一种基于Diels‑Alder反应制备纳米银抗菌材料的方法与流程

本发明涉及一种具有可控抗菌活性的纳米银抗菌材料的制备方法，具体是一种基于Diels-Alder反应制备纳米银抗菌材料的方法，属于纳米材料、抗菌材料技术领域。

背景技术：

在过去的几十年中，对抗生素的研究，特别是对银纳米颗粒(AgNPs)的抗菌活性的研究逐渐增多。特别值得注意的是，AgNPs在生物医学领域方面的应用，例如纸、纺织品织物、伤口敷料、食物储存容器、导管、绷带、饮用水灭菌、烧伤护理、家庭消毒喷剂、抗菌涂层以及牙科树脂复合材料。AgNPs在生物医学领域方面的应用逐渐增多是由于：银离子对大肠杆菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌等都具有高抗菌活性，但对动物细胞却具有较低的毒性；并且，与有机抗生素不同，银离子和银基材料的耐药性很少出现。也就是说，大部分的细菌没有建立起对银的免疫力。最近，Durán等人报道了AgNP与两亲性超支化大分子的复合材料可用于抗菌表面涂层，结果表明，在潮湿的治疗环境中该复合材料对感染的角质形成细胞具有良好的抗菌性。由于纳米银是一类用途广泛的广谱抗菌剂，它在医药领域具有很大的前景。纳米银抗菌的作用机制、细菌耐药性、毒理学和临床等研究也日渐增多。

AgNPs的生物学活性与Ag⁺及其相关的可溶性复合物有关。原因之一是银离子可以通过与蛋白质的硫基发生作用来破坏细菌的呼吸链。另一个原因是AgNPs的表面可以直接吸收Ag⁺。这样，银胶体具有三种存在形式：AgO固体，游离的Ag⁺或其络合物，银表面吸附的Ag⁺。

然而，目前的银抗菌材料仍然存在一些限制，例如：有机抗菌剂可以很方便地设计出可控释放性质，并广泛用于药物输送、组织工程和分子成像领域；然而，对于纳米银抗菌材料，则很难调控其抗菌活性，活性不可控导致应用受到限制。最近，Xiu等报道，银纳米颗粒具有不同形貌和尺寸时，可能会影响银离子的释放行为，这将有助于制备具有控释行为的含银抗菌材料。

因此，有必要建立一种科学的、抗菌活性可调控的纳米银抗菌材料的制备方法。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种基于Diels-Alder反应制备纳米银抗菌材料的方法。

术语说明：

Diels-Alder反应：狄尔斯-阿尔德反应，简称DA反应。

本发明是通过如下技术方案实现的：

发明概述：

本发明的方法基于呋喃和双马来酰亚胺之间的DA反应，通过其可逆交联反应使银纳米颗粒结合在一起。由于该可逆反应可通过温度来控制其反应程度，因此通过控制温度可以很方便地获得具有不同尺寸的银纳米颗粒。然后，通过改变纳米银的粒度来获得不同的抗菌性能，可以调控银纳米颗粒的抗菌活性。换句话说，本发明的方法为呋喃和双马来酰亚胺通过DA反应在银纳米颗粒之间产生交联，进而可以获得不同抗菌性能的银纳米颗粒。不同交联程度的银纳米颗粒的抗菌活性不同。

发明详述：

一种基于Diels-Alder反应制备纳米银抗菌材料的方法，包括步骤如下：

(1)银纳米颗粒的功能化

将银纳米颗粒溶液加入乙二醇溶液中，搅拌均匀，制得含纳米银的混合物；然后，将含有糠基硫醇的二甲基甲酰胺溶液缓慢滴加到含纳米银的混合物中；于100～130℃下搅拌2～6小时，反应结束后冷却至室温，得到呋喃官能化的银纳米颗粒溶液；

(2)银纳米颗粒的交联

将N，N'-(4,4'-亚甲基二苯基)二马来酰亚胺溶于二甲基甲酰胺中，搅拌均匀，加入到呋喃官能化的银纳米颗粒溶液中，将混合物于温度50～130℃范围内不同温度下分别搅拌反应1～6h，反应后的溶液离心后，沉淀物用丙酮洗涤、真空干燥，得到不同抗菌活性的纳米银抗菌材料。

本发明优选的，步骤(1)银纳米颗粒溶液与乙二醇溶液的体积比为：1：(2～6)，优选的，银纳米颗粒溶液与乙二醇溶液的体积比为：1：3。

本发明优选的，步骤(1)含有糠基硫醇的二甲基甲酰胺溶液中糠基硫醇的浓度为1.0～1.5mL/100mL，优选的，含有糠基硫醇的二甲基甲酰胺溶液中糠基硫醇的浓度为1.1mL/100mL。

本发明优选的，步骤(1)中，含有糠基硫醇的二甲基甲酰胺溶液与含纳米银的混合物的体积比为：1：(4～10)，优选的，含有糠基硫醇的二甲基甲酰胺溶液与含纳米银的混合物的体积比为：1：4。

本发明优选的，步骤(1)中，反应温度为110～120℃，反应时间为2～3h，最为优选的，反应温度为120℃，反应时间为3h。

本发明优选的，步骤(2)中N，N'-(4,4'-亚甲基二苯基)二马来酰亚胺与二甲基甲酰胺的质量体积比为：1：(200～250)，单位：g/mL，最为优选的，N，N'-(4,4'-亚甲基二苯基)二马来酰亚胺与二甲基甲酰胺的质量体积比为：1：225，单位：g/mL。

本发明优选的，步骤(2)中N，N'-(4,4'-亚甲基二苯基)二马来酰亚胺与呋喃官能化的银纳米颗粒溶液的质量体积比为：1：(1500～2500)，单位：g/mL，最为优选的，N，N'-(4,4'-亚甲基二苯基)二马来酰亚胺与呋喃官能化的银纳米颗粒溶液的质量体积比为：1：1875，单位：g/mL。

本发明优选的，步骤(2)中分别于温度60℃，70℃，80℃，90℃，100℃，110℃，120℃下搅拌4小时。

本发明优选的，银纳米颗粒溶液为现有技术，按现有制备方法制备得到。

本发明优选的，步骤(1)中银纳米颗粒溶液中银纳米颗粒的粒径为10～100nm。

本发明所用原料均为现有技术。

原理说明：

呋喃与马来酰亚胺之间的反应为可逆反应，且反应程度受温度影响明显。本发明首先把呋喃基团修饰到纳米银上，然后在溶液中加入双马来酰亚胺，使纳米银颗粒之间发生交联。这时，溶液中存在正向与逆向两种反应，共同决定了反应程度。正向反应可把纳米粒子交联到一起，逆向反应则使交联的纳米粒子分散开。通过改变反应温度就得到了不同交联程度的纳米银；交联程度直接影响着纳米银尺寸，进而影响到纳米银的抗菌活性。例如，升高温度使交联程度增大，纳米银的尺寸增大，抗菌活性减小。

本发明的优点如下：

1、本发明的方法可得到不同形貌和尺寸的纳米银抗菌材料，抗菌活性可控可调，扩大了应用范围，本发明用可逆的Diels-Alder反应来控制纳米银颗粒的尺寸，抗菌活性随颗粒尺寸的变化而变化，颗粒越小抗菌性越强。

附图说明

图1为银纳米颗粒溶液、纯水与不同纳米银抗菌材料的电导率柱状图；

图2为银纳米颗粒溶液、纯水与不同纳米银抗菌材料的抗菌活性柱状图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。

银纳米颗粒溶液的制备：

将10.5g聚乙烯吡咯烷酮加入到49.8ml乙二醇溶液中加热至60℃，使聚乙烯吡咯烷酮全部溶解，然后，将加入1.5g AgNO₃，并在120℃下加热1.5小时，反应完成后冷却至室温后即得银纳米颗粒溶液。

实施例1

一种基于Diels-Alder反应制备纳米银抗菌材料的方法，步骤如下：

1、将银纳米颗粒溶液15ml溶于45ml乙二醇溶液中。然后，将含有糠基硫醇的DMF溶液15ml缓慢滴加到上述混合物中。在120℃下搅拌3小时，然后使反应混合物冷却至室温。

2、将N，N'-(4,4'-亚甲基二苯基)二马来酰亚胺0.04g溶于DMF 9ml中。然后将其加入到呋喃官能化的银纳米颗粒溶液。将混合物分别在60℃，70℃，80℃，90℃，100℃，110℃，120℃下搅拌4小时，将银纳米颗粒的溶液离心后，用丙酮洗涤三次，并真空干燥，得到深绿色或灰黑色不同抗菌活性的纳米银抗菌材料粉末，不同温度下得到的产品分别记为产品1(60℃)、产品2(70℃)、产品3(80℃)、产品4(90℃)、产品5(100℃)、产品6(110℃)、产品7(120℃)。

实验例：

将得到的产品1-产品7进行电导率实验和抗菌活性实验，具体如下：

一：电导率实验：

电导率测试对于证明纳米银抗菌材料的释放性能是一个有用的方法，因为单质银转变成银离子后可释放到水溶液中，使水溶液的电导率发生显著变化。不同纳米银抗菌材料的电导率如图1所示。实验证明，纯银纳米颗粒具有最大的电导率，其次是在不同温度下反应后，具有不同DA反应转化率的官能化的银纳米颗粒。原因是具有较小尺寸的银纳米颗粒具有较大的表面积，并且更容易与水反应以产生更多的银离子，使溶液的导电率显著增大。通过DA反应的交联使银纳米颗粒的尺寸增大，因此电导率逐渐降低。

二、抗菌活性实验：

1、抗菌活性测试方法

在接种细菌的琼脂中冲压出8mm直径的圆圈。除去内部琼脂以产生空孔。将所需的银纳米颗粒溶液(50μl，约0.001506mg)加入到接种的琼脂平板的预打孔中。盖上琼脂平板并培养24小时以促进细菌生长。测量和记录每个孔周围的抗菌透明区的直径。

为了研究交联反应对抗菌活性的影响，使用三种细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌)进行抗菌试验。图2显示银纳米颗粒的每个样品均具有明显的抗菌活性。更重要的是，当使用不同温度的DA反应来控制AgNPs的交联时，获得了不同的抗菌性能。粒径随交联度的增加而增加，导致抗菌活性明显降低。该结果对于制备具有可控抗菌活性的纳米银抗菌材料将是非常有意义的。

实施例2

一种基于Diels-Alder反应制备纳米银抗菌材料的方法，同实施例1，不同之处在于：

步骤(1)银纳米颗粒溶液与乙二醇溶液的体积比为：1：5。

步骤(1)含有糠基硫醇的二甲基甲酰胺溶液中糠基硫醇的浓度为1.4mL/100mL，优选的。

步骤(1)中，含有糠基硫醇的二甲基甲酰胺溶液与含纳米银的混合物的体积比为：1：8。反应温度为110℃。

步骤(2)中N，N'-(4,4'-亚甲基二苯基)二马来酰亚胺与二甲基甲酰胺的质量体积比为：1：240，单位：g/mL。

步骤(2)中N，N'-(4,4'-亚甲基二苯基)二马来酰亚胺与呋喃官能化的银纳米颗粒溶液的质量体积比为：1：2000，单位：g/mL。

实施例3

一种基于Diels-Alder反应制备纳米银抗菌材料的方法，同实施例1，不同之处在于：

步骤(1)银纳米颗粒溶液与乙二醇溶液的体积比为：1：2。

步骤(1)含有糠基硫醇的二甲基甲酰胺溶液中糠基硫醇的浓度为1.0mL/100mL，。

步骤(1)中，含有糠基硫醇的二甲基甲酰胺溶液与含纳米银的混合物的体积比为：1：5。反应温度为115℃。

步骤(2)中N，N'-(4,4'-亚甲基二苯基)二马来酰亚胺与二甲基甲酰胺的质量体积比为：1：210，单位：g/mL。

步骤(2)中N，N'-(4,4'-亚甲基二苯基)二马来酰亚胺与呋喃官能化的银纳米颗粒溶液的质量体积比为：1：1600，单位：g/mL。