一种梭子蟹肌孢虫的染色方法与流程

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种梭子蟹肌孢虫的染色方法，具体来说是一种针对三疣梭子蟹肌肉内寄生的梭子蟹肌孢虫的染色方法。

背景技术：

梭子蟹肌孢虫是近年来新发现的一种感染三疣梭子蟹的微孢子虫，主要寄生在三疣梭子蟹的肌肉组织，导致肌肉病变呈白化状。据调查了解，该病在我国东部沿海已发生多年，因病蟹附肢挤出的肌肉类似牙膏，故养殖户称其为“牙膏病”。该病流行范围广，山东、江苏、浙江、福建等沿海区域均有发现，发病期一般为7～11月份，9～10月死亡高峰期。梭子蟹肌孢虫不同于其它类水生寄生虫，它具有专性细胞内寄生的特点，一旦在宿主体内形成成熟孢子，一般的外源性药物很难对其杀灭，养殖中后期梭子蟹因微孢子虫寄生而全身肌肉白化丧失商品价值，而且临床症状不易被养殖户发现，后期大量死亡致使养殖户养殖收益受损。梭子蟹肌孢虫已影响我国三疣梭子蟹的养殖产量。

组织病理学检查能够清晰直观反映出病原侵染的具体部位，确定病原是寄生在细胞外环境还是细胞内，甚至可区分病原是在细胞核内寄生还是在细胞质内寄生。分子诊断方法虽然近年来急速发展，并在临床诊断中广泛应用，但单纯使用分子手段，如pcr方法，仅能确认所采样组织是否含有病原体，而对病原的寄生状态及组织病理变化无法直接体现，使用组织病理学手段，可以弥补单纯使用分子检测方法的不足。染色是组织病理切片制作中至关重要的环节，理想和可靠的染发方法有利于区分和诊断病原。he染色法是组织病理中最为普用的染色方法，它适用生物种类范围广，对多数器官组织具有较好的染色效果，因此，在病理研究和诊断应用中，它常作为首选染色方法。但该方法也具有局限性，我们对患“牙膏病”蟹的肌肉进行组织病理学研究发现，在病变肌肉的湿涂片中可以镜检到大量的梭子蟹肌孢虫孢子，而在常规he染色切片中，却很难镜检到大量的孢子，即使在高倍视野下(1000倍)，孢子着色较浅，与肌肉组织背景颜色对比不明显，难以区分。因此，针对三疣梭子蟹“牙膏病”，需要建立一种特殊的染色方法，以将孢子与病变肌肉组织区分。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种梭子蟹肌孢虫的染色方法。本发明是通过以下方案实现的：

一种梭子蟹肌孢虫的染色方法，包括以下步骤：

s1.取梭子蟹肌肉组织，用davidson’safa固定液固定；

s2.制作组织石蜡包埋块；然后利用组织切片机制作5um厚切片；

s3.二甲苯脱蜡2次；时间可以为5min/次；

s4.乙醇梯度水化：100％乙醇2-4min，100％乙醇2-4min，95％乙醇2-4min，85％乙醇2-4min，75％乙醇2-4min，50％乙醇2-4min，蒸馏水洗2-4min；所述乙醇浓度均为体积百分比；

s5.weigert氏铁苏木素染液染色4-6min，水洗，1％的盐酸酒精分化，流水冲洗返蓝；所述1％的盐酸酒精是用质量分数为37％的盐酸与体积分数为70％的乙醇按体积1:99混合而成；

s6.丽春红酸性品红液染色6-8min，水漂洗，磷钼酸水溶液分化3-5min；

s7.苯胺蓝液复染4-6min，体积百分比为1％的冰醋酸水溶液分化1min；

s8.用95％体积百分比的乙醇和100％乙醇分别脱水，二甲苯透明，晾干。

其中，步骤s5中所述weigert氏苏木素染液包括溶液a和溶液b；染色时，将溶液a和溶液b等体积混合；

所述溶液a的制备方法为将苏木精按0.8～1.2g:100ml的比例溶解于体积百分比为95％酒精；

所述溶液b的制备方法为取质量百分比为29％三氯化铁溶液加入到蒸馏水中后，再加入浓盐酸，所述三氯化铁溶液、蒸馏水和浓盐酸的体积比为4：95：1；所述浓盐酸的质量百分比为37％。

其中，步骤s6中所述丽春红酸性品红染液由丽春红、酸性品红、水与冰醋酸按0.7g：0.3g：99ml：1ml配制而成。

其中，步骤s6中所述磷钼酸水溶液的质量百分比为1％。

其中，步骤s7中所述苯胺蓝液由苯胺蓝、水与冰醋酸按2g：98ml：2ml配制而成。

用本发明提供的染色方法进行染色后：病变肌肉组织经染色后，肌纤维呈蓝色条带状，梭子蟹肌孢虫孢子呈红色卵圆形，形态结构清晰，与背景组织对比清晰，易辨别。

附图说明

图1为病变肌肉组织he染色，400倍。图中，1为肌肉，2梭子蟹肌孢虫。

图2实施例1中病变肌肉组织染色，400倍。图中，1为肌肉，2梭子蟹肌孢虫。

图3病变肌肉组织he染色，1000倍。图中，1为肌肉，2梭子蟹肌孢虫。

图4实施例1中病变肌肉组织染色，1000倍。图中，1为肌肉，2梭子蟹肌孢虫。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例1

制备95％乙醇：乙醇95ml，蒸馏水5ml。

制备85％乙醇：乙醇85ml，蒸馏水15ml。

制备75％乙醇：乙醇75ml，蒸馏水25ml。

制备50％乙醇：乙醇50ml，蒸馏水50ml。

davidson’safa固定液：冰醋酸57.5ml，甲醛110ml，95％乙醇165ml，过滤海水167.5ml。

制备weigert氏苏木素染液：溶液a：将1g苏木精加入100ml95％酒精，溶解。溶液b：取29％三氯化铁溶液4ml，加入到95ml蒸馏水中，最后加入1ml浓盐酸。染色时，将溶液a和b等比例混合，两液不宜预先混合，否则预混液容易氧化而失去染色力。

制备1％的盐酸酒精：1ml37％盐酸(质量分数)，99ml70％乙醇(体积分数)。

制备丽春红酸性品红染液：丽春红0.7g，酸性品红0.3g，蒸馏水99ml，冰醋酸1ml。

制备磷钼酸水溶液：磷钼酸1g，蒸馏水99g。

制备苯胺蓝水溶液：苯胺蓝2g，蒸馏水98ml，冰醋酸2ml。

制备1％冰醋酸：冰醋酸1ml，蒸馏水99ml。

染色过程：

1.解剖活体或濒死“牙膏蟹”，剪取肌肉组织，用davidson’safa固定液固定24h。

2.常规方法制作组织石蜡包埋块，然后利用组织切片机制作5um厚切片。

3.二甲苯脱蜡2次，每次5min。

4.乙醇水化：100％乙醇3min，100％乙醇3min，95％乙醇3min，85％乙醇3min，75％乙醇3min，50％乙醇3min，蒸馏水洗3min。

5.weigert氏铁苏木素染液染色5min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，流水冲洗数分钟返蓝。

6.丽春红酸性品红液染色7min，蒸馏水快速漂洗，磷钼酸水溶液分化约3-5min，

7.苯胺蓝液复染5min，1％冰醋酸分化1min。

8.95％乙醇和100％乙醇脱水，二甲苯透明，晾干后中性树胶封片。

400倍和1000倍的图见图2和图4所示，其中1为肌肉，2梭子蟹肌孢虫。实施例1染色结果可以看出病变肌肉组织经染色后，(染色后，1肌纤维呈蓝色条带状，2梭子蟹肌孢虫孢子呈红色卵圆形)形态结构清晰，与背景组织对比清晰，易辨别。而he染色效果见图1和图3所示，其中1为肌肉，2梭子蟹肌孢虫。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。