一种测定留兰香油中左旋香芹酮和右旋香芹酮的HPLC方法与流程

本发明属于食品分析领域，涉及食品中手性成分的分离检测，具体涉及一种测定留兰香油中左旋香芹酮和右旋香芹酮的hplc方法。

背景技术：

手性香料是一类重要的化合物，不同对映体香料可能显示出不同的香气特征、香气强度和生物活性。香芹酮含有一个手性碳原子，是经美国fda、欧洲理事会与食品香料专家委员会和中国卫生部批准的食品用手性香料。香芹酮对映体的香气有显著差异，右旋香芹酮具有芫荽的香味，而左旋香芹酮则有留兰香的香味。

留兰香油为无色至淡黄绿色澄清油状液体，具有留兰香叶的特殊香气，有甜味，能使食品产生特殊风味。可用作牙膏、香皂、口香糖等添加剂，此外，亦可用于化妆品和医药。但主要用途是用于生产香芹酮。留兰香油的化学成分比较复杂。我国轻工部香料工业科学研究所于1978年对国产留兰香油的成分进行了分析，结果表明，由于品种不同，精油中成分及含量有所不同，主要成分是左旋香芹酮，约占50％-70％，留兰香油的香气及品质与香芹酮有关，左旋香芹酮和右旋香芹酮的比例对留兰香油的香味具有重要贡献。

因此，通过检测留兰香油中左旋香芹酮和右旋香芹酮的比例可以定量控制其香气及品质。

留兰香油的精制及其香芹酮含量的测定(文献1，河南化工，1995年)、留兰香油中香芹酮的定量分析(文献2，大连轻工业学院学报，1999年)均采用的是理化检测法，无法测定左旋香芹酮和右旋香芹酮各自的含量和比例。手性香料香芹酮和乙酸苏合香酯的液相色谱拆分及其对映体纯度测定(文献3，厦门大学学报，2015年)提供了一种基于手性色谱柱的液相分析方法用于分离分析左旋香芹酮和右旋香芹酮。但是，本领域技术人员知道，手性色谱柱价格昂贵，且柱效易损失，不适合用于分析成分复杂的留兰香油。

为此，申请人试图开发一种基于普通色谱柱的液相分析方法用于分离分析留兰香油中的左旋香芹酮和右旋香芹酮。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种测定留兰香油中左旋香芹酮和右旋香芹酮的hplc方法，基于普通色谱柱分离分析留兰香油中的左旋香芹酮和右旋香芹酮。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种测定留兰香油中左旋香芹酮和右旋香芹酮的hplc方法，固定相为十八烷基键合硅胶，流动相为乙腈水溶液，该乙腈水溶液中含有有效浓度的吗啡啉类酸性离子液体，吗啡啉类酸性离子液体的阳离子化学结构如下所示：

优选地，吗啡啉类酸性离子液体为所述阳离子的硫酸氢盐，为4-甲基吗啡啉硫酸氢盐、吗啡啉硫酸氢盐、4-(3-磺丙基)吗啡啉硫酸氢盐。

优选地，所述乙腈水溶液组成的流动相中，乙腈的体积百分浓度为30-60％。

优选地，所述吗啡啉类酸性离子液体在乙腈水溶液中的摩尔浓度为2-4mm。

优选地，所述的hplc方法色谱参数如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填料的色谱柱；

流动相a相：30％乙腈水溶液，含吗啡啉类酸性离子液体3mm；

流动相b相：60％乙腈水溶液，含吗啡啉类酸性离子液体3mm；

洗脱程序：0-3min，0％b相；3-5min，0％→40％b相；5-15min，40％b相；15-17min，40％→100％b相；17-25min，100％b相；流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：43-47℃；

检测波长：228-232nm。

优选地，流速为1.0ml/min。

优选地，柱温为45℃。

优选地，检测波长为230nm。

优选地，所述色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，规格为4.6mm×250mm(5μm)。

优选地，所述色谱柱优选博纳艾杰尔innovalasbc18耐酸性色谱柱。

本发明的优点：

本发明提供的hplc方法可以有效分离左旋香芹酮和右旋香芹酮，应用于留兰香油中左旋香芹酮和右旋香芹酮测定时，左旋香芹酮和右旋香芹酮达到基线分离，且不受其它杂质峰的干扰，灵敏度高，线性范围宽，可以用于留兰香油的品质控制。

附图说明

图1为左旋香芹酮和右旋香芹酮的化学结构式；

图2为分别含有4-甲基吗啡啉硫酸氢盐(a)、吗啡啉硫酸氢盐(b)、4-(3-磺丙基)吗啡啉硫酸氢盐(c)的流动相对左旋香芹酮和右旋香芹酮混合标准品溶液的分离效果图，均达到基线分离；d为不添加吗啡啉类酸性离子液体的分离效果图；

图3为含有4-甲基吗啡啉硫酸氢盐的流动相对留兰香油供试品溶液的分离效果图。

具体实施方式

下面结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

一、实验材料

万分之一电子天平(赛多利斯)；

lc-20a高效液相色谱仪(岛津)；

innovalasbc18耐酸性色谱柱(博纳艾杰尔)；

左旋香芹酮和右旋香芹酮标准品自制(纯度98％)，化学结构式如图1所示；

留兰香油购于南京文森宝国际贸易有限公司(香芹酮含量≥65％)；

乙腈为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯，流动相用前经0.22μm滤膜抽滤。

二、实验方法和实验结果

1、溶液配制

稀释溶剂：30％乙腈水溶液，含吗啡啉类酸性离子液体3mm(为4-甲基吗啡啉硫酸氢盐或吗啡啉硫酸氢盐或4-(3-磺丙基)吗啡啉硫酸氢盐，与流动相保持一致)。

标准品溶液：分别精密称取左旋香芹酮和右旋香芹酮标准品用稀释溶剂溶解定容，配制成浓度约为0.5mg/ml的左旋香芹酮、右旋香芹酮标准品溶液。

混合标准品溶液：取适量左旋香芹酮标准品溶液、右旋香芹酮标准品溶液等体积混合，得浓度各约0.25mg/ml的混合标准品溶液。

供试品溶液：精密称取留兰香油适量，置于容量瓶中，用稀释溶剂溶解并定容，摇匀，配制成浓度为0.5mg/ml的供试品溶液。

2、色谱条件

色谱柱：innovalasbc18耐酸性色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；

流动相a相：30％乙腈水溶液，含吗啡啉类酸性离子液体3mm(为4-甲基吗啡啉硫酸氢盐或吗啡啉硫酸氢盐或4-(3-磺丙基)吗啡啉硫酸氢盐)；

流动相b相：60％乙腈水溶液，含吗啡啉类酸性离子液体3mm(同流动相a相)；

洗脱程序：0-3min，0％b相；3-5min，0％→40％b相；5-15min，40％b相；15-17min，40％→100％b相；17-25min，100％b相；流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：45℃；

检测波长：230nm

进样量：20μl。

3、系统适用性试验

分别精密量取标准品溶液和混合标准品溶液，进样测定，记录色谱图，从图2所示的标准品溶液色谱图可以看出，左旋香芹酮先出峰，右旋香芹酮后出峰，理论板数均大于10000，分离度为1.65，拖尾因子均小于1.15，空白溶剂不干扰测定。图2为分别含有4-甲基吗啡啉硫酸氢盐(a)、吗啡啉硫酸氢盐(b)、4-(3-磺丙基)吗啡啉硫酸氢盐(c)的流动相对左旋香芹酮和右旋香芹酮混合标准品溶液的分离效果图，均达到基线分离；d为不添加吗啡啉类酸性离子液体的分离效果图。各色谱图仅离子液体类型(或不添加)不同，其他参数一致。

4、线性关系考察

分别精密称取左旋香芹酮和右旋香芹酮标准品适量，用流动相分别溶解并稀释，制成0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml的系列浓度溶液，进样测定。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程。结果左旋香芹酮和右旋香芹酮在上述浓度范围内线性关系良好，r²＞0.9999。

5、灵敏度考察

精密称取左旋香芹酮和右旋香芹酮标准品各适量，加稀释溶剂溶解并稀释至色谱峰峰高约为基线噪音的3倍。结果最低检出限均约为(5-10)×10^-3μg，灵敏度高。

6、加样回收率试验

按常规方法配制回收率测定溶液，计算左旋香芹酮和右旋香芹酮的回收率，结果证明在供试品溶液浓度的50％、100％、150％水平范围内，左旋香芹酮和右旋香芹酮的回收率均在98-102％之间，回收率高，且rsd＜1％(n＝3)。

7、精密度和稳定性试验

取上述混合标准品溶液和供试品溶液，分别连续进样6次，记录色谱图。结果rsd均小于2.0％(n＝6)，表明本方法精密度良好。

分别取上述混合标准品溶液和供试品溶液，于室温放置，分别于0、4、8、12、24h进样测定，记录色谱图。结果表明，左旋香芹酮和右旋香芹酮的峰面积在24h内的rsd均小于2.0％(n＝5)，表明混合混合标准品溶液和供试品溶液室温放置24h稳定。

8、供试品溶液中左旋香芹酮和右旋香芹酮的测定(流动相含4-甲基吗啡啉硫酸氢盐)

取左旋香芹酮和右旋香芹酮标准品、留兰香油适量，按上述方法制备混合标准品溶液和供试品溶液，分别进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与混合标准品溶液色谱图中保留时间相同的色谱峰，按外标法以峰面积计算左旋香芹酮和右旋香芹酮的含量。供试品溶液色谱图如图3所示。左旋香芹酮和右旋香芹酮在三批留兰香油中的含量分别为(53.5％，18.6％)、(54.3％，18.5％)、(53.8％，18.5％)。

申请人用hplc-dad进一步分析了上述留兰香油的供试品溶液，使用dad峰纯度鉴定方法鉴定供试品溶液色谱图中左旋香芹酮和右旋香芹酮色谱峰的纯度，结果表明，左旋香芹酮和右旋香芹酮色谱峰的纯度均在阈值以上，表明该色谱条件下左旋香芹酮和右旋香芹酮的分离分析不受留兰香油中其它成分的干扰。

本发明提供的hplc方法可以有效分离左旋香芹酮和右旋香芹酮，应用于留兰香油中左旋香芹酮和右旋香芹酮测定时，左旋香芹酮和右旋香芹酮达到基线分离，且不受其它杂质峰的干扰，灵敏度高，线性范围宽，可以用于留兰香油的品质控制。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。