一种基于多孔介质模型的细胞物理状态的表征方法与流程

本发明涉及细胞表征技术领域，更具体地，涉及一种基于多孔介质模型的细胞物理状态的表征方法。

背景技术：

现有的描述细胞力学状态的方法主要有基于赫兹模型利用杨氏模量表征细胞刚度，基于粘弹性理论利用松弛模量与表观粘度来对细胞进行表征，以及基于多孔介质理论来计算细胞质的扩散系数。

利用赫兹模型来计算细胞杨氏模量的方法主要是利用原子力显微镜对细胞进行压痕实验采集细胞的力-距离曲线，针对不同形状的探针利用不同的公式进行拟合。

对于锥形探针，利用锥形探针对细胞进行压痕实验，如图1中(a)所示，有：

对于球形探针，利用锥形探针对细胞进行压痕实验，如图1中(b)所示，有：

其中，f是加载力，e是杨氏模量，v是泊松比，是锥形探针的半开角，r是球形探针的半径，δ是压入深度。

利用粘弹性模型计算粘度与刚度的方法是先让探针以一定的速度压入细胞一定的压入深度，然后让其静置一定的时间，力曲线会随静置时间出现一个松弛现象。通过将松弛阶段的力曲线与如下方程进行拟合：

其中，er是松弛模量，τσ和τs分别是荷载和变形的松弛时间常数，表观粘度可以根据下式进行计算：

μ＝er(τσ-τε)

afm探针对细胞所施加的力可以通过：

f＝s×δ×k

来计算，其中，s是探针的敏感度，δ是deflection值的变化，k是探针的力常数。

利用多孔介质模型测量细胞扩散系数的方法也主要是利用松弛阶段的曲线进行拟合。拟合方程如下：

对于锥形探针，有：

α＝(2/π)δtanθ

对于球形探针，有：

其中，d是扩散系数，α是有效接触面积。

传统的表征细胞的物理状态的方法不论是从模型假设上还是数据采集上具有它们的不足。在模型假设上，赫兹模型将细胞假设为一个均质弹性体，粘弹性模型将细胞看作是完全粘弹性体，多孔介质模型将细胞假设为一个单一的多孔介质体系。而这些假设均不符合细胞本身的状态。在数据采集上，赫兹模型一直存在两个问题，一是不同压入深度下测量得到的杨氏模量的值有较大差异，二是不同加载速率下测量得到的值也有较大差异。此外，以往的多种模型，都只采用了基于该模型的一种或两种物理参数来作为表征细胞力学状态的主要标准，而细胞内部由于其复杂性，由一种或两种参数来描述其物理状态可能并不能满足需要，而且其描述的状态也有一定的片面性，并不能准确或完善的描述细胞所处的生理状态。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

本发明要解决的技术问题是如何减少在不同压入深度以及不同加载速率下获取得到的杨氏模量值之间的差异。

(二)技术方案

为了解决上述问题，本发明提供了一种细胞杨氏模量的获取方法，包括：

s1.基于待测细胞表面的加载力-时间曲线，获取待测细胞在时间为区域无穷大时的加载力与压入深度；

s2.基于待测细胞在时间为区域无穷大时的加载力与压入深度，利用赫兹模型计算得到待测细胞的杨氏模量。

优选地，s1具体为：

基于待测细胞表面afm探针的形变-时间曲线，利用粘弹性模型得到待测细胞表面的加载力-时间曲线，获取待测细胞在时间为区域无穷大时的加载力与压入深度。

优选地，在所述形变-时间曲线的获取中，数据采集步骤包括：退针段、静置段、近针段和松弛段。

优选地，所述数据采集步骤具体为：

s11.根据待测细胞的力曲线，估测得到探针与待测细胞接触点的位置，以所述估测位置为接触点，将探针抬起置于第一高度，记为退针段，采集退针段的时间值和afm探针deflection变化值；

s12.在所述第一高度将探针静置，记为静置段，采集静置段的时间值和afm探针deflection变化值；

s13.以第一速度令探针下降第一距离，从而在细胞表面获得第一压入深度，记为近针段，采集近针段的时间值和afm探针deflection变化值；

s14.保持探针在所述第一压入深度不变，记录探针的松弛行为，记为松弛段，采集松弛段的时间值和afm探针deflection变化值。

优选地，所述数据采集步骤还包括：

以s11-s14为一个周期，重复多个周期。

优选地，所述第一速度至少为10μm/s。

根据本发明的一个方面，还提供了一种细胞物理状态的表征方法，包括：使用杨氏模量、表观粘度和扩散系数综合表征细胞物理状态；其中，所述杨氏模量为使用上述细胞杨氏模量的测量方法获得。

优选地，所述表观粘度为基于上述细胞杨氏模量的测量方法中所述松弛段的曲线，利用粘弹性模型进行拟合获得。

优选地，所述扩散系数为基于上述细胞杨氏模量的测量方法中所述松弛段的曲线，利用多孔介质模型进行拟合获得。

优选地，所述表征方法还包括：使用综合孔隙度结合杨氏模量、表观粘度和扩散系数综合表征细胞物理状态；其中，所述综合孔隙度利用单一孔径多孔介质理论计算获得。

根据本发明的一个方面，还提供了一种细胞介孔弹性或刚度的获取方法，包括：使用权利要求上述所述细胞杨氏模量的获取方法获取细胞杨氏模量，以表征细胞的介孔弹性或刚度。

本发明提出的方法以多孔介质模型为基础，可以有效地解决利用传统方法根据赫兹模型测量杨氏模量以及细胞刚度所存在的不同压入深度与不同加载速率下测量得到的结果差异大的问题，并合理地解释传统方法测量出现差异的原因；本发明提出的细胞表征方法解决传统利用各种物理模型来描述细胞物理状态所存在的不充分与不全面的问题，根据多级次多相多孔介质理论，更深刻的揭示细胞内力学行为的本质，更全面更综合的描述细胞内部的物理状态。基于组织也是多级次多相多孔介质，本发明的方法可以适用于组织或仿生材料，将其应用于临床医学，将有可能帮助科学工作者认清疾病发生的原因以及对疾病的诊断和治疗。

附图说明

图1为现有技术中锥形探针(a)、球形探针(b)分别对细胞进行压痕实验的示意图；

图2为根据本发明实施方式中细胞杨氏模量的获取方法的总体流程图；

图3为根据本发明一个优选实施例中一个周期实验中z向距离随时间变化的曲线图(a)、deflection随z向距离变化的曲线图(b)和deflection随时间变化的曲线图；

图4为根据本发明一个优选实施例中利用传统方法与本发明的方法所测量得到的3t3细胞杨氏模量值随压入深度变化的曲线图；

图5为根据本发明一个优选实施例中利用传统方法与本发明的方法所测量得到的dc细胞杨氏模量值随加载速率变化的曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明提供的细胞杨氏模量的获取方法，如图2所示，包括：

s1.基于待测细胞表面的加载力-时间曲线，获取待测细胞在时间为区域无穷大时的加载力与压入深度；

s2.基于待测细胞在时间为区域无穷大时的加载力与压入深度，利用赫兹模型计算得到待测细胞的杨氏模量。

本发明基于多孔介质模型获取细胞的杨氏模量，考虑到了利用传统赫兹模型方法测量杨氏模量所未考虑到的细胞内液态相的作用。在传统测量杨氏模量的方法中，仅仅将细胞处理为纯弹性体，用来计算杨氏模量的压入深度与加载力的数据相当于我们用多孔介质模型计算时松弛曲线中t＝0的数据。而如若将细胞进行多孔介质模型的处理，由于液态相的存在，在t＝0时，细胞内的液态相还未重新分布，细胞的整体状态还未完全稳定下来，因此，所测量得到的杨氏模量很容易受到压入深度与加载速率的影响。而如果选取松弛曲线中t＝∞时的值，细胞内的液态相已经完全重新分布，细胞的整体状态已经达到一个完全稳定的状态，此时，就可以排除在不同压入深度与加载速率下液态相的不同行为而造成干扰，因此具有一定的优越性与更高的准确性。

基于在时间为区域无穷大∞下的加载力与压入深度而非传统方法中利用t为0时的加载力与压入深度，利用赫兹模型计算得到的杨氏模量值更加精确，减少了在不同压入深度以及不同加载速率下获取得到的杨氏模量值之间的差异。

其中，压入深度是指探针在待测细胞的表面的压入深度。

赫兹模型为本领域中常用的赫兹模型，通常主要利用原子力显微镜afm探针对细胞进行压痕实验采集细胞的力-位移曲线以及afm探针的形变-时间(也称deflection-t，或deflection-时间)的曲线。

针对不同形状的探针可以利用不同的公式进行拟合，对于锥形探针，利用锥形探针对细胞进行压痕实验，如图1中(a)所示，有：

对于球形探针，利用锥形探针对细胞进行压痕实验，如图1中(b)所示，有：

其中，f是加载力，e是杨氏模量，v是泊松比，是锥形探针的半开角，r是球形探针的半径，δ是压入深度。

在本发明的实施方式中，将得到的加载力以及压入深度代入上述模型中，就可以得到细胞的杨氏模量。

在本发明一个优选实施方式中，所用的是球形探针，直径通常为10μm。本领域技术人员可以根据实际需要以及各探针的已知优缺点来选用不同类型或是不同尺寸的探针。

在本发明一个优选实施例中，为了得到更加准确的加载力以及压入深度，s1具体为：

基于待测细胞表面afm探针的形变-时间曲线，利用粘弹性模型得到待测细胞表面的加载力-时间曲线，获取待测细胞在时间为区域无穷大时的加载力与压入深度。

其中，当探针沿被测物体表面运动时，被测表面的反作用力使探针发生形变。使用afm探针时，可以通过待测细胞表面afm探针的形变-时间曲线去获取待测细胞表面的加载力-时间曲线。

其中，根据afm探针的形变-时间(deflection-t)曲线，在粘弹性模型中，afm探针对细胞所施加的力可以通过：

f＝s×δ×k

来计算得到加载力-时间(f-t)的曲线，其中，s是探针的敏感度，δ是deflection值的变化，k是探针的力常数。

为了使数据更加准确以及得到其它表征值，在本发明一个优选实施例中，在形变deflection-时间t的变化曲线的获取中，如图3所示，数据采集步骤包括：退针段、静置段、近针段和松弛段。

为了减少数据采集对不同压入深度以及不同加载速率下测量得到的杨氏模量的影响，在本发明一个优选实施方式中，优选选用下述方法来采集数据：

s11.根据待测细胞的力曲线，估测得到探针与待测细胞接触点的位置，以所述估测位置为接触点，将探针抬起置于第一高度，记为退针段，采集退针段的时间值和afm探针deflection变化值；

s12.在第一高度将探针静置，记为静置段，采集静置段的时间值和afm探针deflection变化值；

s13.以第一速度令探针下降第一距离，从而在细胞表面获得第一压入深度，记为近针段，采集近针段的时间值和afm探针deflection变化值；

s14.保持探针在第一压入深度不变，记录探针的松弛行为，记为松弛段，采集松弛段的时间值和afm探针deflection变化值。

同时，也可以在退针段、静置段、近针段以及松弛段分别采集z向距离值，可以得到z向距离随时间变化(z向距离-t)曲线以及形变随z向距离变化(deflection-z向距离)曲线，如图3所示，可以将整个实验过程在不同的表象下表现出来。

其中，在s11中，在待测细胞上做一条力曲线来估测接触点的位置。以该估测位置为接触点，将探针抬起置于第一高度d0。

在本发明一个优选实施方式中，为了更准确地得到接触点的位置，可以根据形变随z向距离变化(deflection-z向距离)曲线，曲线的线性段与非线性段的分界点即为预估位置，以该预估位置为接触点，将探针抬起置于第一高度d0。

在s12中，在静置段，在该第一高度将探针静置一段时间，该时间可以根据需要设置。不同细胞对探针的响应有可能相同，也有可能不同，静置片刻是为了使细胞恢复正常状态，这个时间需要根据具体的实验对象及现象来进行调整。一般是几秒钟。

在s13中，在近针段，第一速度可以根据需要设置，本发明中以至少10μm/s的速度为例详述本发明。其中，第二高度为d1，压入深度为δ。

在该速度范围值内，细胞中的液态物质尚未重新分布。

在s14中，在松弛段，由于细胞流体相的重新分布，探针会表现出一个时间依赖性的松弛现象，记录探针的松弛行为。

根据实验需要，可以将第一高度d0和第一距离d1设为同样或不同的值，可以采集到细胞在同一压入深度或不同压入深度下的实验数据。

当第一高度和第一距离值设为相同时，即，将探针抬起第一高度然后再下降与第一高度相同的距离，同时经过静置过程细胞恢复到正常状态，那么下降后的位置与抬起前的位置是同样的位置，即两次实验的压入深度也是一样的，即可采集到细胞在同一压入深度下的实验数据。

为了得到更准确的数据，数据采集步骤还包括：将s11-s14设为一个周期，重复多个周期。

其中，本发明中的“多个”指2个或2个以上。

即上述一个周期的实验完成后，可以紧接着进行下一个周期的实验。

本发明还提供了一种细胞刚度的获取方法，包括：使用上述细胞杨氏模量的测量方法获取细胞杨氏模量，从而得到细胞的刚度。

其中，细胞的刚度与细胞杨氏模量一一对应，从生物学的角度来看，都是用来表示细胞的软硬程度。

由于该杨氏模量是在多孔介质模型的思想上测量的，因此又可以将上述方法测量得到的杨氏模量称之为细胞的介孔弹性。

即，本发明还提供了一种细胞介孔弹性的表征方法，包括：使用上述细胞杨氏模量的获取方法获取待测细胞杨氏模量，以表征细胞的介孔弹性。

本发明还提供了一种细胞物理状态的表征方法，包括：使用杨氏模量、表观粘度和扩散系数综合表征细胞物理状态；其中，杨氏模量为使用上述细胞杨氏模量的测量方法获得。

在本发明的表征方法中，将细胞视为一个多级次多相多孔介质，在传统的模型假设上，赫兹模型将细胞假设为一个均质弹性体，粘弹性模型将细胞看作是完全粘弹性体，多孔介质模型将细胞假设为一个单一的多孔介质体系。而这些假设均不符合细胞本身的状态。基于细胞本身的状态，本发明创新地将细胞视为一个多级次多相多孔介质，使用本发明所测量得到的杨氏模量结合表观粘度和扩散系数来综合表征细胞物理状态，其中，使用本发明的方法得到的杨氏模量更能反映出细胞骨架的状态，表观粘度则与细胞液的状态关系更大，扩散系数综合描述了一个细胞内部的活动状态，弥补了以往各种模型对细胞进行物理状态表征所存在的不足。

为了更准确反映细胞液的状态，表观粘度为根据本发明的细胞杨氏模量的测量方法中松弛段的曲线，利用粘弹性模型进行拟合获得。

为了更准确反映细胞内部的活动状态，扩散系数为根据本发明的细胞杨氏模量的测量方法中松弛段的曲线，利用多孔介质模型进行拟合获得。

上述松驰段的曲线为细胞的形变-时间(deflection-t)曲线中的松驰段曲线，再根据f＝s×δ×k计算获得该松驰段曲线的力-时间(f-t)曲线，分别利用粘弹性模型进行拟合获得细胞表观粘度值以及利用多孔介质模型进行拟合获得细胞的扩散系数。

也可以将细胞的整个形变-时间(deflection-t)曲线根据f＝s×δ×k计算获得相应的力-时间(f-t)曲线，再根据其中松弛段的曲线，分别利用粘弹性模型进行拟合获得细胞表观粘度值以及利用多孔介质模型进行拟合获得细胞的扩散系数。

其中，利用粘弹性模型进行拟合获得细胞表观粘度值为本领域中常见的方法，在本发明一个优选实施方式中，具体为：

通过将松驰段的f-t曲线与如下方程进行拟合：

其中，er是松弛模量，τσ和τs分别是荷载和变形的松弛时间常数，表观粘度可以根据下式进行计算：

μ＝er(τσ-τε)

其中，利用多孔介质模型进行拟合获得细胞的扩散系数为本领域中常见的方法，在本发明一个优选实施方式中，具体为：

通过将松驰段的f-t曲线与如下方程进行拟合：

对于本发明一个优选实施方式中的球形探针，有：

其中，d为扩散系数，α是有效接触面积。

从上式中可以得到扩散系数d值。

在多孔介质中，为了更加全面的反映细胞的物理状态，通常还需要使用综合孔隙度结合杨氏模量、表观粘度和扩散系数一起来表征细胞物理状态。

在本发明中，综合孔隙度可以利用单一孔径多孔介质理论计算获得，即，杨氏模量，表观粘度，扩散系数以及孔径大小有着如下的关系：

其中，ξ是孔径大小，表征综合孔隙度；d是扩散系数；α是有效接触面积；e是杨氏模量。

在一个优选的实施方式中，由于细胞内多孔介质结构的不同最可能体现在其形貌特点上，因此采取两种形貌差异较大的两种细胞3t3细胞和dc细胞作为实验对象。其中，3t3细胞大而薄，dc细胞小而厚。

使用本发明的方法对3t3细胞和dc细胞进行测量，如图4所示，得到了针对3t3细胞在不同压入深度下利用传统方法与本发明的方法得到的杨氏模量值，如图5所示，得到了针对dc细胞在不同加载速率下利用传统方法与本发明的方法得到的杨氏模量值。

从图中可以得出，使用本发明的方法在不同的压入深度下以及不同的加载速度下，细胞杨氏模量的差异很小，不同于使用传统方法所得到的值。

表1中给出了使用本发明的表征方法得到的3t3细胞以及dc细胞的刚度值、表观粘度值、扩散系数以及综合孔隙度。

表1用本发明的表征方法得到的细胞参数值

从表1中可以看出，对于不同细胞，其各种物理特性具有明显的差异，且差异大小不一，因此，单用某一种物理量来表征细胞的状态可能并不充分，需要综合此四种参数来共同进行描述，可以更加全面与准确的描述细胞的物理状态。

本发明基于多级次多相多孔介质理论，考虑到细胞内流体相的存在，提出了利用赫兹模型获取细胞杨氏模量以及刚度的新的采集数据的方法，完美的解决了传统方法中一直存在的细胞刚度容易受压入深度与加载速率的影响这两个问题，也从侧面揭示了传统假设的不足。同时，本发明提出了用扩散系数，杨氏模量，表观粘度以及综合孔隙度来综合描述细胞物理状态的方法，它们可能分别与细胞整体的活跃度，细胞骨架的状态，细胞液状态以及细胞内部结构特点有关。如果将这套体系应用到临床医学中去，可能有助于对多种疾病进行了解，诊断与治疗，也可能为细胞的生理状态提供一个新的衡量标准。

最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。