本发明涉及文物检测领域，尤其涉及一种定量检测古代羊毛的方法。
背景技术：
羊毛，人类纺织史上最早利用的一种天然纤维。具有良好的弹性和纤维柔软性，保暖性能好，穿着舒适度强，手感柔和，在生活和工业领域都得到了广泛的应用。
羊毛优异的性能使得其在数年前就得到了广大人民的喜爱和使用，但由于羊毛的主要成分是角蛋白，一种极易受到环境影响的蛋白质。随着时间的延长，羊毛制品便不断遭到外界的腐蚀而变得糟朽不堪。在漫漫历史车轮中，一些随逝者埋入墓葬的羊毛制品早已失去了最初的形貌，使得人类用肉眼难以辨别，这给羊毛类文物的鉴定和研究带来了极大的困难。
目前，普通的分析测试方法，如x-射线衍射分析，傅里叶红外光谱，扫描电子显微镜，对腐烂的古代羊毛均很难做出分析。国内外仅仅对羊毛形貌上的分析更是无法获得确凿的证据来鉴定文物。因此，亟需开发处一种更为准确，科学的方法来鉴定古代羊毛。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种定量检测古代羊毛的方法。本发明方法能够准确判断出待检文物样品是否为古代样品，并且能够定量分析其受损程度。上述方法准确度高，灵敏度强，检测方法简便、合理。
本发明的具体技术方案为：一种定量检测古代羊毛的方法，采用如下步骤：
（a）称取标准羊毛样品、待检文物样品各一份，分别标记为样品a和样品b。
（b）将样品b在70-80wt%的乙醇水溶液中常温浸泡25-35min，然后以1800-2200r/min的速度离心处理4-6min，取下层物质，用蒸馏水冲洗后常温干燥，备用。
由于待检文物样品中含有大量的有机杂质，会影响检测而得精准性和灵敏性。因此事先将其在特定浓度的乙醇溶液中浸泡，一方面能够溶解去除部分有机杂质，另一方面待检文物样品浸泡后其纤维会发生一定程度的溶胀，便于后续的提取。
（c）将样品a和样品b按1:35-45的浴比添加至处理液中，在200-300r/min搅拌速率、55-65℃水浴、惰性气体保护条件下加热搅拌2-3h，得到提取液；所述处理液由亚硫酸氢钠1.5-2.5wt%、双氧水0.2-0.4wt%和余量的水配制而成。
经过上述方法提取后，可以提取到羊毛中的角蛋白。
（d）将提取液冷却至室温，装入截留分子量为3500-4000的透析袋中，然后完全浸入去离子水中透析2-3天，透析前12h每2h换一次水，透析12h后每4h换一次水，透析24h后每8h换一次水，透析后经过冷冻干燥，分别得到从样品a、样品b中提取的提取物a和提取物b。
进行上述特定方法透析后，能够得到特定分子量的角蛋白。
（e）将提取物a、提取物b分别溶解到含有脱氧胆酸钠的tris-hcl溶液中，再添加二硫苏糖醇溶液中使其浓度达到0.01mol/l，在35-45℃下反应25-35min，待冷却至室温后加入碘乙酰胺，在避光条件下反应25-35min，然后将溶液转移至超滤管中以14000-16000r/min的速率离心处理8-12min，加入胰蛋白酶进行酶解，取酶解产物，用c18脱盐柱进行除盐处理，冷冻干燥，分别得到检测样a、检测样b，将检测样a、检测样b分别溶解于0.08-0.12wt%的甲酸溶液中进行质谱检测。
（f）采用hplc-ms/ms对检测样a、检测样b进行分析，对分析结果进行对比；对由检测样a、检测样b得到的质谱检测结果进行对比分析，检测样a的检测结果可获得羊毛的一系列肽段，若检测样b的检测结果也获得了同样或者同源的肽段，则判定样品b为古代羊毛；若检测样b的检测结果中没有得到同样或者同源的肽段且与羊毛氨基酸序列库没有相符序列，则判定样品b不是羊毛。
上述检测方法可采用现有技术中常规的检测方法。
（g）若上述检测结果显示样品b为古代羊毛，则采用label-free技术对样品a、样品b中的蛋白质进行定量分析，根据样品a、样品b的蛋白质含量的差异，判断古代样品的受损程度。
上述定量分析可采用现有技术中的常规方法进行分析。
作为优选，步骤（b）中，所述乙醇水溶液浓度为75wt%，浸泡时间为30min，离心速率为2000r/min。
作为优选，步骤（c）中，所述浴比为1:40，搅拌速率为250r/min，水浴温度为60℃，加热搅拌时间为2.5h。
作为优选，步骤（c）中，所述处理液由亚硫酸氢钠2wt%、双氧水0.3wt%和余量的水配制而成。
作为优选，步骤（e）中，所述tris-hcl溶液的浓度为0.05mol/l，所述脱氧胆酸钠在tris-hcl溶液中的浓度为5wt%，碘乙酰胺添加后的终浓度为0.04wt%，避光反应时间为30min。
作为优选，步骤（e）中，胰蛋白酶的添加量为1微克每50微升的tris-hcl溶液，酶解时间为20-28h，酶解温度为35-59℃。
作为优选，步骤（e）中，所述甲酸浓度为0.1wt%。
作为优选，所述hplc-ms/ms的检测条件为：液相采用100分钟梯度，流速为200nl/min；质谱数据采集选择信号排名前30的多肽进行碎裂，蛋白数据库检索采用proteomediscoverersoftware。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
本发明以羊毛中的角蛋白为对象，对待检文物样品进行分析，将通过液相色谱-质谱联用技术得到的待检文物样品的序列和标准羊毛的氨基酸序列进行对比分析，可以判定该待检文物样品的质地是否为羊毛，对古代羊毛。
进一步地，在确认该文物样品为羊毛后，通过对样品中的蛋白质进行定量分析，有助于分析文物样的受损程度，为考古学研究提供参考价值。
本发明方法能够有效鉴别古代羊毛，摆脱了普通检测分析方法的局限性，能够对样品进行一级结构的准确鉴定；使用溶液内酶切的方法使得实验操作简单，实验灵敏度高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种定量检测古代羊毛的方法，采用如下步骤：
（a）称取标准羊毛样品、待检文物样品各一份，分别标记为样品a和样品b。
（b）将样品b在75wt%的乙醇水溶液中常温浸泡30min，然后以2000r/min的速度离心处理5min，取下层物质，用蒸馏水冲洗后常温干燥，备用。
（c）将样品a和样品b按1:40的浴比添加至处理液中，在200-300r/min搅拌速率、60℃水浴、惰性气体保护条件下加热搅拌2.5h，得到提取液；所述处理液由亚硫酸氢钠2wt%、双氧水0.3wt%和余量的水配制而成。
（d）将提取液冷却至室温，装入截留分子量为3500的透析袋中，然后完全浸入去离子水中透析2.5天，透析前12h每2h换一次水，透析12h后每4h换一次水，透析24h后每8h换一次水，透析后经过冷冻干燥，分别得到从样品a、样品b中提取的提取物a和提取物b。
（e）将提取物a、提取物b分别溶解到含有5wt%的脱氧胆酸钠的0.05mol/l的tris-hcl溶液中，再添加二硫苏糖醇溶液中使其浓度达到0.01mol/l，在40℃下反应30min，待冷却至室温后加入碘乙酰胺使其终浓度为0.04wt%，在避光条件下反应30min，然后将溶液转移至超滤管中以15000r/min的速率离心处理10min，加入胰蛋白酶（1微克每50微升的tris-hcl溶液）进行酶解，酶解温度为37℃，时间为24h，取酶解产物，用c18脱盐柱进行除盐处理，冷冻干燥，分别得到检测样a、检测样b，将检测样a、检测样b分别溶解于0.1wt%的甲酸溶液中进行质谱检测。
（f）采用hplc-ms/ms对检测样a、检测样b进行分析，对分析结果进行对比。
检测结果显示：检测样a的检测结果获得了羊毛的一系列肽段，同时检测样b的检测结果也获得了同源的肽段，因此判定样品b为古代羊毛。
其中，所述hplc-ms/ms的检测条件为：液相采用100分钟梯度，流速为200nl/min；质谱数据采集选择信号排名前30的多肽进行碎裂，蛋白数据库检索采用proteomediscoverersoftware。
（g）采用label-free技术对样品a、样品b中的蛋白质进行定量分析，根据样品a、样品b的蛋白质含量的差异，判断古代样品的受损程度。
实施例2
一种定量检测古代羊毛的方法，采用如下步骤：
（a）称取标准羊毛样品、待检文物样品各一份，分别标记为样品a和样品b。
（b）将样品b在70wt%的乙醇水溶液中常温浸泡35min，然后以1800r/min的速度离心处理6min，取下层物质，用蒸馏水冲洗后常温干燥，备用。
（c）将样品a和样品b按1:35的浴比添加至处理液中，在300r/min搅拌速率、55℃水浴、惰性气体保护条件下加热搅拌3h，得到提取液；所述处理液由亚硫酸氢钠1.5wt%、双氧水0.2wt%和余量的水配制而成。
（d）将提取液冷却至室温，装入截留分子量为4000的透析袋中，然后完全浸入去离子水中透析3天，透析前12h每2h换一次水，透析12h后每4h换一次水，透析24h后每8h换一次水，透析后经过冷冻干燥，分别得到从样品a、样品b中提取的提取物a和提取物b。
（e）将提取物a、提取物b分别溶解到含有5wt%的脱氧胆酸钠的0.05mol/l的tris-hcl溶液中，再添加二硫苏糖醇溶液中使其浓度达到0.01mol/l，在35℃下反应35min，待冷却至室温后加入碘乙酰胺使其终浓度为0.04wt%，在避光条件下反应25min，然后将溶液转移至超滤管中以14000r/min的速率离心处理12min，加入胰蛋白酶（1微克每50微升的tris-hcl溶液）进行酶解，酶解温度为35℃，时间为28h，取酶解产物，用c18脱盐柱进行除盐处理，冷冻干燥，分别得到检测样a、检测样b，将检测样a、检测样b分别溶解于0.08wt%的甲酸溶液中进行质谱检测。
（f）采用hplc-ms/ms对检测样a、检测样b进行分析，对分析结果进行对比。检测结果显示，检测样a的检测结果获得了羊毛的一系列肽段，检测样b的检测结果中没有得到同样或者同源的肽段且与羊毛氨基酸序列库没有相符序列，因此判定样品b不是羊毛。
其中，所述hplc-ms/ms的检测条件为：液相采用100分钟梯度，流速为200nl/min；质谱数据采集选择信号排名前30的多肽进行碎裂，蛋白数据库检索采用proteomediscoverersoftware。
实施例3
一种定量检测古代羊毛的方法，采用如下步骤：
（a）称取标准羊毛样品、待检文物样品各一份，分别标记为样品a和样品b。
（b）将样品b在80wt%的乙醇水溶液中常温浸泡25min，然后以2200r/min的速度离心处理4min，取下层物质，用蒸馏水冲洗后常温干燥，备用。
（c）将样品a和样品b按1:45的浴比添加至处理液中，在200r/min搅拌速率、65℃水浴、惰性气体保护条件下加热搅拌2h，得到提取液；所述处理液由亚硫酸氢钠2.5wt%、双氧水0.4wt%和余量的水配制而成。
（d）将提取液冷却至室温，装入截留分子量为3500的透析袋中，然后完全浸入去离子水中透析3天，透析前12h每2h换一次水，透析12h后每4h换一次水，透析24h后每8h换一次水，透析后经过冷冻干燥，分别得到从样品a、样品b中提取的提取物a和提取物b。
（e）将提取物a、提取物b分别溶解到含有5wt%的脱氧胆酸钠的0.05mol/l的tris-hcl溶液中，再添加二硫苏糖醇溶液中使其浓度达到0.01mol/l，在45℃下反应25min，待冷却至室温后加入碘乙酰胺使其终浓度为0.04wt%，在避光条件下反应35min，然后将溶液转移至超滤管中以16000r/min的速率离心处理8min，加入胰蛋白酶（1微克每50微升的tris-hcl溶液）进行酶解，酶解温度为39℃，时间为20h，取酶解产物，用c18脱盐柱进行除盐处理，冷冻干燥，分别得到检测样a、检测样b，将检测样a、检测样b分别溶解于0.12wt%的甲酸溶液中进行质谱检测。
（f）采用hplc-ms/ms对检测样a、检测样b进行分析，对分析结果进行对比。检测结果显示，检测样a的检测结果获得了羊毛的一系列肽段，检测样b的检测结果中没有得到同样或者同源的肽段且与羊毛氨基酸序列库没有相符序列，则判定样品b不是羊毛。
其中，所述hplc-ms/ms的检测条件为：液相采用100分钟梯度，流速为200nl/min；质谱数据采集选择信号排名前30的多肽进行碎裂，蛋白数据库检索采用proteomediscoverersoftware。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。