试剂，存储有标准曲线信息的芯片或二维码。
本实施例方案中，所述试纸条的支撑片上顺次搭接粘贴的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述检测荧光微球上标记有抗生物制剂的抗体或亲和肽，所述质控荧光微球荧光微球上标记抗鸡igy抗体，所述的硝酸纤维素膜上有检测带t线位和质控带c线，所述检测带t线位置包被tnf-α，所述质控带c线位置包被鸡igy。
本实施例方案检测如下生物制剂血药浓度：英夫利西、阿达木、依那西普、赛妥珠、戈利木单抗，但不限于上述生物制剂的其它生物制剂的荧光免疫检测。
应用本实施例方案，检测依那西普血药浓度，本实施例方案所述的单克隆抗体为实施例2所制得。
按照本实施例方案中制备依那西普血药浓度时间分辨荧光免疫层析定量检测试剂盒，将时间分辨荧光微球标记抗依那西普单克隆抗体，在检测带t线位置包被tnf-α，质控荧光微球标记抗鸡igy抗体，质控带c线位置包被鸡igy，最终以t/c计算结果。本方案用检测标准品获得检测数据，用曲线拟合方式获得算法，把计算公式存储在芯片或生成的二维码中，从标曲线可获得检测的血药浓度。
依那西普血药浓度时间分辨荧光免疫层析定量检测试剂盒评价：
(1)标准曲线制作
取依那西普血药浓度校准品一套，具体值见表1.
表1
检测方法：
取校准品100μl，直接加入层析条中样品窗口；10分钟之后，用时间分辨荧光定量分析仪定量检测发光值。
每个校准品检测2次，取t/c值的平均值。具体结果见表2.
表2
标准曲线制备：
根据上述检测结果，以t/c值的对数值为x轴，以浓度的对数值为y轴进行线性回归，得到线性方程y＝0.4262x-0.7771，r2＝0.9972。
(3)精密度测试：
结果见表3，说明本发明的依那西普血药浓度时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条精密度良好。
表3