基于高浓度盐溶液下金纳米的聚沉构建的化学生物传感器、制备方法及应用与流程

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及基于高浓度盐溶液下金纳米的聚沉构建的化学生物传感器、制备方法及应用；实现对avidin的灵敏检测。

背景技术：

抗生物素蛋白(avidin)是一种广泛存在于生蛋清中的一种碱性糖蛋白，第一次被发现在20世纪上半期。抗生物素蛋白在癌症的治疗过程中起着重要的作用，如肿瘤细胞的定位和成像。

随着研究的深入，由于其抗菌活性和杀虫技能，抗生物素蛋白被广泛用于基于工程，这可能会导致抗生物素蛋白的残留。生物素(biotin)作为一种水溶性维生素，是正常代谢和重要的生化过程所必需的。抗生物素蛋白-生物素之间的缔合常数K＝10^-15，是最大的蛋白质和小分子之间的非共价键相互作用之一。近几十年里，这种复合物的稳定性已被应用于许多系统中。抗生物素蛋白-生物素系统在免疫组化、免疫细胞/组织工程和生物传感应用等中的应用具有重要的意义。

然而，过量的抗生物素蛋白的残留会导致生物素营养不良。因此，检测avidin的含量是非常重要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供基于高浓度盐溶液下金纳米的聚沉构建的化学生物传感器及其制备方法，将biotin标记在DNA单链上并和avidin结合对DNA单链起保护作用，由于单链DNA和AuNPs之间的相互作用，使得AuNPs在高盐浓度下不发生聚沉。

本发明还提供了基于高浓度盐溶液下金纳米的聚沉构建的化学生物传感器可视化检测avidin的应用，具有高灵敏性、特异性、稳定性。

本发明提供的基于高浓度盐溶液下金纳米的聚沉构建的化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

1)、将抗生素蛋白avidin溶液和biotin-ssDNA溶液混合在PBS缓冲液中，培养，使avidin与biotin-ssDNA结合，对DNA单链起保护作用；

2)将Exo I剪切酶加入步骤1)培养后的溶液中，加热反应，然后冷却至室温；

3)室温下，将AuNPs加入步骤2)得到的冷却后的反应液中反应，最后加入NaCl溶液，利用AuNPs在高盐浓度下发生聚沉而使溶液颜色变化，制备得到化学生物传感器。

步骤1)之前制备抗生素蛋白avidin溶液：将购买的抗生素蛋白avidin用二次水溶解，浓度为1μM，4℃下保存备用；

步骤1)之前制备biotin-ssDNA溶液：将购买的biotin-ssDNA用二次水溶解，浓度为2μM，4℃下保存备用；biotin-ssDNA序列为5-CCCTCTATCTATCTCTCTCTCTCTCACTTA-biotin-3。

步骤1)中所述PBS缓冲液浓度为0.05M；

步骤1)中所述培养具体为：在30～37℃下反应20-30min；

步骤1)具体为：将30μL 1μM的抗生素蛋白avidin溶液和30μL 2μM biotin-ssDNA溶液混合在40μL PBS缓冲液中，在30～37℃下反应20-30min。

步骤2)中所述加热反应具体为：先在30～37℃下反应20min后，再85～95℃热水浴20-30min。

先在30～37℃下反应20min，目的是使Exo I剪切酶水解DNA，然后再85～95℃热水浴20min目的是使Exo I剪切酶失活，以免影响后续检测。

步骤2)具体为：将10U Exo I剪切酶加入步骤1)培养后的溶液中，在37℃下反应20min后，85℃热水浴，热水浴20min后拿出冷却至室温。

步骤3)中AnNPs制备方法为：加热50mL，1mg/mL的HAuCl₄溶液直至沸腾，然后将2mL 1mg/mL柠檬酸钠溶液迅速加入煮沸的HAuCl₄溶液中，剧烈搅拌，直至溶液颜色变成深红色，再加热30min，然后停止加热并冷却至室温，后装入容量瓶备用。所有参与反应的玻璃仪器及转子均在王水中浸泡12h以上。

步骤3)中NaCl溶液溶度大于0.12M，优选的为：0.2M。

步骤3)具体为：将200μL AuNPs加入步骤2)得到的冷却后的反应液中反应10min，最后加入120μL 0.2M的NaCl溶液，利用AuNPs在高盐浓度下发生聚沉而使溶液颜色变化，制备得到化学生物传感器。

本发明提供的一种基于高浓度盐溶液下金纳米的聚沉构建的化学生物传感器，采用上述方法制备得到。

本发明提供的基于高浓度盐溶液下金纳米的聚沉构建的化学生物传感器用于检测抗生素蛋白avidin；

具体检测方法为：将biotin标记在DNA单链上并和avidin结合构建末端保护体系对DNA单链起保护作用，保护DNA不被Exo I剪切酶水解，由于单链DNA和AuNPs之间的相互作用，使得AuNPs在高盐浓度下不发生聚沉，不同浓度的avidin溶液，体系颜色不同，吸光度不同，实现对不同浓度的avidin定量检测。

与现有技术相比，本发明利用高盐浓度下会使AuNPs发生聚沉，溶液颜色由酒红色变成灰蓝色的原理，将biotin标记在DNA单链上并和avidin结合对DNA单链起保护作用，由于单链DNA和AuNPs之间的相互作用，使得AuNPs在高盐浓度下不发生聚沉，不同浓度的avidin溶液，颜色不同。基于此机理制备生物传感器，线性范围为10-180ng/mL,检测限为0.004μg/mL。此传感器实现了对avidin灵敏性、特异性、稳定性的检测。

附图说明

图1为基于高盐浓度下AuNPs的聚沉和DNA的末端保护作用可视化检测抗生物素蛋白avidin的实验原理图；

图2为检测avidin的可行性分析图，曲线a为不存在avidin时溶液的紫外吸收曲线，曲线b为存在avidin时溶液的紫外吸收曲线；

图3为NaCl浓度对本实验的影响图；

图4为Exo I剪切酶对本实验的影响图；

图5为avidin和biotin的反应时间对本实验的影响图；

图6为avidin和biotin的反应温度对本实验的影响图；

图7为不同浓度的avidin对本实验的影响图；

从上到下浓度分别为10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，60ng/mL，80ng/mL，100ng/mL，120ng/mL，140ng/mL，160ng/mL，180ng/mL和200ng/mL的avidin的紫外光谱图；

图8为不同浓度下吸光度的线性关系；

图9为该方法对lysozyme,trypase,thrombin,BSA和avidin的选择性对比图。

具体实施方式

实施例1

基于高浓度盐溶液下金纳米的聚沉构建的化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

A、制备抗生素蛋白avidin溶液：将购买的抗生素蛋白avidin用二次水溶解，浓度为1μM，4℃下保存备用；制备biotin-ssDNA溶液：将购买的biotin-ssDNA用二次水溶解，浓度为2μM，4℃下保存备用；制备浓度为0.05M PBS缓冲液浓度，4℃下保存备用；

B、将30μL抗生素蛋白avidin溶液和30μL biotin-ssDNA溶液混合在40μL PBS缓冲液中，在37℃下反应0.5h；

C、将10U Exo I剪切酶加入步骤1)培养后的溶液中，在37℃下反应20min后，85℃热水浴，热水浴20min后拿出冷却至室温；

D、将200μL AuNPs加入步骤2)得到的冷却后的反应液中反应10min，最后加入120μL NaCl溶液，利用AuNPs在高盐浓度下发生聚沉而使溶液颜色变化，制备得到化学生物传感器。

与实施例1相同的实验条件下，不加入avidin溶液，分别测量2个体系的紫外吸收曲线，结果如图2所示。

实施例2

利用上述制备的传感器检测avidin的浓度：

A、制备抗生素蛋白avidin溶液：将购买的抗生素蛋白avidin用二次水溶解，浓度为1μM，4℃下保存备用；制备biotin-ssDNA溶液：将购买的biotin-ssDNA用二次水溶解，浓度为2μM，4℃下保存备用；制备浓度为0.05M PBS缓冲液浓度，4℃下保存备用；

B、分别将不同浓度的抗生素蛋白avidin溶液和30μL biotin-ssDNA溶液混合在40μL PBS缓冲液中，此时，抗生素蛋白avidin的浓度分别为10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，60ng/mL，80ng/mL，100ng/mL，120ng/mL，140ng/mL，160ng/mL，180ng/mL和200ng/mL，在37℃下反应0.5h；

C、将10U Exo I剪切酶加入步骤1)培养后的溶液中，在37℃下反应20min后，85～95℃热水浴，热水浴20min后拿出冷却至室温；

D、将200μL AuNPs加入步骤2)得到的冷却后的反应液中反应10min，最后加入120μL NaCl溶液，利用AuNPs在高盐浓度下发生聚沉而使溶液颜色变化，测得的吸光度与avidin浓度建立线性关系(图7和图8)，然后相同条件下实验，测量未知浓度的avidin体系的吸光度，根据建立的线性关系得avidin浓度。

实施例3

改变NaCl浓度，其他步骤同实施例1，NaCl浓度对本实验的影如图3；

改变Exo I剪切酶用量，其他步骤同实施例1，Exo I剪切酶用量度对本实验的影如图4；

改变avidin和biotin的反应时间，其他步骤同实施例1，avidin和biotin的反应时间对本实验的影如图5；

改变avidin和biotin的反应温度，其他步骤同实施例1，avidin和biotin的反应温度对本实验的影如图6；

实施例4

将检测对象avidin分别改为lysozyme,trypase,thrombin,BSA，检测条件不变，本发明检测方法对lysozyme,trypase,thrombin,BSA和avidin的选择性对比如图9。