一种鉴别荆条蜜与糖浆掺假荆条蜜的分析方法与流程

本发明属于食品掺假鉴别技术领域，具体涉及一种应用uhplc-qexactive联用的代谢组学技术鉴别荆条蜜与糖浆掺假荆条蜜的分析方法。

背景技术：

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质，蜂蜜营养价值高，其中，荆条蜜是荆条花蜂蜜的简称，也叫荆花蜜。是四大名蜜之一；也是我国大宗蜜源中每年最稳收的蜜品之一。不仅是理想的滋补营养食品，而且可以止咳润肺、健胃通便、防暑清心，并有补身益气、延年益寿之功效。

但是由于蜂蜜较高的价格和较低的产量，使得蜂蜜成为不法商贩掺假的一个主要对象，为了提高蜂农的生产积极性、保障消费者的利益，为了支持正规蜂蜜生产企业的公平竞争、维护蜂蜜市场的秩序，促进我国蜂蜜产业的健康发展，因此对于找到真正蜂蜜样品的标志性代谢物，从而尝试建立一套灵敏、高效、准确的蜂蜜掺假鉴定方法具有非常重要的意义与价值。

在真蜂蜜中掺入果葡糖浆、淀粉糖浆、大米糖浆等：这是目前最常用的蜂蜜掺假手段，由于这些糖浆的果糖和葡萄糖比例与蜂蜜中的成分非常相似，掺入后各项检测指标完全符合国家标准，给检测造成了很大的困难。目前常用于蜂蜜掺假进行鉴定的方法有稳定碳同位素比值分析法(scira)、薄层色谱法(tic)、脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱法(hpaec-pad)、气相色谱质谱联用技术(gc-ms)、高效液相色谱法(hplc)、高效液相同位素质谱仪联用技术(hplc-irms)、核磁共振技术(nmr)以及近红外光谱(nirs)等。现有的方法对于测定蜂蜜掺假有许多弊端：稳定碳同位素比值分析法(scira)这种方法只对天然蜂蜜中掺入c4植物糖有效，如果蜂蜜中掺入利用水稻、小麦、大豆等c3植物淀粉制备的糖类成分或利用水稻、小麦、大豆等c3植物淀粉制备的糖类物质与其他物质配制的全假蜂蜜，则难以鉴别。kushnir等利用薄层色谱法测定玉米糖浆掺假的蜂蜜确定聚合度为12到19的多聚糖为蜂蜜掺假高果糖玉米糖浆和玉米糖浆的标志物。但是这种方法需要复杂的前处理过程来除去蜂蜜中的葡萄糖、果糖和少量寡糖，导致检测方法操作复杂。脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱法(hpaec-pad)法的局限性更大，在前期对寡糖和多聚糖的水解很可能造成假阳性结果，因为真蜂蜜中也有聚合度3-6的寡糖的存在。脉冲电流检测器的高效阴离子交换色谱法(hpaec-pad)则需要复杂的前处理过程来除去单糖和寡糖，前处理过程复杂。gc-ms法测定蜂蜜掺假也有一定的缺陷，在检测前需要对蜂蜜样本进行衍生化。核磁共振技术(nmr)灵敏度低，对于蜂蜜中我们所关注的代谢物可能会被忽略，并且核磁共振仪器价格昂贵，并不适用于日常监测。近红外光谱(nirs)也有其致命的缺点：1.需要大量有代表性且化学值已知的样品建立模型。这样，对小批量样品的分析用近红外就显得不实际了。2.模型需要不断更新，由于仪器状态改变或标准样品发生变化，模型也要随之变化了。3.模型不通用，每台仪器的模型都不相同，增加使用的局限性。4.建模本钱高，测试用度大。

现有的对蜂蜜品质进行鉴定的方法如gb14963-2011以及sn/t0852-2012：对蜂蜜的感官性状；理化指标如：果糖葡萄糖含量，蔗糖含量等方面进行检测；微生物指标，农残兽残，重金属，添加剂等方面也均进行检测。很多企业标准则对蜂蜜中的麦芽糖、果葡萄糖浆、可可粉，柠檬酸、诱惑红、焦糖色、山梨酸钾、卡拉胶、食用香精等进行测定。目前对蜂蜜掺假的各种糖浆，在理化性质，成分组成和含量以及风味方面与蜂蜜非常相似，因此上述对蜂蜜品质进行测定的方法并不能检测出糖浆掺假的蜂蜜。

综上所述，目前现有技术中缺少一种对荆条蜜掺假进行鉴定的快速有效和直观明显的方法，也没有用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱联合代谢组学法测定荆条蜜标志性代谢物的有关研究。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱技术结合代谢组学方法鉴别荆条蜜与糖浆掺假荆条蜜的分析方法，该分析方法能够有效鉴别真荆条蜜与糖浆掺假荆条蜜。

本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱技术结合代谢组学方法判别荆条蜜与糖浆掺假荆条蜜的分析方法，包括以下步骤：

将真荆条蜜样品和与待检测的糖浆掺假荆条蜜样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到真荆条蜜样品与待测的荆条蜜样品的uhplc-ms原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析(pca)模型区分真荆条蜜与糖浆掺假荆条蜜。

本发明的分析方法对于掺假荆条蜜所用的糖浆并没有特别限定，涵盖目前掺假所用的c3、c4糖浆所有种类，包括：大米糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆、复合果葡糖浆、网购蜂蜜专用糖浆或其它糖浆。

作为一种优选方案，本发明中样品前处理中采用的有机溶剂是含有甲酸的甲醇和水的混合溶剂，其中，优选的，甲酸的体积分数为1％，甲醇和水为等体积混合形成混合溶剂。

作为一种优选方案，本发明中的样品前处理过程包括：将样品与有机溶剂混合至样品完全溶解，超声，离心，过有机滤膜，得到可上机检测的样品。其中，超声时间为10～30min，优选25min；离心条件：800～1200rpm离心4～8min，优选1000rpm离心5min；有机滤膜的孔径为0.20～0.25μm，优选0.22μm；为保证样品中代谢物提取效果较好，样品与有机溶剂的添加比例为1g：(15～25)ml。

在整个前处理过程，为了保证尽可能多的获取蜂蜜样品以及糖浆掺假荆条蜜样品的代谢物信息，提取试剂优先选用的是甲醇和水的混合溶剂(含少量甲酸)对测试样品进行溶解，超声后离心过有机滤膜即可上机检测，前处理步骤简单，易于操作。

色谱的分离和质谱数据的采集是同时进行的，为了使每个化合物都得到分离和鉴定，必须选择合适的色谱和质谱分析条件。

本发明针对荆条蜜样品以及糖浆掺假荆条蜜组分的特点，考察了超高效液相色谱中的流动相、梯度洗脱流程、柱温和进样量等条件对分离效率和分析速度的影响，最终优化筛选得到一组使得分析样品得到最佳分离效果的超高效液相色谱条件。

作为一种优选方案，超高效液相色谱条件为：采用十八烷基键合硅胶柱(c18柱)；流动相：a相：乙腈，b相：醋酸铵水溶液(优选浓度为10mm)，梯度洗脱流程：0-2min1％a,2-3.25min1％-5％a，3.25-4.25min5％a,4.25-7.75min5％-55％a,7.75-9.75min55％-90％a,9.75-11.75min90％a,11.75-12min90％-1％a,12-15min1％a。流速：0.2～0.5ml/min(优选0.3ml/min)，柱温30～37℃(优选35℃)，进样量3微升。

本发明针对荆条蜜样品以及糖浆掺假荆条蜜组分的特点，为改善化合物的雾化和电离状况，提高灵敏度，通过对分辨率、气体流速、喷雾电压等条件进行考察，最终优化筛选得到一组使得检测效果准确的四极杆-轨道阱高分辨质谱条件。

作为一种优选方案，四极杆-轨道阱高分辨质谱选用thermofisherqexactivemassspectrometer，正谱条件为：分辨率，70000；鞘气流速，40个单位；辅助气流速，10个单位；反吹气流速，0个单位；喷雾电压，3.5kv；毛细管温度，320℃；辅助气温度，350℃。扫描范围，m/z：70-1050。扫描模式：fullms(全扫描)。

应用代谢组学技术都可以测定到许多内源性化合物的定性/定量信息。这些信息在输出的谱图上表现为许多信号峰,在色谱质谱图上表现为不同保留时间出现色谱峰。

对得到的荆条蜜样品和待测蜂蜜样品的uhplc-ms原始数据进行预处理，得到各个峰的保留时间、峰高、峰面积和质荷比数据。目前可采用现有技术中的多种软件对于原始数据进行预处理，对于软件的种类并没有特别的限定，这些软件对总离子流图具有数据处理的功能。

从处理效果和方便性来讲，作为一种优选方案，对得到的荆条蜜样品和待测荆条蜜样品的uhplc-ms原始数据采用compoundsdiscoverer软件进行预处理，该预处理是指对总离子流图原始数据中的色谱峰的提取、峰对齐、去噪音未知物的检测等处理，得到各个峰的保留时间、峰高、峰面积和质荷比数据；然后通过多元统计分析方法pca得分图的形式对区分结果进行展示。

其中，compoundsdiscoverer软件是赛默飞世尔科技有限公司研制的一种处理lc-ms原始数据的软件。

为了克服现有技术中无法具体鉴别出荆条蜜掺假的糖浆的类型，本发明的第二个目的是提供一种基于上述分析方法筛选区别于糖浆的真荆条蜜标志性代谢物的方法，该方法能够筛选出真荆条蜜与糖浆的差异代谢物，然后只需对这些差异代谢物进行进一步确认，避免了对所有样品中的代谢物进行统计和分析的麻烦，这样提高了分析准确性和分析效率；对差异性代谢物的研究和分析为深入研究样品的内在差异提供重要信息；进一步的，这还为以后建立鉴别真假荆条蜜的通用模型提供了基础，可用于快速鉴别荆条蜜掺假的样品类型(掺假的是何种糖浆类型以及糖浆掺假的含量)，不仅分析时间短，还提高了鉴别结果的准确性和可靠性。

对荆条蜜样品与糖浆分别采用有机溶剂进行前处理后，应用所述的超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱方法实现对前处理后的样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到荆条蜜样品与糖浆的uhplc-ms原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法主成分分析进行差异化合物筛选，确定和鉴定标志性代谢物。

对得到的荆条蜜样品与糖浆的uhplc-ms原始数据采用compoundsdiscoverer软件进行预处理，该预处理是指对总离子流图原始数据中的色谱峰的提取、峰对齐、去噪音、未知物的检测等处理，得到各个峰的保留时间、峰高、峰面积和质荷比数据，并通过多元统计分析方法主成分分析模型得到pca得分图和载荷图，筛选出标志性代谢物，进而鉴定标志性代谢物。

pca得分图和载荷图可在compoundsdiscoverer软件中进行pca分析得到，此为本领域技术人员公知的技术手段，再此不再赘述。

针对荆条蜜组分的特点，本发明采用载荷图筛选差异性代谢物是一种简单的方法，在获得载荷图时，本发明通过设定ratio＞20或＜0.5，p值＜0.01，来筛选潜在的标志性代谢物。其中，所述ratio为该代谢物在两组中的峰面积的比值。

经过超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱方法的检测，发现荆条蜜中的代谢物非常多，为了便于寻找两者差异最大的代谢物，本发明将pca模型中的ratio设定为大于20，本发明中的ratio是指荆条蜜中的某种代谢物的峰面积与糖浆中的该种代谢物的峰面积的比值，经过这样的设定，能够快速筛选两者的差异性较大的代谢物。

对筛选出来的潜在的标志性代谢物首先进行假阳性离子的排除，所述假阳性离子为返回总离子流图中提取不到色谱峰的物质；获得阳离子模式下的标志性代谢物信息，包括分子式，分子离子准确质量数以及保留时间等，准确质量数的最大偏差在5ppm以内，保留时间偏差在0.2分钟内；同样的，根据获得的分子式，在阴离子模式下对潜在的标志性代谢物的分子离子进行提取，并根据阴阳离子模式下分子离子峰单位准确质量数对潜在的标志性代谢物进行推测，最终获得区别于糖浆的荆条蜜标志性代谢物。

在鉴定标志性代谢物时，通过四极杆-轨道阱高分辨质谱的二级质谱设定高能碰撞诱导裂解技术(hcd)的高能碰撞池三个能量级来寻找标志性代谢物的碎片离子，从而实现对荆条蜜样本标志性代谢物的鉴定分析。

为了克服现有技术中无法具体鉴别出荆条蜜掺假的糖浆的类型，本发明的第三个目的是基于以上筛选方法得到的区别于大米糖浆的荆条蜜标志性代谢物，所述标志性代谢物有以下化合物组成：苯丙氨酸、亮氨酸、泛酸、对香豆酸、肉桂酸、白杨素、酪氨酸。该标志性代谢物可用来鉴别大米糖浆掺假荆条蜜。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)用代谢组学方法结合超高效液相色谱串联质谱技术可以实现对荆条蜜和糖浆中的几乎全部的代谢物信息进行获取。

本发明的分析方法不同于之前的对荆条蜜掺假进行测定的方法，只针对某一种或者某几种常规化合物进行定性定量检测来判断掺假，这就会导致不法分子会根据最新出台的蜂蜜掺假方法来对掺假技术进行调整。而本发明的方法是在对荆条蜜与糖浆掺假荆条蜜的代谢物信息进行一个全面的获取后，结合多元统计分析，对荆条蜜与糖浆掺假荆条蜜进行全面分析，建立模型，完成对糖浆掺假荆条蜜的检测。

采用本发明的分析方法能够有效区分荆条蜜和糖浆掺假荆条蜜，结果以pca得分图的形式展示，本领域技术人员能够直观的判别其真假情况，无需再进行相关验证和分析，可以得到真假结论，检测结果准确可靠。

(2)荆条蜜样品前处理方法简单快捷，方法建立后对检测人员操作技术要求较低。

在整个前处理过程，为了保证尽可能多的获取荆条蜜样品以及糖浆掺假荆条蜜样品的代谢物信息，提取试剂用的是甲醇和水的混合溶剂(含甲酸)对测试样品进行溶解，超声后离心过有机滤膜即可上机检测，前处理步骤简单，易于操作。

(3)检测模型建立后，可用于对糖浆掺假荆条蜜样品进行批量检测。

上机检测后的原始数据经过compoundsdiscoverer软件对荆条蜜样品与糖浆掺假荆条蜜样品进行总离子流图色谱峰的提取，峰对齐，未知物的检测等差异性分析，最后通过多元统计分析pca图的形式对区分结果进行展示。此检测方法建立后，对于未知的糖浆掺假荆条蜜样品与荆条蜜的区分可按相同流程进行操作。经过实验验证，不合适的前处理方法不能最大限度地提取真蜂蜜的内源性代谢产物，将会造成不容易区分的检测结果，使得检测结果不准确。

(4)优于其他检测方法，不需要对某一或某些靶向物质进行定性定量测定，是一种宏观非靶向的种类区分的方法。

(5)通过本发明的筛选方法能够得到的区别于大米糖浆的荆条蜜标志性代谢物，该标志性代谢物有以下化合物组成：苯丙氨酸、亮氨酸、泛酸、对香豆酸、肉桂酸、白杨素、酪氨酸。区别于其他糖浆的荆条蜜的标志性代谢物可采用与本发明相同的筛选方法进行研究得到。根据得到的这些区别于不同糖浆的荆条蜜标志性代谢物，能够建立一套鉴别不同种类以及不同掺假含量的糖浆掺假荆条蜜的通用模型，通过该通用模型，能够快速知晓掺假的糖浆种类以及掺假的含量；而且通模型的建立为以后快速、高效、灵敏、准确地进行鉴别掺假荆条蜜具有非常重要的意义与价值。

附图说明

图1是荆条蜜与掺假1％、5％、10％大米糖浆，1％玉米糖浆，1％甜菜糖浆，1％蜂蜜专用糖浆掺假荆条蜜的pca得分图。

图2是阳离子模式下荆条蜜样本与f55大米糖浆样本总离子流图。

图3是荆条蜜样本组与糖浆样本组pca得分图。

图4是荆条蜜样本组与糖浆样本组载荷图。

图5是筛选后荆条蜜样本组与糖浆样本组载荷图。

图6a、图6b和图6c是苯丙氨酸碎片离子质谱图。

图7a和图7b是亮氨酸碎片离子质谱图。

图8a和图8b是泛酸碎片离子质谱图。

图9a、图9b、图9c和图9d是对香豆酸碎片离子质谱图。

图10a、图10b和图10c是肉桂酸碎片离子质谱图。

图11是白杨素碎片离子质谱图。

图12a和图12b是酪氨酸碎片离子质谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

术语解释：

多元统计分析方法是建立在多元统计分布基础上的一类处理多元统计数据方法的总称，是统计学中的具有丰富理论成果和众多应用方法的重要分支。常用的多元统计分析方法主要包括：多元回归分析、聚类分析、判别分析、主成分分析、因子分析、对应分析、典型相关分析等。本发明主要采用主成分分析法。

仪器与设备：

acquityuplcbehc18分析柱美国waters公司(2.1×75mm,1.7μm)；

thermoscientificqexactivethermoscientifictmultimate3000美国thermofisher公司；

sigma3-18k高速冷冻离心机德国sigma公司；

milli-q-a-11超纯水机密理博公司；

超声波清洗机宁波新芝生物科技有限公司；

ikams3basic涡旋混合器ika公司；

材料与试剂：

荆条蜜不同蜂农处收集；

糖浆山东省食品药品检验院；

超纯水milli-q-a-11；

乙腈赛默飞世尔科技有限公司；

甲醇赛默飞世尔科技有限公司；

无水甲酸天津市科密欧化学试剂有限公司。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

(1)本发明的方法原理：

对真荆条蜜样品与糖浆掺假荆条蜜样品用相同的前处理方法处理后，应用uhplc串联thermofisherqexactivemassspectrometer仪器实现对样品中化学成分的分离与测定，应用compoundsdiscoverer软件对仪器获得原始数据进行色谱峰的提取，峰对齐以及未知化合物的搜库分析。应用多元统计分析pca分析区分真荆条蜜与糖浆掺假荆条蜜。

(2)样品前处理

称取1g荆条蜜样品(一个样品的重复次数为6次)于50ml离心管中，加入20ml提取剂(提取剂为含1％甲酸的甲醇与超纯水等体积混合)，涡旋混合至荆条蜜样品完全溶解，将离心管置于超声清洗机中超声25分钟，1000rpm离心5分钟，将上清液用0.22μm有机滤膜过滤以备上样。

分别称取0.99g，0.95g，0.90g荆条蜜样品(一个样品的重复次数为6次)于50ml离心管中，分别称取0.1g，0.5g，1g糖浆样品于100ml锥形瓶中，荆条蜜样品中加入19ml提取剂(提取剂为含1％甲酸的甲醇与超纯水等体积混合)，糖浆样品中加入10ml提取剂，混匀溶解后，再分别取1ml加入到荆条蜜样品中做人为掺假荆条蜜，涡旋混合至蜂蜜样品完全溶解，将离心管置于超声清洗机中超声25分钟，1000rpm离心5分钟，将上清液用0.22μm有机滤膜过滤以备上样。

(3)应用uhplc串联thermofisherqexactivemassspectrometer仪器实现对样品中化学成分的分离与测定。

色谱条件：

a相：乙腈，b相：10mm醋酸铵水溶液，梯度洗脱流程：0-2min1％a,2-3.25min1％-5％a，3.25-4.25min5％a,4.25-7.75min5％-55％a,7.75-9.75min55％-90％a,9.75-11.75min90％a,11.75-12min90％-1％a,12-15min1％a。流速：0.3ml/min，柱温35摄氏度，进样量3微升。

质谱条件：

正谱条件：分辨率，70000；鞘气流速，40个单位；辅助气流速，10个单位；反吹气流速，0个单位；喷雾电压，3.5kv；毛细管温度，320℃；辅助气温度，350℃。扫描范围，m/z：70-1050。扫描模式：fullms。

(4)数据处理与多元统计分析：

对得到的荆条蜜样品和糖浆掺假荆条蜜样品的uhplc-ms原始数据采用compoundsdiscoverer软件进行预处理，该预处理是指对总离子流图原始数据中的色谱峰的提取，峰对齐，去噪音，未知物的检测等处理，然后通过多元统计分析方法pca得分图的形式对区分结果进行展示。

pca得分图是pca模型的一种分布图，由于pca分析是建立在同一个数据集x基础上，经过投影方法计算pca第一主成分后，可以得到各个样品点在第一个主成分的得分t1，再得到各个样品点的第二个主成分上的得分t2，比如图1～图3。各个样品在各个主成分的得分就是其在计算的数学模型中的空间坐标，自然也就决定了其在模型中的具体位置，并直接反映各个样品在数学模型空间中的分布情况。

(5)成果展示：

样品为荆条蜜(采用的样品个数是12个，从不同蜂农处收集，每个样品重复6次试验)，糖浆为大米糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆、网购蜂蜜专用糖浆，按照(1)～(4)的流程进行操作，得到荆条蜜与掺假1％、5％、10％大米糖浆，1％玉米糖浆，1％甜菜糖浆，1％网购蜂蜜专用糖浆掺假荆条蜜的区分。

结果如图1所示，pca得分图中，1r、5r、10r、1c、1b、1h分别表示的是掺假1％、5％、10％大米糖浆的掺假荆条蜜，掺假1％玉米糖浆的掺假荆条蜜，掺假1％甜菜糖浆的掺假荆条蜂蜜，掺假1％蜂蜜专用糖浆的掺假荆条蜂蜜。从pca得分图可以看出各个样品的聚集、离散程度，每一个点代表一个样品，其中，荆条蜜包括12个样品(每个样品六次重复，只选取了该样品的其中一次在图1中进行说明)，该12个样品点全部相对集中在图1中的坐标轴的右上部分，这说明这12个真荆条蜜样品含有的代谢物的组成和浓度很接近，组内差异较小，而与其他糖浆掺假的荆条蜜的样品点距离很大，这说明真荆条蜜样品含有的代谢物的组成和浓度与糖浆掺假蜂蜜区别较大，采用该方法可以有效区分真荆条蜜与糖浆掺假蜂蜜，这个结果非常显而易见；1r、5r、10r、1c、1b、1h均包括3个样品(每个样品六次重复，只选取了该样品的其中一次在图1中进行说明)，在图1中显示的是三个点，从图中可以看出，有些糖浆掺假的荆条蜜可以很明显的区分开，比如1r、5r、1c和10r、1h、1b两组的样品点远离程度大，能够有效区分。而有些糖浆掺假的荆条蜜并不能有效区分，如图1所示，1r、5r、1c样品点大致集中在左上部分；10r、1h、1b样品点全部集中在右下部分，并且样品点距离很近，无法有效区别，而10r和1h、1b的差异较大，至少从掺假含量来看，差异还是比较大的，但是10r和1h、1b却无法有效区分，从这点可以看出，即使两种不同的样品采用该代谢组学方法也不一定能够有效区分，这也就是说，针对两种样品，本领域技术人员也并不能有效预期采用代谢组学的方法能否有效区分。

综上，经过图1可得，本方法能将真荆条蜜与掺假1％、5％、10％大米糖浆的掺假荆条蜜，掺假1％玉米糖浆的掺假荆条蜜，掺假1％甜菜糖浆的掺假荆条蜜，掺假1％蜂蜜专用糖浆的掺假荆条蜜进行很好的区分。

实施例2

基于uhplc串联thermofisherqexactivemassspectrometer结合代谢组学方法筛选荆条蜜标志性代谢物的方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理

将1g荆条蜜样品于50ml离心管中，加入20ml提取剂(提取剂为含1％甲酸的甲醇与超纯水等体积混合)，涡旋混合至荆条蜜样品完全溶解，将离心管置于超声清洗机中超声25分钟，1000rpm离心5分钟，将上清液用0.22μm有机滤膜过滤以备上样。

将1g糖浆样品于50ml离心管中，加入20ml提取剂(提取剂为含1％甲酸的甲醇与超纯水等体积混合)，涡旋混合至糖浆样品完全溶解，将离心管置于超声清洗机中超声25分钟，1000rpm离心5分钟，将上清液用0.22μm有机滤膜过滤以备上样。

其中，所述糖浆并没有特别限定，涵盖目前掺假所用的c3、c4糖浆所有种类，包括：大米糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆、复合果葡糖浆、网购蜂蜜专用糖浆或其它糖浆。

(2)应用uhplc串联thermofisherqexactivemassspectrometer仪器实现对样品中化学成分的分离与测定。其中，色谱条件与实施例1中的相同，质谱条件如下所述：

一级质谱条件：

负谱条件：分辨率，70000(fwhm)；鞘气，40个单位；辅助气，10个单位；反吹气，0个单位；喷雾电压，2.8kv；毛细管温度，320℃；辅助气温度，350℃。扫描范围，m/z：70-1050。扫描模式：fullms。

正谱条件：分辨率，70000(fwhm)；鞘气，40个单位；辅助气，10个单位；反吹气，0个单位；喷雾电压，3.5kv；毛细管温度，320℃；辅助气温度，350℃。扫描范围，m/z：70-1050。扫描模式：fullms。

二级质谱条件：

正谱条件：分辨率，175000(fwhm)；鞘气，40个单位；辅助气，10个单位；反吹气，0个单位；喷雾电压，3.5kv；毛细管温度，320℃；辅助气温度，350℃。扫描范围，m/z：70-1050。hcd高能碰撞池能量,50、100、150。扫描模式：fullms。

(3)数据处理与多元统计分析

对得到的荆条蜜样品与糖浆的uhplc-ms原始数据采用compoundsdiscoverer软件进行预处理，该预处理是指进行总离子流图色谱峰的提取，峰对齐，去噪音，未知物的检测等处理，并通过多元统计分析方法得到pca得分图和载荷图，进而筛选出标志性代谢物。

pca得分图和载荷图是pca模型分析得到的两种分布图。载荷图表示了所检测的变量(如质荷比)的分布情况，载荷图中的变量分布与得分图中样品的分布和位置相对应。

具体应用和操作如下：

样品为荆条蜜(采用的样品个数是12个，从不同蜂农处收集，每个样品重复6次试验)和f55大米糖浆(采用的样品个数是12个，每个样品重复6次试验)：

经过质谱检测后，获得荆条蜜样本和f55大米糖浆样本的总离子流图，如图2所示，在阳离子模式下在保留时间2-7分钟以及9-13分钟荆条蜜样本与f55大米糖浆也有显著的不同，荆条蜜总离子流图出峰总数大于f55大米糖浆总离子流图出峰总数，说明荆条蜜与糖浆相比可能含有更多的代谢物。具体差异物质的寻找还需要进行进一步分析。在compoundsdiscoverer软件中进行pca分析，图3为荆条蜜样本组和糖浆样本组的pca得分图，在得分图中，荆条蜜样本组(右半部分的点)与糖浆样本组(左半部分的点)在第一主成分上就可以实现很好地分离，说明荆条蜜样本与糖浆样本代谢物存在很大的差异，这也为我们实验下一步寻找荆条蜜样本的标志性代谢物工作提供了实验数据依据，也证明了本发明的试验方法用于鉴别真假荆条蜜的可行性，因为目前蜂蜜掺假常用的方法是通过掺入糖浆来造假，本研究所用的糖浆样本组包括大米糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆、复合果葡糖浆、网购蜂蜜专用糖浆，涵盖目前掺假所用的c3、c4糖浆所有种类。本研究方法数据分析获得的pca得分图可以将荆条蜜样本组和糖浆样本组进行完全分离，也说明了试验方法能够将荆条蜜与假荆条蜜进行区分的可行性，荆条蜜样本组与糖浆样本组代谢物存在很大差异，图4为荆条蜜样本组与糖浆样本组的载荷图，图中的每个点代表通过compoundsdiscoverer软件分析从荆条蜜与糖浆样本组中提取出的一种代谢物(所有样品的代谢物)，从26可以看出荆条蜜样本组提取的代谢物要多于糖浆样本组，通过对图4的载荷图上的代谢物进行筛选，来寻找荆条蜜样本组的标志性代谢物。通常来说设置ratio值＞2或者＜0.5，p值＜0.01筛选到的物质就可以作为差异代谢物，其中每一种代谢物的ratio值为该代谢物在两组中的平均峰面积的比值，但考虑到提取到的代谢物个数庞大，且研究的目的是寻找差异最大的物质，在差异代谢物的寻找步骤中，将ratio值设为＞20或者＜0.5，p值＜0.01来寻找荆条蜜样本组标志性代谢物。如图5为经过筛选后的载荷图，载荷图需要结合pca得分图来进行分析，pca得分图上各组对应的位置，相应的就是载荷图上个点的组别归属，在图3的pca得分图中荆条蜜样本组位于第一主成分的右半部分，那么对应图5筛选后的载荷图中，就可以从筛选出的右半部分的点中来寻找荆条蜜样本组的差异性代谢物。对筛选出的物质首先进行假阳性离子的排除，假阳性离子为返回总离子流图中提取不到色谱峰的物质，获得阳离子模式下的标志性代谢物信息，包括分子式，分子离子准确质量数以及保留时间等，准确质量数的最大偏差在5ppm以内，保留时间偏差在0.2分钟内，同样的根据获得的分子式，在阴离子模式下对标志物的分子离子进行提取，并根据阴阳离子模式下分子离子峰单位准确质量数对标志物进行推测，最终获得的可能的荆条蜜样本标志性代谢物有苯丙氨酸、亮氨酸、泛酸、对香豆酸、肉桂酸、白杨素、酪氨酸。如表1为荆条蜜样本标志性代谢物完整信息。

其中，本发明中的阴、阳离子模式条件：色谱条件相同，质谱条件包括正谱条件和负谱条件。

表1荆条蜜样本标志性代谢物分子离子信息表

表中上标1为[m+nh4]+，上标2为[m+h-h2o]+

荆条蜜标志性代谢物的鉴定

根据一级质谱全扫模式给出的信息，找出荆条蜜样本可能的标志性代谢物，为了对这七种物质进行进一步确定，通过二级质谱设定hcd高能碰撞池三个能量级来寻找标志性代谢物的碎片离子，从而实现对找到的荆条蜜样本标志性代谢物的定性分析。如表1为荆条蜜样本标志性代谢物的碎片离子信息表，在设定的hcd高能碰撞池三个能量下，每种标志性代谢物都找到了至少一个碎片离子，那么每种荆条蜜标志性代谢物正负离子模式下的两个分子离子和一个碎片离子得分为5分，已经满足欧盟的一个分析物定性至少要达到4分以上的要求，一个分子离子得1分，高分辨质谱一个碎片离子得3分。可以对找到的标志物进行定性，最终确定荆条蜜样本的标志性代谢物为苯丙氨酸、亮氨酸、泛酸、对香豆酸、肉桂酸、白杨素、酪氨酸。图6a～图12b为荆条蜜标志性代谢物hcd高能碰撞池在设定的三个不同能量下获得的碎片离子质谱图，其中苯丙氨酸一共获得三个碎片离子见图6a、图6b和图6c，在hcd能量设定为50时获得质核比为120.08075的碎片离子，是苯丙氨酸分子离子失去一个羧基获得的碎片离子；在hcd能量设定为100时获得质核比为103.05440的碎片离子，是苯丙氨酸分子离子失去一个羧基和氨基后得到的碎片离子；在hcd能量设定为150时获得质核比为79.05478的碎片离子，苯丙氨酸中的苯环基团的碎片离子。亮氨酸获得两个碎片离子如图7a和图7b，在hcd能量设定为50时获得质核比为86.09689的碎片离子，是亮氨酸分子离子失去一个羧基后得到的碎片离子；hcd能量设定100获得质核比为69.07057的碎片离子，为亮氨酸失去一个羧基和氨基后得到的碎片离子。泛酸在hcd能量设定为50时获得一个失去一个羟基和氨基丙酸基团后的碎片离子，质核比为116.03441，图8a和图8b。对香豆酸仅在hcd能量设定为50时就获得4个碎片离子如图9a、图9b、图9c和图9d，质核比分别为120.05233、109.06503、95.04947、73.02895，分别是失去一个羧基后的碎片离子、分子离子从双键处断裂后的碎片离子、苯酚基团碎片离子、丙烯酸基团碎片离子。图10a、图10b肉桂酸在hcd设定50时获得两个碎片离子，分别是丙烯酸支链双键处断裂后碎片离子质核比为91.05464，质核比104.05780的碎片离子为掉一个羧基后的碎片离子；图10c为肉桂酸在hcd设定为150时获得的碎片离子，准确质量数为79.05458，是苯环基团的碎片离子。见图11白杨素在hcd能量设定为50时获得质核比为147.04364的碎片离子，是白杨素分子离子失去一个苯环和两个羟基后的碎片离子。酪氨酸在hcd能量设定为50和150时分别获得两个和一个碎片离子如图12a和图12b，质核比为136.07545的碎片离子为掉一个羧基后的碎片离子，119.04916为掉一个羧基和氨基后的碎片离子，95.04958为苯酚集团碎片离子。

表2荆条蜜标志性代谢物碎片离子信息表

本实施例主要是对荆条蜜和大米糖浆的代谢物差异进行分析，区别于其他糖浆的标志性代谢物可采用与本实施例相同的方法进行研究。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。