一种基于新型二维材料黑磷的化学及生物物质探测方法与流程

本发明中涉及到一种利用新型二维材料黑磷来探测化学及生物物质的技术，属于荧光技术与生物光子学技术领域，尤其是对肿瘤细胞的探测。

背景技术：

2009年c.-h.lu等人提出了利用二维材料氧化石墨烯实现对生物分子的探测。在该技术中，用dna单链搭载一种荧光素分子，将这一结合物命名为p1，用特定波长的光激发p1时，将向外辐射荧光。当向p1的溶液中加入氧化石墨烯溶液时，p1与氧化石墨烯结合(p1-go)，此时再用特定波长光激发时，荧光辐射特别微弱，这说明了氧化石墨烯对荧光有淬灭作用。之后，将p1-go结合物加入到特定dna单链(这一dna单链可以与p1中的dna单链匹配形成dna双螺旋结构)溶液中，再用特定波长光激发，又出现了较好的荧光辐射。这一现象说明，dna双螺旋结构的形成同时伴随着荧光素从氧化石墨烯上的逃逸，也说明dan单链之间的结合强度要强于dan与氧化石墨烯之间的结合。同时研究人员还将p1-go加入到其他的dna单链溶液中，发现荧光的恢复效果并不好，这说明这一结合物可以实现对特定dna分子的探测，并且当目标分子与其他分子同时存在时，荧光依然可以恢复，这也说明干扰成分的存在并不影响对目标分子的探测。实验研究也发现，氧化石墨烯的浓度越高对荧光的淬灭效果越好，溶液中目标分子的浓度越高荧光强度的恢复也越好。之后，c.-h.lu等人为了说明这一探测技术的普遍性，又利用这一技术探测蛋白质，合成dna-荧光素的结合物(此处的dna可以有效的识别凝血酶)，然后重复与dna分子识别相同的步骤，最终实现了对特定蛋白质的识别。在探测dna分子的技术中，主要利用了单链dna之间的相互匹配作用；在探测蛋白质分子的技术中，主要是利用了特定dna对特定蛋白质的识别作用；在探测其他分子的时候也利用同样的原理，一种物质对一种物质的特定识别或者结合功能。本技术的核心在于黑磷对荧光的淬灭作用。在此技术的基础上，我们利用新型材料黑磷与石墨烯的相似性，做了利用黑磷探测化学及生物物质的实验。

技术实现要素：

本发明是一种基于新型二维材料黑磷的特定化学及生物物质探测方法，这种探测方法包括以下几点：(1)带有荧光标记的适配体；(2)探测溶剂的选取，可以为pbs，也可以为细胞培养基，或者其他能够使体系的荧光性能保持稳定的缓冲液，列举的细胞实验中用的是磷酸盐缓冲液(pbs)(3)待测化学或生物物质的处理；(4)待测化学或生物物质探测的具体实施方法；(5)此探测方法的探测范围涉及到化学污染物，农药，核酸、蛋白质、细胞、生物分子等众多物质。

具体包括以下步骤：

步骤(1)，组建荧光探针，根据需要配制不同浓度的荧光探针试剂，用荧光分析装置测这些溶液均有荧光信号；再配制黑磷与荧光探针的混合溶液，混合溶液中黑磷的最终浓度以及荧光探针的最终浓度都可以根据具体的实验方案进行具体的调节，此时在荧光分析装置上测荧光时，荧光信号变微弱，说明黑磷对荧光有淬灭作用。

步骤(2)，进行待测化学或生物物质的探测实验，将前面所述的加入黑磷后荧光变弱的溶液与待测的化学或生物物质混合后荧光逐渐恢复，说明了这种方法可以实现化学及生物物质的探测。若荧光逐渐有所恢复则待测溶液中存在与荧光探针试相匹配结合的物质，若荧光不恢复则待测溶液中不存在与荧光探针试相匹配结合的物质，以此可以定量或定性检测化学或生物物质。

进一步优选：所用的荧光探针中包括一种带有荧光标记的适配体，这种适配体是一条单链dna在其末端接上了一个荧光素分子，形成了荧光探针的结合物；使用的单链dna能够识别待测的特定物质，并且单链dna能够与待测的特定物质相匹配结合。

整个细胞探测过程中，所用的溶剂均为磷酸盐缓冲液(pbs)，因为黑磷在磷酸盐缓冲液中容易降解为无毒的磷酸盐和磷酸酯，所以这一技术应用在细胞探测中不会对细胞的生理机能产生影响。在其他探测实验中，探测溶剂的选取遵循使荧光稳定存在，并且不对探测过程中使用的试剂以及实验结果产生影响这一准则。

步骤(2)中将化学或生物物质加入到荧光变弱的溶液之前，对化学或生物物质进行了清洗的处理；清洗所用的试剂不影响化学或生物物质本身的特性，并且残留在溶液中的清洗试剂也不会对荧光探针有影响，更不会影响到最终的实验结果。

步骤(2)进行荧光恢复阶段的实验时，将配制好的溶液加到化学或生物物质中后，为了使溶液中各种成分得到充分反应或结合，在测荧光之前溶液静置一段时间，这段时间用铝箔纸遮盖测试的孔板(96孔板)。因为溶液中有荧光素，所以用铝箔纸起到了遮光作用，可以防止外界的光源对荧光素的荧光产生影响。

本方法的探测范围特别广泛，涉及到化学污染物，农药，核酸、蛋白质、细胞、生物分子等众多物质。

使用黑磷的优越性在于，黑磷的表面积体积比大于石墨烯，于是结合化学或生物物质的能力更强；其次黑磷比石墨烯易降解，黑磷在磷酸盐缓冲液中容易降解为无毒的磷酸盐和磷酸酯，所以这一技术应用在生物体中不会对生物体的生理机能产生影响，不会危害生物体。黑磷超越石墨烯的最大优点就在于拥有能隙，使其更容易进行光探测。

附图说明

图1为不同的黑磷浓度对荧光的淬灭效果图；

图2为不同的细胞数对荧光的恢复效果图。

具体实施方式

本发明的主要内容是利用新型二维材料黑磷实现对生物物质的探测。下面以探测细胞为例，简述一下实验方案。但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

本实验中mcf7-fam的浓度均为其存在于混合溶液中的最终浓度，黑磷(bp)的浓度如10ul/80ul，表示每80ul溶液中含有10ul的黑磷。

首先，将荧光探针(mcf7-fam)溶于磷酸盐缓冲液(pbs)中，mcf7-fam的最终浓度为1um、250nm、50nm、40nm，并测这些不同浓度试剂的荧光，激发波长选择470nm，辐射波长范围为500nm～560nm。可以看到在520nm附近出现辐射谱的峰值。我们选择一种合适的浓度，这种浓度的峰值荧光值在5000左右，这一浓度为50nm。后面的实验均采用mcf7-fam溶液的这一浓度。

其次，检测黑磷对荧光的淬灭作用。

(1)选择黑磷的三个浓度梯度：10ul/80ul、20ul/80ul、40ul/80ul。

(2)按照(1)中的黑磷浓度梯度配制bp-mcf7-fam溶液，溶剂均为pbs，mcf7-fam的最终浓度为50nm。将三种不同黑磷浓度的试剂按照每种三孔，每孔80ul加入到96孔板上测荧光。对照组选用50nm的mcf7-fam溶液，空白对照用pbs溶液。

(3)对荧光曲线分析发现，黑磷对荧光有淬灭效果。淬灭效果随黑磷含量的增加而提升。黑磷为20ul/80ul时的淬灭效果理想。

再次，研究这一bp-mcf7-fam溶夜对细胞有探测作用。培养不同种类的细胞，其中包括mcf7细胞。

(1)取已培养的细胞于96孔板中，每种细胞三个孔，每个孔中有2万个细胞，过夜培养，使细胞贴壁生长。

(2)配制前述浓度bp-mcf7-fam溶液以及mcf7-fam溶液。取出加有细胞的96孔板，吸出细胞培养基，用pbs清洗细胞。将bp-mcf7-fam溶液按每孔80ul加入到含有细胞的孔中。实验组对照组为三个孔分别加入80ul的bp-mcf7-fam溶液，空白对照组为三个孔加入80ul的pbs溶液。

(3)用铝箔纸将96孔板遮盖，放入细胞培养箱中培养2h。

(4)取出96孔板测荧光曲线。发现被黑磷淬灭的荧光在mcf7细胞中得到了恢复，但是在其他细胞中并没有得到恢复。这说明这种特异性的结合物mcf7-fam可以识别mcf7细胞，使被淬灭的荧光素从黑磷上逃逸出来继续发光。

图1为不同的黑磷浓度对荧光的淬灭效果图，不同bp浓度，50nmfam时的实验结果图，可以发现随着黑磷浓度的增大，对荧光的淬灭效果越来越好。

最后，研究了细胞数目对荧光恢复的影响

(1)将已培养的细胞计数，并加入到96孔板。原则为：2万、1万、5千数目的细胞各加入三个孔。培养箱中培养过夜，使细胞贴壁生长。

(2)配制bp-mcf7-fam溶液，bp的含量为20ul/80ul，mcf7-fam的最终浓度为50nm。

(3)取出96孔板，吸取细胞溶液中的培养基，用pbs清洗细胞。

(4)将bp-mcf7-fam溶液按照每孔80ul加入到实验组的细胞中。在空白对照组的孔中加入80ul的pbs溶液。实验对照组为三个空白孔中加入80ulbp-mcf7-fam溶液即可。

(5)用铝箔纸遮盖96孔板，放入培养箱中培养2h。

取出96孔板测荧光，实验发现，随着细胞数目的增加，荧光的恢复效果越好。

图2为不同的细胞数对荧光的恢复效果图，bp：20ul/80ul，fam的最终浓度为40nm，细胞的个数为2万，1万，5千。可以发现，随着细胞数目的增多，荧光恢复的越好。