本发明涉及一种鉴别移栽黄芪和野生黄芪的方法，具体属于荧光辅助凝胶电泳技术，以黄芪多糖部分酸水解后差异性糖片段的含量为鉴定依据的移栽黄芪和野生黄芪的鉴别方法。
背景技术：
：传统的野生黄芪主要是指生长年限在5年以上、自然繁殖或人工撒种后自然生长的蒙古黄芪或膜荚黄芪。野生的蒙古黄芪主要分布在山西、内蒙、甘肃、陕西等省，其中山西和内蒙古产的5～8年生的蒙古黄芪为道地药材，具有“主根粗长、少分支、绵性大、粉性强、甜味足、豆腥味浓”等特点。野生膜荚黄芪主产区为黑龙江、吉林，生长年限在6年以上，商品量极小。移栽黄芪主要是指生长年限在1～3年、人工栽培的蒙古黄芪或膜荚黄芪。生长2～3年的移栽黄芪主要分布在甘肃、宁夏、内蒙古等省，以蒙古黄芪为主；河北、山东也有栽培一年即采收上市的膜荚黄芪。这种移栽黄芪外观与野生黄芪有较大差别，呈现“主根短，分枝多，质坚硬，鸡爪形，微甜而淡”等特征。二者的化学成分有差异导致其药效不同，虽然黄芪根部形态特征有明显区别，但制备成饮片或打粉后，肉眼难以区别。因此，近年来药材市场上出现了两种黄芪混杂现象，扰乱了中药材市场。临床研究表明，糖类成分是黄芪发挥免疫调节作用的主要物质。因此，将糖类成分作为黄芪质量控制与品质评价的标准，具有良好的研究前景和意义。国内外学者也采用苯酚硫酸法测定总多糖含量比较不同生长年限、不同栽培方式的黄芪，然而，所测定的指标缺乏专属性特征，限制了应用多糖作为黄芪鉴别的方法。授权公告号为104122287b的发明专利公开了一种野生黄芪和栽培黄芪的鉴别方法，该方法通过核磁技术获得黄芪药材的核磁共振氢谱，对蔗糖、α-葡萄糖和β-葡萄糖信号分别进行手动积分，计算蔗糖和葡萄糖的积分面积比值，根据比值的范围鉴别野生黄芪和栽培黄芪。申请公布号cn106093240a公开了一种速生黄芪和野生黄芪的鉴别方法，该方法利用气相色谱质谱技术分析黄芪中细胞壁糖类成分，从而区分速生黄芪和野生黄芪。上述方法中使用核磁技术和气相色谱质谱技术，其实验成本高、操作复杂而且实验数据处理较为繁琐，不适于普及和推广。技术实现要素：本发明的目的是解决现有移栽黄芪和野生黄芪鉴别方法专属性低、操作复杂、实验成本高的技术问题，提供一种鉴别移栽黄芪和野生黄芪的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种鉴别移栽黄芪和野生黄芪的方法，包括如下步骤：1)原料预处理：将干燥的黄芪粉碎成粉末后过100目筛得到黄芪细粉，备用；2)提取粗多糖：取上述黄芪细粉加水后在100℃的温度下回流提取1h，降至室温后离心取上清液；残渣再加水重复提取1次，取上清，合并上清液；浓缩，将合并的上清液用95％的乙醇调节至含醇量为80％，3000r/min离心10min，合并沉淀，冷冻干燥得多糖粗粉；3)纯化多糖：将步骤2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉与水的质量比为1:200，向多糖粗粉溶液中加入浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液，所述浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液的加入量均为多糖粗粉溶液体积的10％，振摇后静置30min，离心得到纯化多糖，冻干，备用；4)多糖酸水解：取步骤3)得到的纯化多糖10mg，加入0.5mol/l三氟乙酸500μl，混匀，随后将混合液置于90℃保温1h，反应结束后，用氮吹干燥仪干燥多糖酸水解产物，然后加入适量甲醇清洗水解产物，继续氮气吹干；5)多糖酸水解产物、三糖标准品和四糖标准品的衍生化：取三糖标准品6mg、四糖标准品8mg以及步骤4)中的多糖酸水解产物，分别加入200μl的nacnbh3溶液，再分别加入200μl的ants衍生化试剂，涡旋，混匀；37℃恒温反应15h后，将三种产物用氮气吹干，溶于1ml6mol/l的尿素溶液，制成三糖标准品、四糖标准品及多糖酸水解产物的衍生化样品，其中三糖标准品和四糖标准品的衍生化样品用6mol/l的尿素溶液分别稀释成不少于6个浓度梯度的衍生化样品；6)衍生化样品电泳分析：取步骤5)中多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品的衍生化样品，采用垂直板凝胶电泳分离每个衍生化样品，分离胶为浓度为30％的聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶为浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液为ph8.0-9.0、浓度0.1-0.2mol/l的tris-boric，上样量为1-3μl，凝胶在uv300nm条件下成像，获得多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品衍生化样品的电泳图；7)绘制三糖标准品和四糖标准品的标准曲线：将多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品衍生化样品的电泳图导入quantityone软件，经过处理后，得到多糖酸水解产物及三糖标准品和四糖标准品的光密度值，以三糖标准品和四糖标准品的光密度值为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；8)移栽黄芪和野生黄芪的鉴别：将多糖酸水解产物的光密度值带入步骤7)中的标准曲线，计算黄芪多糖中三糖和四糖的含量，并根据以下标准鉴别移栽黄芪和野生黄芪：当三糖含量＜3.0mg/ml，且四糖含量＜3.2mg/ml时，为移栽黄芪；当三糖含量＞3.0mg/ml，且四糖含量＞3.2mg/ml时，为野生黄芪。进一步地，步骤2)中所述黄芪细粉与水的质量比为1:100。进一步地，步骤2)中所述残渣与水的质量比为1:80。进一步地，步骤6)中分离胶和浓缩胶的配制溶剂为ph8.0～9.0、浓度0.1～0.2mol/l的tris-boric缓冲液。进一步地，步骤6)中的电泳分离过程分两步进行，首先采用60-80v的分离电压电泳分离40-60min，随后采用100-200v的分离电压电泳分离100-120min。本发明的有益效果是：1)本发明将黄芪中的多糖部分酸水解，利用荧光辅助凝胶电泳技术分析，找出移栽黄芪和野生黄芪糖成分的差异，用于黄芪栽培方式的鉴别。该方法不仅操作简便、实验成本低，而且不同栽培方式黄芪多糖部分酸水解后形成的糖组分差异明显，可用于黄芪栽培方式的鉴别。2)本发明采用的荧光辅助凝胶电泳(pace)技术，是一种十分便捷的多糖水解产物分离技术，具有分辨率高、重复性好、稳定性高、可多个样品同时分析等特点；由于糖类化合物不带紫外或荧光基团，本发明在进行pace分析之前，使用衍生化试剂8-氨基萘-1，3，6-三磺酸钠(ants)对多糖水解产物做衍生化处理，使多糖水解产物携带紫外基团和荧光基团，使检测的灵敏度大大提高。附图说明图1为不同栽培方式黄芪多糖部分酸水解产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图2为不同栽培方式黄芪多糖部分酸水解产物的指纹图谱；图3为差异性糖片段的t检验分析图；图4为不同栽培方式的黄芪多糖部分酸水解产物的pls-da图；图5为pls-da分析模型验证图；图6为差异性糖片段的载荷图；图7为不同栽培方式的黄芪多糖部分酸水解产物的差异性糖片段数目图；图8为三糖标准品的标准曲线图；图9为四糖标准品的标准曲线图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例1本实施例中的一种鉴别移栽黄芪和野生黄芪的方法，包括如下步骤：1)原料预处理：将干燥的黄芪粉碎成粉末后过100目筛得到黄芪细粉，备用；2)提取粗多糖：取上述黄芪细粉约5g，精密称定后置于1000ml圆底烧瓶中，加水500ml，在100℃的温度下回流提取1h，降至室温后离心取上清液；残渣再加水400ml，重复提取1次，取上清，合并上清；浓缩，将合并的上清液用95％的乙醇调节至含醇量为80％，3000r/min离心10min，合并沉淀，冷冻干燥得多糖粗粉；3)纯化多糖：将步骤2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉与水的质量比为1:200，向多糖粗粉溶液加入浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液，所述浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液的加入量均为多糖粗粉溶液体积的10％，振摇后静置30min，离心得到纯化多糖，冻干，备用；4)多糖酸水解：取步骤3)得到的纯化多糖10mg，加入0.5mol/l三氟乙酸500μl，混匀，随后将混合液置于90℃保温1h，反应结束后，用氮吹干燥仪干燥多糖酸水解产物，然后加入适量甲醇清洗水解产物，继续氮气吹干；5)多糖酸水解产物、三糖标准品和四糖标准品的衍生化：取三糖标准品6mg、四糖标准品8mg以及步骤4)中的多糖酸水解产物，分别加入200μl的nacnbh3溶液，再分别加入200μl的ants衍生化试剂，涡旋，混匀；37℃恒温反应15h后，将三种产物用氮气吹干，溶于1ml6mol/l的尿素溶液，制成三糖标准品、四糖标准品及多糖酸水解产物的衍生化样品，其中三糖标准品和四糖标准品的衍生化样品用6mol/l的尿素溶液分别稀释成不少于6个浓度梯度的衍生化样品；6)衍生化样品电泳分析：取步骤5)中多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品的衍生化样品，采用垂直板凝胶电泳分离每个衍生化样品；分离胶为浓度为30％的聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶为浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶，所述分离胶和浓缩胶的配制溶剂均为ph8.2、浓度0.1mol/l的tris-boric缓冲液；电泳缓冲液为ph8.2、浓度0.1mol/l的tris-boric，上样量为1μl；首先采用60v的分离电压电泳分离60min，随后采用200v的分离电压电泳分离120min；凝胶在uv300nm条件下成像，获得多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品衍生化样品的电泳图；7)绘制三糖标准品和四糖标准品的标准曲线：将多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品衍生化样品的电泳图导入quantityone软件，经过处理后，得到多糖酸水解产物及三糖标准品和四糖标准品的光密度值，以三糖标准品和四糖标准品的光密度值为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；8)移栽黄芪和野生黄芪的鉴别：将多糖酸水解产物的光密度值带入步骤7)中的标准曲线，计算黄芪多糖中三糖和四糖的含量，并根据以下标准鉴别移栽黄芪和野生黄芪：当三糖含量＜3.0mg/ml，且四糖含量＜3.2mg/ml时，为移栽黄芪；当三糖含量＞3.0mg/ml，且四糖含量＞3.2mg/ml时，为野生黄芪。本实施例中计算所的三糖含量＝3.310mg/ml，四糖含量＝3.242mg/ml，鉴别结果为野生黄芪。实施例2本实施例中的一种鉴别移栽黄芪和野生黄芪的方法，包括如下步骤：1)原料预处理：将干燥的黄芪粉碎成粉末后过100目筛得到黄芪细粉，备用；2)提取粗多糖：取上述黄芪细粉约5g，精密称定后置于1000ml圆底烧瓶中，加水500ml，在100℃的温度下回流提取1h，降至室温后离心取上清液；残渣再加水400ml，重复提取1次，取上清，合并上清；浓缩，将合并的上清液用95％的乙醇调节至含醇量为80％，3000r/min离心10min，合并沉淀，冷冻干燥得多糖粗粉；3)纯化多糖：将步骤2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉与水的质量比为1:200，向多糖粗粉溶液加入浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液，所述浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液的加入量均为多糖粗粉溶液体积的10％，振摇后静置30min，离心得到纯化多糖，冻干，备用；4)多糖酸水解：取步骤3)得到的纯化多糖10mg，加入0.5mol/l三氟乙酸500μl，混匀，随后将混合液置于90℃保温1h，反应结束后，用氮吹干燥仪干燥多糖酸水解产物，然后加入适量甲醇清洗水解产物，继续氮气吹干；5)多糖酸水解产物、三糖标准品和四糖标准品的衍生化：取三糖标准品6mg、四糖标准品8mg以及步骤4)中的多糖酸水解产物，分别加入200μl的nacnbh3溶液，再分别加入200μl的ants衍生化试剂，涡旋，混匀；37℃恒温反应15h后，将三种产物用氮气吹干，溶于1ml6mol/l的尿素溶液，制成三糖标准品、四糖标准品及多糖酸水解产物的衍生化样品，其中三糖标准品和四糖标准品的衍生化样品用6mol/l的尿素溶液分别稀释成不少于6个浓度梯度的衍生化样品；6)衍生化样品电泳分析：取步骤5)中多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品的衍生化样品，采用垂直板凝胶电泳分离每个衍生化样品；分离胶为浓度为30％的聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶为浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶，所述分离胶和浓缩胶的配制溶剂均为ph8.5、浓度0.2mol/l的tris-boric缓冲液；电泳缓冲液为ph8.5、浓度0.2mol/l的tris-boric，上样量为1μl；首先采用70v的分离电压电泳分离50min，随后采用150v的分离电压电泳分离110min；凝胶在uv300nm条件下成像，获得多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品衍生化样品的电泳图；7)绘制三糖标准品和四糖标准品的标准曲线：将多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品衍生化样品的电泳图导入quantityone软件，经过处理后，得到多糖酸水解产物及三糖标准品和四糖标准品的光密度值，以三糖标准品和四糖标准品的光密度值为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；8)移栽黄芪和野生黄芪的鉴别：将多糖酸水解产物的光密度值带入步骤7)中的标准曲线，计算黄芪多糖中三糖和四糖的含量，并根据以下标准鉴别移栽黄芪和野生黄芪：当三糖含量＜3.0mg/ml，且四糖含量＜3.2mg/ml时，为移栽黄芪；当三糖含量＞3.0mg/ml，且四糖含量＞3.2mg/ml时，为野生黄芪。本实施例中计算所得三糖含量＝2.662mg/ml，四糖含量＝3.122mg/ml，鉴别结果为移栽黄芪。实施例3本实施例中的一种鉴别移栽黄芪和野生黄芪的方法，包括如下步骤：1)原料预处理：将干燥的黄芪粉碎成粉末后过100目筛得到黄芪细粉，备用；2)提取粗多糖：取上述黄芪细粉约5g，精密称定后置于1000ml圆底烧瓶中，加水500ml，在100℃的温度下回流提取1h，降至室温后离心取上清液；残渣再加水400ml，重复提取1次，取上清，合并上清；浓缩，将合并的上清液用95％的乙醇调节至含醇量为80％，3000r/min离心10min，合并沉淀，冷冻干燥得多糖粗粉；3)纯化多糖：将步骤2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉与水的质量比为1:200，向多糖粗粉溶液加入浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液，所述浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液的加入量均为多糖粗粉溶液体积的10％，振摇后静置30min，离心得到纯化多糖，冻干，备用；4)多糖酸水解：取步骤3)得到的纯化多糖10mg，加入0.5mol/l三氟乙酸500μl，混匀，随后将混合液置于90℃保温1h，反应结束后，用氮吹干燥仪干燥多糖酸水解产物，然后加入适量甲醇清洗水解产物，继续氮气吹干；5)多糖酸水解产物、三糖标准品和四糖标准品的衍生化：取三糖标准品6mg、四糖标准品8mg以及步骤4)中的多糖酸水解产物，分别加入200μl的nacnbh3溶液，再分别加入200μl的ants衍生化试剂，涡旋，混匀；37℃恒温反应15h后，将三种产物用氮气吹干，溶于1ml6mol/l的尿素溶液，制成三糖标准品、四糖标准品及多糖酸水解产物的衍生化样品，其中三糖标准品和四糖标准品的衍生化样品用6mol/l的尿素溶液分别稀释成不少于6个浓度梯度的衍生化样品；6)衍生化样品电泳分析：取步骤5)中多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品的衍生化样品，采用垂直板凝胶电泳分离每个样品；分离胶为浓度为30％的聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶为浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶，所述分离胶和浓缩胶的配制溶剂均为ph9.0、浓度0.15mol/l的tris-boric缓冲液；电泳缓冲液为ph9.0、浓度0.15mol/l的tris-boric，上样量为1μl；首先采用80v的分离电压电泳分离40min，随后采用100v的分离电压电泳分离100min；凝胶在uv300nm条件下成像，获得多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品衍生化样品的电泳图；7)绘制三糖标准品和四糖标准品的标准曲线：将多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和四糖标准品衍生化样品的电泳图导入quantityone软件，经过处理后，得到多糖酸水解产物及三糖标准品和四糖标准品的光密度值，以三糖标准品和四糖标准品的光密度值为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；8)移栽黄芪和野生黄芪的鉴别：将多糖酸水解产物的光密度值带入步骤7)中的标准曲线，计算黄芪多糖中三糖和四糖的含量，并根据以下标准鉴别移栽黄芪和野生黄芪：当三糖含量＜3.0mg/ml，且四糖含量＜3.2mg/ml时，为移栽黄芪；当三糖含量＞3.0mg/ml，且四糖含量＞3.2mg/ml时，为野生黄芪。本实施例中计算所得三糖含量＝3.010mg/ml，四糖含量＝3.212mg/ml，鉴别结果为野生黄芪。上述实施例中的三糖标准品来自中国药品生物制品鉴定所，批号是100274，四糖标准品来自天津士兰科技有限公司，批号是catno：pcm-my-001、20150401。本发明鉴别黄芪栽培方式的标准是通过以下实验获得的。以下实验中采用的移栽黄芪取自甘肃陇西及山东文登等地，野生黄芪取自山西浑源及黑龙江等地，2类黄芪各取12个样本。按照本发明的方法对选取的黄芪样本进行处理，制成衍生化产物样品，然后采用凝胶电泳法进行分离，得到每个黄芪样品的电泳图，如图1所示，图中，s为含有6个聚合度糖的糖标准品，1-6及13-18号为野生黄芪样品，7-12及19-24号为移栽黄芪样品，dp表示单糖聚合度，dp1-dp6分别为一糖、二糖、三糖、四糖、五糖和六糖。将图1中的电泳图导入quantityone软件，经过处理后，得到与电泳图相对应的指纹图谱，如图2所示，图中，1-6及13-18号为野生黄芪样品，7-12及19-24号为移栽黄芪样品。将图2中的指纹图谱数据导入spss16.0进行t检验分析，得到图3，由图3可知，三糖和四糖具有显著性差异，即三糖和四糖是区分黄芪栽培方式的主要差异性片段，图中*代表显著性差异的多糖片段。将图2中的指纹图谱数据导入smica-p13.0进行分析，分析结果如图4、图5和图6，图4为不同栽培方式的黄芪多糖部分酸水解产物的pls-da图，由图4可知，移栽黄芪和野生黄芪可以得到很明显的分离；图5为pls-da分析模型的验证图，图中r2为解释模型值，q2为预测模型值，由图5可知pls-da模型验证成立，该模型可用于黄芪栽培方法鉴别中差异性糖片段的寻找；图6为差异性糖片段的载荷图，由图6可知散点离中心较远，不同栽培方式的黄芪间差异较大。对差异性糖片段数量进行统计，得到图7，由图7可知，三糖和四糖是区分黄芪栽培方式的主要差异性片段。将图2指纹图谱中的光密度值分别带入三糖标准品和四糖标准品的标准曲线中，计算黄芪样品中的三糖及四糖含量，图8和图9分别为三糖标准品和四糖标准品的标准曲线，图中，y为光密度值，x为浓度值，r2为相关系数，计算结果如表1所示；黄芪样品编号三糖含量(mg/ml)四糖含量(mg/ml)13.3103.24223.0883.33433.3843.46143.2703.21053.0133.29163.0583.20872.9583.03482.6623.12292.8663.131102.9912.973112.9782.963122.6603.045133.1673.274143.1583.244153.1973.252163.0363.432173.0383.245183.3303.232192.5093.121202.9613.122212.7633.034222.8943.131232.9593.032242.9743.142表1表1为24个黄芪样品中的三糖及四糖的含量；由表1可知，1-6及13-18号野生黄芪样品中的三糖含量均大于3.0mg/ml，四糖含量均大于3.2mg/ml；7-12及19-24号移栽黄芪样品中的三糖含量均小于3.0mg/ml，四糖含量均小于3.2mg/ml。因此，本发明可以将三糖、四糖的含量作为鉴别黄芪栽培方式的标准，即当三糖含量＜3.0mg/ml，且四糖含量＜3.2mg/ml时，为移栽黄芪；当三糖含量＞3.0mg/ml，且四糖含量＞3.2mg/ml时，为野生黄芪。当前第1页12