一种基于荧光素‑PAN荧光法测定水样中镉的方法与流程

本发明属于镉测定技术领域，尤其涉及一种基于荧光素-pan荧光法测定水样中镉的方法。

背景技术：

镉(cadmium,cd)是一种广泛应用于工业过程中的重金属，如金属电镀，着色剂，可充电镍镉电池。同时，镉是一种高毒物质，它能够引起严重的环境和健康问题，长期过量接触镉会引起慢性中毒，它能够在生物体的细胞内聚集，如肺部，前列腺，引起肾脏的癌症和其他疾病对人类和生物都能够产生严重的影响。许多产品如塑料，化石燃料燃烧，化妆品，水资源和瓦斯等都会发现毒性极大的镉。严重的镉中毒可引起脊柱畸形、骨脆化和内脏损伤等症状，甚至导致死亡。镉对水体土壤的污染，可造成公害病痛痛病。因此，建立一种灵敏、快速、准确的镉检测方法，对于环境危险预警和人的健康具有着重要意义。1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚(1-(2-pyridinylazo)-2-naohthalenol，pan)，由苏联化学家齐齐巴宾等首先合成的，通过2-氨基吡啶经重氮化后，与2-萘酚偶合而得。是一种外观橙红色的结晶粉末，不溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂。能够与多种金属离子形成红色或者其他颜色的配合物，作为显色剂已经用于多种金属的测定，如铜、锌、锰等。

目前检测镉的方法主要有原子吸收法、分光光度法、电感耦合等离子体发射光谱法(icp-aes)、电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)、电化学分析法、原子荧光光谱法、荧光光谱法。以上方法中原子吸收法灵敏度高，可是影响因素多，准确度相对较低；分光光度法适用范围广，仪器成本低，操作简便，但是灵敏度相对较低；而icp-ace和icp-ms需要高昂的仪器设备，检测成本相对较高，不能很好的普及到常规检测之中。而荧光光谱法具有仪器简单、操作简便快速、灵敏度高等优点，是一种新型的光谱分析检测方法。目前用荧光猝灭法测镉已经见有报道。但是以cd(ⅱ)-荧光素-pan为反应体系的研究经查阅国内外文献尚未见报道。

综上所述，目前检测镉的方法或多或少存在一定的不足，如准确度相对较低，灵敏度相对较低，检测成本相对较高等。因此本发明就是建立一种具有仪器普及、操作简便快速、灵敏度高等特点的光谱分析检测镉的方法。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于荧光素-pan荧光法测定水样中镉的方法。

本发明是这样实现的，一种基于荧光素-pan荧光法测定水样中镉的方法，所述基于荧光素-pan荧光法测定水样中镉的方法包括以下步骤：

步骤一，在比色管中分别加入无水乙醇，ph9.75氨水-氯化铵缓冲液0.70ml，pan溶液0.40ml，fr0.50ml，不同体积浓度为8.90×10^-5mol·l^-1的cd(ⅱ)，加蒸馏水定容至5.0ml刻度，摇匀，静置；

步骤二，置于thermo-lumina荧光分光光度计上，扫描，在524nm处测定溶液荧光强度值；样品的荧光强度值记为f，试剂空白的荧光强度值记为f0，df＝f0-f；

步骤三，在用蒸馏水洗干净的聚乙烯瓶中，分别过滤两次并置于烧杯中，放在电炉上加热煮沸，，放置使其自然冷却、沉淀；用滤头过滤，待测。

进一步，所述步骤一中：在5.0ml比色管中分别加入无水乙醇1.50ml，ph9.75氨水-氯化铵缓冲液0.70ml，1.21×10^-3mol·l^-1pan溶液0.40ml，1.0×10^-4mol·l^-1fr0.50ml。

进一步，所述步骤一中：加蒸馏水定容至5.0ml刻度，摇匀，静置15min。

进一步，所述步骤二中：置于thermo-lumina荧光分光光度计上，以激发波长为490nm在450～650nm范围内扫描；激发和发射的狭缝宽度均为5nm。

进一步，所述步骤三中：放在电炉上加热煮沸，保持沸10min后取下；用0.22μm滤头过滤，待测。

本发明的优点及积极效果为：在7.81×10^-7-2.14×10^-5mol·l^-1范围内呈线性，方程为δf＝123.63+170.65c(×10^-6mol·l^-1)，相关系数r＝0.9951，检出限2.34×10^-7mol·l^-1，相对标准偏差为0.18％。

本发明的方法操作简单、灵敏快捷、经济实用，可用于实际检测，与石墨炉原子法结果一致(t检验)。本发明主要缓冲液介质中，pan能与fr发生能量转移，使fr发生荧光猝灭，当体系中加入cd(ⅱ)后，fr的猝灭程度加强，利用这一性质，建立了检测环境水样中镉的新方法。新方法操作简单、经济实用，为环境中金属的检测提供实验依据。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于荧光素-pan荧光法测定水样中镉的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的pan-fr-cd(ⅱ)体系的吸收光谱示意图；

图中：1.fr2.fr-cd(ⅱ)3.fr4.fr-cd(ⅱ)5.pan-fr6.pan-fr-cd(ⅱ)

cfr＝1.0×10^-5mol·l^-1,cpan＝7.26×10^-5mol·l^-1,ccd(ⅱ)＝1.78×10^-5mol·l^-1

图3是本发明实施例提供的pan-fr-cd(ⅱ)体系的荧光光谱示意图；

图中：1.fr2.fr-cd(ⅱ)3.pan-fr4-6.pan-fr-cd(ⅱ)；cfr＝1.0×10^-5mol·l^-1,cpan＝7.26×10^-5mol·l^-1；ccd(ⅱ):0.178、0.89、1.424(×10^-5mol·l^-1)。

图4是本发明实施例提供的pan的吸收光谱和fr的荧光光谱示意图；

图中：1、pan吸收光谱；2、fr荧光光谱。

图5是本发明实施例提供的pan+cd(ⅱ)的吸收光谱和fr的荧光光谱示意图；

图中：1.pan+cd(ⅱ)吸收光谱2.fr荧光光谱。

图6是本发明实施例提供的pan-fr-cd(ⅱ)复合物组成的测定示意图。

图7是本发明实施例提供的增敏介质的选择示意图。

图8是本发明实施例提供的ph的影响示意图。

图9是本发明实施例提供的缓冲液用量的影响示意图。

图10是本发明实施例提供的pan用量的影响示意图。

图11是本发明实施例提供的fr用量的影响示意图。

图12是本发明实施例提供的反应时间的影响示意图。

图13是本发明实施例提供的pan-fr-cd(ⅱ)标准曲线荧光图谱示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的基于荧光素-pan荧光法测定水样中镉的方法包括以下步骤：

s101：在5.0ml比色管中分别加入无水乙醇1.50ml，ph9.75氨水-氯化铵缓冲液0.70ml，1.21×10^-3mol·l^-1pan溶液0.40ml，1.0×10^-4mol·l^-1fr0.50ml，不同体积浓度为8.90×10^-5mol·l^-1的cd(ⅱ)，加蒸馏水定容至5.0ml刻度，摇匀，静置15min；

s102：置于thermo-lumina荧光分光光度计上，以激发波长为490nm在450～650nm范围内扫描，在524nm处测定溶液荧光强度值；样品的荧光强度值记为f，试剂空白的荧光强度值记为f0，df＝f0-f，激发和发射的狭缝宽度均为5nm；

s103：在用蒸馏水洗干净的聚乙烯瓶中，分别过滤两次并置于烧杯中，放在电炉上加热煮沸，保持沸10min后取下，放置使其自然冷却、沉淀；用0.22μm滤头过滤，待测。

下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1实验部分

1.1主要仪器和试剂

thermo-lumina荧光分光光度计(赛默飞)；

uv-550型紫外/可见分光光度计(日本岛津)；

afg-12石墨炉原子吸收仪带镉空心阴极灯(北京普析)；

ab204-s电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

电热恒温水浴箱(上海医用恒温设备厂)；

pb-20(pb-s)酸度计(德国赛多利斯有限公司)。

无水乙醇(天津市北联精细化学品开发有限公司)；

荧光素(fr)(中国华东师范大学化工厂)标准溶液：准确称取0.0322g的荧光素于烧杯中，加入少量的无水乙醇溶解，转移到100ml容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，所得浓度为1.0×10^-3mol·l^-1的荧光素溶液。使用时再用无水乙醇稀释成1.0×10^-4mol·l^-1的工作液；

1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚(pan)(上海试剂厂)标准溶液：准确称取0.0300g的pan于烧杯中，加入少量无水乙醇溶解，转移至100ml容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，所得浓度为1.21×10^-3mol·l^-1的工作液；

氨水-氯化铵(西陇化工股份有限公司)缓冲溶液：准确称取5.35g的氯化铵于烧杯中加入少量的水溶解，转移到500ml容量瓶中，加水定容至刻度，所得浓度为0.20mol·l^-1的氯化铵溶液。使用时再用氨水调至ph为9.75的工作液；

cd(天津市科密欧化学试剂)标准溶液：准确称取0.2744g的cd(no3)2·4h2o于烧杯中用1％的硝酸溶解，转移至100ml容量瓶中，用1％硝酸定容至刻度，所得溶液为8.90×10^-3mol·l^-1。实验时用水逐级稀释成8.90×10^-5mol·l^-1的工作液。

所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2实验方法

1.2.1荧光光谱法

在5.0ml比色管中分别加入无水乙醇1.50ml，ph9.75氨水-氯化铵缓冲液0.70ml，1.21×10^-3mol·l^-1pan溶液0.40ml，1.0×10^-4mol·l^-1fr0.50ml，不同体积浓度为8.90×10^-5mol·l^-1的cd(ⅱ)，加蒸馏水定容至5.0ml刻度，摇匀，静置15min。置于thermo-lumina荧光分光光度计上，以激发波长为490nm在450～650nm范围内扫描，在524nm处测定溶液荧光强度值。样品的荧光强度值记为f，试剂空白的荧光强度值记为f0，δf＝f0-f，激发和发射的狭缝宽度均为5nm。

1.2.2石墨炉原子吸收法

在5.0ml比色管中用1％硝酸溶液定容配置标准系列，cd(ⅱ)浓度分别为0、0.712、1.424、2.136、2.848、3.56×10^-8mol·l^-1。测定条件灯电流3ma，工作波长228.8nm，光谱宽带0.4nm，预热电流1ma。石墨炉升温程序见表1。

表1石墨炉升温程序

2结果与讨论

2.1光谱特征及反应机制的探讨

2.1.1pan-fr-cd(ⅱ)体系的吸收光谱

对体系的吸收光谱进行了扫描如图2所示，pan在350～575nm范围内有吸收(curve1)，最大吸收波长470nm，加入cd(ⅱ)后，吸收图谱发生了变化，图谱的波长范围变为350～750nm(curve2)，最大吸收峰红移，最大吸收波长为500nm，同时在550nm处出现了新的峰。fr在400～525nm内有吸收(curve3)，加入cd(ⅱ)后峰型无明显变化(curve4)。pan-fr复合物在350～575nm有吸收，最大吸收波长为491nm，加入cd(ⅱ)后红移，最大吸收波长495nm，同时也在550nm出现了新的峰。

2.1.2pan-fr-cd(ⅱ)体系的荧光光谱

对体系用490nm的激发波长进行荧光光谱扫描，物质之间结合反应见图3，fr在524nm处有一强的荧光发射峰(curve1)。向其中加入cd(ii)溶液，发现其荧光强度几乎没有发生变化(curve2)。pan和fr结合时，因为fr与pan发生能量转移，fr发生荧光猝灭(curve3)。再加入cd(ⅱ)后，其荧光猝灭值随着cd(ⅱ)浓度的升高而增加(curve4～curve6)，使荧光猝灭值的变化出现趋势，从而测定cd(ⅱ)的灵敏度增加。

2.1.3反应机制的探讨

2个荧光分子基团间发生能量转移的必要条件之一，是给体的发射光谱和受体的吸收光谱有一定程度的重叠，光谱重叠的程度与能量转移的效率密切相关^[31]。如图4所示，pan在波长为350～575nm的范围内有吸收光谱，而fr在波长为475～650nm的范围内有荧光发射光谱，这两种染料的光谱有一定的重叠，这是能量转移的前提。如图5所示，当pan与cd(ⅱ)发生结合，形成pan-cd(ⅱ)复合物，吸收光谱发生了一定的变化，光谱范围为350～750nm，这样与fr的荧光发射光谱发生了更大程度的重叠。根据图4到图5的变化便可以解释图3中，当fr中加入pan可以使fr的荧光值发生一定程度的猝灭，而当fr-pan体系中再加入cd(ⅱ)，变为fr-pan-cd(ⅱ)体系的时候，fr的荧光猝灭程度得到进一步的加强。

2.1.4pan-fr和cd(ⅱ)组成测定

采用连续摩尔比法，固定其中两种物质的量不变，改变另外一种物质的量，在荧光分光光度计上测定荧光强度，计算出反应体系复合物的结合比，如图6所示。固定8.9×10^-5mol·l^-1cd(ⅱ)0.50ml，1.0×10^-4mol·l^-1fr0.50ml不变，逐渐改变各管中1.21×10^-3mol·l^-1pan的用量(0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90ml)，按实验步骤进行测定，在pan的用量为0.35ml(8.47×10^-5mol·l^-1)处出现拐点。固定8.9×10^-5mol·l^-1cd(ⅱ)0.50ml，1.21×10^-3mol·l^-1pan0.40ml不变，逐渐改变各管中1.00×10^-4mol·l^-1fr的用量(0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90ml)，按实验步骤进行测定，在fr用量为0.40ml(8.00×10^-6mol·l^-1)处出现拐点。固定1.21×10^-3mol·l^-1pan0.40ml，1.0×10^-4mol·l^-1fr0.50ml不变，逐渐改变各管中8.9×10^-5mol·l^-1cd(ⅱ)的用量(0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40ml)，按实验步骤进行测定，在用量为0.80ml(1.42×10^-5mol·l^-1)处出现拐点。因此，mpan:mfr:mcd(ⅱ)的摩尔结合比为10.59:1:1.78。

2.2实验条件的优化

2.2.1增稳增敏介质的选择

试验了不同增敏介质的影响，如图7所示，十二烷基磺酸钠(sds)对体系的δf影响不大，而十六烷基三甲溴化铵(ctmab)和n-溴代十六烷基吡啶(cpc)均使体系的δf有一定程度的降低，因此本实验不选择要用增敏介质。

2.2.2缓冲液种类优化

在缓冲液种类的选择上，实验中采用了氨水-氯化铵，br缓冲液，硼砂-kh2po4和nah2po4-naoh四种缓冲溶液，如表2所示，氨水-氯化铵δf值最大进行实验。

表2不同缓冲液的影响

2.2.3ph优化

在已经优化好的条件下，试验了氨水-氯化铵ph值的影响，如图8所示，体系的酸度对δf影响较大，当ph值在8.00～9.75时，体系的δf升高；当ph值在9.75～10.5时，体系的δf下降。结果表明，当ph为9.75时体系的δf最大，灵敏度最高，所以选择ph为9.75来维持体系的酸碱度。

2.2.4氨水-氯化铵用量优化

在已优化的条件下，试验了氨水-氯化铵缓冲溶液不同用量的影响。如图9所示，当氨水-氯化铵的用量在0.10～0.60ml时，体系的δf平稳下降，当用量在0.60～0.70ml时，体系的δf升高，而当用量在0.70～1.00ml时，体系的δf下降。结果表明，当用量为0.70ml时，体系的δf最大，所以选择0.70ml进行实验。

2.2.5pan用量优化

在已优化的条件下，试验了pan不同用量的影响，如图10所示，当pan的用量在2.42×10^-5～9.68×10^-5mol·l^-1时，体系的δf升高，而当pan的用量在9.68×10^-5～1.69×10^-4mol·l^-1时，体系的δf下降。结果表明，当pan试剂用量为9.68×10^-5mol·l^-1时，体系的δf最大，所以选择9.68×10^-5mol·l^-1进行实验。

2.2.6荧光素用量优化

在已优化的条件下，试验了荧光素不同用量的影响，如图11所示，当fr的试剂用量在0.20×10^-5～1.00×10^-5mol·l^-1时，体系的δf升高，当1.0×10^-5～1.50×10^-5mol·l^-1时，体系的δf下降。结果表明，当荧光素溶液用量为1.0×10^-5mol·l^-1时，体系的δf最大，所以选择1.0×10^-5mol·l^-1进行实验。

2.2.7时间优化

在已优化的条件下，试验了不同反应时间的影响。如图12所示，反应时间在1～15min的范围内时，体系的δf升高，当达到15min时体系的δf趋于稳定且δf最大，到40min后体系的δf开始降低。故实验选择反应时间为15min，同时在40min内完成测定。

2.2.8反应温度和试剂加入顺序的影响

在已经优化的条件下，试验了不同温度的影响，发现反应温度在15～45℃时，体系的δf无明显变化，因此可以在室温下进行试验。

本发明设计了五种加入顺序，如表3所示，这五种加入顺序的δf相差不是很明显，因此选择其中δf相对较高的第五种作为本发明的试剂加入顺序。

表3加入顺序的影响

2.3共存物质的影响

在实验条件下，对5.0ml样品中8.90×10^-6mol·l^-1的cd(ⅱ)进行了测定，下列水中常见共存物质干扰程度，当相对误差不大于±5％下列物质允许的浓度，如表4所示。

该体系对大部分金属物质具有较好的抗干扰能力，hg²⁺、pb²⁺、mn²⁺、zn²⁺、cu²⁺严重干扰。可以根据实际情况对样品进行前处理，如hg²⁺、zn²⁺可以用na2s沉淀消除，而pb²⁺、mn²⁺、cu²⁺过多的样品则可以通过乙醇、草酸盐沉淀。

表4共存物质的干扰

2.4标准曲线、检出限及精密度

2.4.1标准曲线的建立

在5.0ml比色管中分别加入无水乙醇1.50ml，1.21×10^-3mol·l^-1pan溶液0.40ml，不同体积浓度为8.90×10^-5mol·l^-1的cd(ⅱ)，1.00×10^-4mol·l^-1荧光素(fr)0.50ml，ph9.75氨水-氯化铵缓冲液0.70ml，加蒸馏水至刻度，摇匀。按实验操作步骤测定fr荧光强度，绘制标准曲线，体系的检测线性范围为7.81×10^-7～2.14×10^-5mol·l^-1，线性回归方程为δf＝123.63+170.65c(×10^-6mol·l^-1)，相关系数r＝0.9951，如图13所示。

2.4.2检出限和精密度

平行测定11次空白管，根据11管的测定结果计算出空白溶液的标准偏差，按照cl＝3sb/k公式(sb和k分别表示空白溶液的标准偏差和标准曲线的斜率)计算出cd(ⅱ)的检出限为2.34×10^-7mol·l^-1。

分别取低中高三种不同浓度的cd(ⅱ)标准管，cd(ⅱ)的浓度分别为：1.78×10^-6mol·l^-1、8.90×10^-6mol·l^-1、1.78×10^-5mol·l^-1的cd(ⅱ)标准溶液进行11次平行测定。根据低、中、高三种不同浓度的标准管测定结果，求得相对标准偏差分别为0.79％、2.20％、3.01％。根据实验结果的计算，证明此方法具有比较好的精密度。

3实际样品分析及加标回收率测定

3.1水样的处理

用采样瓶分别采集实验室自来水、南华大学的池塘水、湘江水并盛装在用蒸馏水洗干净的聚乙烯瓶中，分别过滤两次并置于烧杯中，放在电炉上加热煮沸，保持沸10min后取下，放置使其自然冷却、沉淀。用0.22μm滤头过滤，待测。

3.2样品分析结果

由于水样中镉含量太少，本发明方法未检出，故检测加标样品。分别移取经前处理过的水样1.00ml于5.0ml比色管中，加入0.50ml8.9×10^-5mol·l^-1标准溶液，按本发明建立的实验方法和石墨炉原子吸收法同时测定加标样品，如表5所示。

表5样品测定结果

注：t0.05,5＝2.015，样品测定值与国家相关标准进行比较，均在正常范围内。

用两种方法对样品同时进行测定，t值如表5所示，t<t0.05,5＝2.015，经假设检验无统计学意义，尚不认为这两种方法存在差异。说明新建立的荧光猝灭法测镉与石墨炉原子吸收法测镉相比，结果一致。

在ph9.75的氨水-氯化铵缓冲液中，pan能与fr发生能量转移，使fr发生荧光猝灭，当体系中加入cd(ⅱ)后能使fr的猝灭程度增强。在一定的cd(ⅱ)浓度范围内，δf与cd(ⅱ)的浓度呈现良好的线性，据此建立新型的荧光猝灭法，来进行环境水样中cd(ⅱ)的测定。方法的相关系数r＝0.9951，线性范围为7.81×10^-7～2.14×10^-5mol·l^-1，线性回归方程为δf＝123.63+170.65c(×10^-6mol·l^-1)，检出限为2.34×10^-7mol·l^-1，相对标准偏差0.18％，平均加标回收率为100.9％。该方法操作简单、灵敏快捷、经济实用，可用于实际检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。