一种梨形虫血涂片复合染液及血涂片的染色方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种梨形虫血涂片复合染液及血涂片的染色方法。

背景技术：

梨形虫病（piroplasmosis），又名“焦虫病”或“血孢子虫病”。是一类经硬传播的血液寄生原虫病，包括泰勒虫（theileriaapp）和巴贝斯虫（babesiaapp）所引起的血液原虫病的总称。多见于牛、马、羊等家畜和啮齿类动物及其它野生动物，本病临床上出现稽留热、贫血、呼吸困难、黄疸等症状，如诊治不及时，死亡率极高，本病在世界各地广泛流行，给畜牧业和国民经济造成巨大损失，据联合国粮农组织（fao）统计，蜱和蜱传血液原虫病每年可给畜牧业生产造成大约70亿美元的经济损失。该病在我国分布广泛，全国31个省市几乎都有本病的发生或病原分离的报道，对我国畜牧业的生产造成巨大的经济损失。据估计，我国每年约有3500万头（只）小反刍动物感染梨形虫病，直接年经济损失可达3-4亿元。由于本病的病原是由硬蜱传播，所以一旦传入将很难消除。目前在有关文献中提到用血液涂片针对虫体进行染色，其染色方法过于复杂，用时较长，并且染色效果不理想，染色杂质较多，影响观察虫体。

技术实现要素：

本发明的目的之一：研制一种梨形虫血涂片复合染液配方，使用这种配方能很好对梨形虫进行染色，便于观察和教学；之二就是利用上述染料通过设计合理的染色方法能更好的对血液中的梨形虫进行染色。

本发明的技术方案一：一种梨形虫血涂片复合染液，所述复合染液包括复合染液ⅰ和复合染夜ⅱ；所述的复合染液ⅰ是由瑞氏染料2g、吉姆萨色素1.7g、甘油50ml及甲醇1000ml组成，具体制备方法为：将瑞氏染料2g及吉姆萨色素1.7g加入研钵中，加50ml甘油研磨成均匀糊状后加入1000ml甲醇，研磨并收集上层染液保存于棕色瓶中，即可；所述复合染液ⅱ是由无水磷酸二氢钠2.3g、无水磷酸二氢钾0.3g及1000ml的蒸馏水组成，具体制备方法为：将无水磷酸二氢钠2.3g、无水磷酸二氢钾0.3g加入1000ml的蒸馏水中溶解，制备出ph值为6.5-6.8磷酸缓冲液即可。

本发明的技术方案二、一种梨形虫血涂片的染色方法，该染色方法包括下述步骤：

一、用移液器吸取20μl带有梨形虫的血滴，滴到载玻片a一端，另取一块边缘光滑载玻片b作为推片，放在血滴正中，使血液沿载玻片b边沿匀开，后将载玻片b45°放到载玻片a空白地方向后推片，使载玻片a片上留下一层薄血膜；推片成功之后室温放置，使血膜干燥，涂片时需注意血膜的厚度，红细胞分布要均匀，保证红细胞不要堆积，同时血膜上不能有间隙，备用；

二、将步骤一中制备好的血涂片放置室温5分钟，待血液完全风干后放入甲醇中对红细胞进行固定，再次放置在室温中3分钟，待甲醇挥发干净，备用；

三、将步骤二中制备好的血涂片放入复合染液ⅰ中1-1.5min；然后取出血涂片放入复合染液ⅱ中1-2min；最后再用清水进行轻轻涮洗，室温晾干即可染色制成梨形虫血涂片。

上述技术方案中涉及到的材料均为市售可得。

有益效果：本发明的复合染料和染色方法在不需借助高端的仪器设备的情况下对梨形虫染色效果较好，经济实用，所需时间较短，无杂质干扰观察虫体，效果极为突出。

附图说明

附图1为牛双芽巴贝斯血涂片；附图2为牛巴贝斯血涂片；附图3为马驽巴贝斯虫血涂片。

具体实施方式

实施例1、一种梨形虫血涂片复合染液，所述复合染液包括复合染液ⅰ和复合染夜ⅱ；所述的复合染液ⅰ是由瑞氏染料2g、吉姆萨色素1.7g、甘油50ml及甲醇1000ml组成，具体制备方法为：将瑞氏染料2g及吉姆萨色素1.7g加入研钵中，加50ml甘油研磨成均匀糊状后加入1000ml甲醇，研磨并收集上层染液保存于棕色瓶中，即可；所述复合染液ⅱ是由无水磷酸二氢钠2.3g、无水磷酸二氢钾0.3g及1000ml的蒸馏水组成，具体制备方法为：将无水磷酸二氢钠2.3g、无水磷酸二氢钾0.3g加入1000ml的蒸馏水中溶解，制备出ph值为6.5-6.8磷酸缓冲液即可。

实施例2、一种梨形虫血涂片的染色方法，该染色方法包括下述步骤：

一、用移液器吸取20μl带有梨形虫的血滴，滴到载玻片a一端，另取一块边缘光滑载玻片b作为推片，放在血滴正中，使血液沿载玻片b边沿匀开，后将载玻片b45°放到载玻片a空白地方向后推片，使载玻片a片上留下一层薄血膜；推片成功之后室温放置，使血膜干燥，涂片时需注意血膜的厚度，红细胞分布要均匀，保证红细胞不要堆积，同时血膜上不能有间隙，备用；

二、将步骤一中制备好的血涂片放置室温5分钟，待血液完全风干后放入甲醇中对红细胞进行固定，再次放置在室温中3分钟，待甲醇挥发干净，备用；

三、将步骤二中制备好的血涂片放入复合染液ⅰ中1-1.5min；然后取出血涂片放入复合染液ⅱ中1-2min；最后再用清水进行轻轻涮洗，室温晾干即可染色制成梨形虫血涂片。

实施例3，运用上述技术方法所制备的血涂片如附图1、附图2及附图3所示，均可明显的在显微镜下观察到梨形虫。

技术特征：

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种梨形虫血涂片复合染液包括复合染液Ⅰ和复合染夜Ⅱ；所述的复合染液Ⅰ是由瑞士粉2g、吉姆萨色素1.7g、甘油50ml及甲醇1000ml组成，复合染液Ⅱ是由无水磷酸二氢钠2.3g、无水磷酸二氢钾0.3g及1000ml的蒸馏水组成。染色方法包括下述步骤：一、血涂片的制备；二、血涂片二次处理；三、复合染液中进行染色。本发明的复合染料和染色方法在不需借助高端的仪器设备的情况下对梨形虫染色效果较好，经济实用，所需时间较短，无杂质干扰观察虫体，效果极为突出。

技术研发人员：海尼木古力·艾合买提;张杨;巴音查汗·盖力克;刘世芳;郭庆勇;谢小婉;王盼举;闻秀秀;宋瑞其
受保护的技术使用者：托克逊县夏乡畜牧业服务中心
技术研发日：2017.06.15
技术公布日：2017.10.27