一种氧化三甲胺定量检测试剂盒及方法与流程

本发明涉及一种物质含量检测技术领域，特别是涉及一种氧化三甲胺定量检测试剂盒及方法。

背景技术：

氧化三甲胺(trimetlylamineoxide，tmao)在血浆中的定量检测方法具有重要的临床价值。目前，氧化三甲胺的定量检测的很多方法都是用于检测水产品中的氧化三甲胺浓度，其多为简单的色谱法，灵敏度和准确度有限。而检测血浆、血清等生物样本中的tmao浓度，液质联用技术(hplc-ms，液相色谱-质谱联用技术)是目前最常用的方法。几乎所有人血浆中都含tmao，因此在方法学验证时空白生物基质的获取成为难点，很多方法采用水、牛血清白蛋白液、磷酸盐缓冲液等空白生物基质，由于这些空白生物基质与待测样本基质成分相差较远，这导致其方法学验证说服力不高，得到的检测结果可靠性不佳。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种能够提高检测结果的可靠性的氧化三甲胺定量检测试剂盒及方法。

一种氧化三甲胺定量检测试剂盒，包括系列氧化三甲胺标准液、内标物及沉淀剂；所述系列氧化三甲胺标准液的溶质为氧化三甲胺，溶剂为人血清白蛋白水溶液。

上述氧化三甲胺定量检测试剂盒，系列氧化三甲胺标准液采用人血清白蛋白水溶液为基质，如此避免采用水、牛血清白蛋白液或磷酸盐缓冲液等与人体血浆的成分相差较远的空白生物基质导致得到的检测结果不可靠的问题，进而有利于提高检测结果的可靠性。而且采用内标物的内标法，通过沉淀剂沉淀，有利于进一步提高检测结果的可靠性。

在其中一个实施例中，所述系列氧化三甲胺标准液的浓度范围为2～500ng/ml。

在其中一个实施例中，所述内标物为氘代氧化三甲胺，所述沉淀剂为乙腈。

在其中一个实施例中，所述人血清白蛋白水溶液中人血清白蛋白的质量与水的体积比为(3～10)kg:100l。

一种氧化三甲胺定量检测方法，使用上述氧化三甲胺定量检测试剂盒，包括以下步骤：

步骤(1)、在人血清白蛋白水溶液中加入氧化三甲胺配制具有浓度梯度的系列氧化三甲胺标准液；

步骤(2)、将所述系列氧化三甲胺标准液加入内标物及沉淀剂离心得上清液，分别进行液相色谱和质谱分析，得到各氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的色谱峰面积与所述内标物的色谱峰面积的比值，并得到所述比值与所述氧化三甲胺标准液的氧化三甲胺浓度之间的关系；

步骤(3)、将待测血浆样本加入所述内标物及所述沉淀剂离心得上清液，进行液相色谱和质谱分析，得到所述待测血浆样本中氧化三甲胺的色谱峰面积与所述内标物的色谱峰面积的比值，并根据步骤(2)得到的所述比值与所述氧化三甲胺标准液的氧化三甲胺浓度之间的关系，得到所述待测血浆样本中氧化三甲胺的浓度。

上述氧化三甲胺定量检测方法，采用人血清白蛋白水溶液为基质，如此避免采用水、牛血清白蛋白液或磷酸盐缓冲液等与人体血浆的成分相差较远的空白生物基质导致得到的检测结果不可靠的问题，进而有利于提高检测结果的可靠性。而且采用内标法，得到所述比值与所述氧化三甲胺标准液的氧化三甲胺浓度之间的关系，有利于进一步提高检测结果的可靠性。此外对待测血浆样本加入内标物及沉淀剂离心预处理后，通过一次液相色谱和质谱分析及步骤(2)得到的所述比值与所述氧化三甲胺标准液的氧化三甲胺浓度之间的关系，可以快速得到待测血浆样本的氧化三甲胺的浓度，避免了使用长柱或液相条件复杂导致方法检测的样本分析时间长，不能满足临床大样本量快速检测的要求的问题，为血浆样本中tmao浓度的定量提供了一种快速、准确的高灵敏度检测方法。

在其中一个实施例中，所述步骤(1)包括以下步骤：将氧化三甲胺溶于甲醇水溶液配制具有浓度梯度的系列氧化三甲胺工作液；及

将所述系列氧化三甲胺工作液分别采用人血清白蛋白水溶液为基质配制成所述系列氧化三甲胺标准液。

在其中一个实施例中，所述系列氧化三甲胺工作液的浓度范围为40～10000ng/ml。

在其中一个实施例中，还包括根据步骤(2)得到的所述比值与所述氧化三甲胺标准液的氧化三甲胺浓度之间的关系绘制标准回归曲线并对所述标准回归曲线进行自校的步骤：

将步骤(2)得到的各所述比值代入所述标准回归曲线的方程，得到各氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的浓度测试值；及

判断所述各氧化三甲胺标准液是否为校正标准液，并根据所述校正标准液的各所述比值与其浓度，得到自校后的所述标准回归曲线，其中所述校正标准液的数量不小于6个；

其中，所述判断各氧化三甲胺标准液是否为校正标准液具体包括：若所述系列氧化三甲胺标准液中最低浓度的氧化三甲胺标准液的浓度测试值与所述最低浓度的比值为80％～120％，则所述最低浓度的氧化三甲胺标准液为校正标准液；或若除最低浓度的氧化三甲胺标准液之外的其他氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的浓度测试值与其浓度的比值为85％～115％，则该氧化三甲胺标准液为校正标准液；

相应地，步骤(3)根据自校后的所述标准回归曲线的方程得到所述待测血浆样本中氧化三甲胺的浓度。

在其中一个实施例中，在所述步骤(2)之前还包括所述系列氧化三甲胺标准液的系统适用性测试步骤：

向所述系列氧化三甲胺标准液中最低浓度的氧化三甲胺标准液加入内标物及沉淀剂离心得上清液，平行进行多次液相色谱和质谱分析，分别得到多个所述最低浓度的氧化三甲胺标准液的所述氧化三甲胺的色谱峰面积与所述内标物的色谱峰面积的比值；

若多个所述最低浓度的氧化三甲胺标准液的氧化三甲胺的色谱峰面积与所述内标物的色谱峰面积的比值的变异系数小于预设值，则所述步骤(1)中的所述系列氧化三甲胺标准液的浓度范围能适用于所述液相色谱和质谱分析的系统。

在其中一个实施例中，所述液相色谱和质谱分析中色谱分析采用的流动相为乙酸铵水溶液及甲酸的乙腈溶液，所述色谱柱为c18色谱柱，所述流动相的流速为0.2～0.8ml/min，所述色谱柱的柱温为25～35℃；所述液相色谱和质谱分析中质谱分析的条件为采用电喷雾离子源于正离子mrm模式检测。

附图说明

图1为实施例1得到的氧化三甲胺标准液的标准回归曲线；

图2为待测血浆样本中氧化三甲胺的色谱图与内标物氘代氧化三甲胺的色谱图；

图3为系列氧化三甲胺标准液的系统适用性测试步骤得到的其中一个氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的色谱图与内标物的色谱图；

图4为空白人血清白蛋白水溶液e中氧化三甲胺的色谱图与内标物氘代氧化三甲胺的色谱图；

图5为空白人血清白蛋白水溶液f中氧化三甲胺的色谱图与内标物氘代氧化三甲胺的色谱图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施方式的氧化三甲胺定量检测试剂盒(未图示)，包括系列氧化三甲胺标准液、内标物及沉淀剂。系列氧化三甲胺标准液的溶质为氧化三甲胺，溶剂为人血清白蛋白水溶液。

在其中一个实施例中，系列氧化三甲胺标准液的浓度范围为2～500ng/ml。

在其中一个实施例中，内标物为氘代氧化三甲胺，沉淀剂为乙腈。

在其中一个实施例中，人血清白蛋白水溶液中人血清白蛋白的质量与水的体积比为(3～10)kg:100l。

上述氧化三甲胺定量检测试剂盒，系列氧化三甲胺标准液采用人血清白蛋白水溶液为基质，如此避免采用水、牛血清白蛋白液或磷酸盐缓冲液等与人体血浆的成分相差较远的空白生物基质导致得到的检测结果不可靠的问题，进而有利于提高检测结果的可靠性。而且采用内标物的内标法，通过沉淀剂沉淀，有利于进一步提高检测结果的可靠性。

本发明一实施方式的氧化三甲胺定量检测方法，使用上述氧化三甲胺定量检测试剂盒，包括以下步骤(1)～(3)。

步骤(1)：在人血清白蛋白水溶液中加入氧化三甲胺配制具有浓度梯度的系列氧化三甲胺标准液。

采用人血清白蛋白水溶液为基质，如此避免采用水、牛血清白蛋白液或磷酸盐缓冲液等与人体血浆的成分相差较远的空白生物基质导致得到的检测结果不可靠的问题，进而有利于提高检测结果的可靠性。

优选地，人血清白蛋白水溶液中人血清白蛋白的质量与水的体积比为(3～10)kg:100l。如此控制人血清白蛋白水溶液中人血清白蛋白的含量也接近，以使其接近人体血浆的成分含量，进一步提高检测结果的可靠性。

优选地，系列氧化三甲胺标准液的数量不少于6个。更优选地，系列氧化三甲胺标准液的数量为7～10个。

在其中一个实施例中，人血清白蛋白水溶液由人血清白蛋白晶体与水混匀即得。进一步地，将150～500mg人血清白蛋白晶体加入5ml水混匀即得。更进一步地，人血清白蛋白由solarbio提供，批号为：730a0521，纯度为96％～99％。更进一步地，人血清白蛋白水溶液置于-20℃保存。

在其中一个实施例中，步骤(1)包括以下步骤：将氧化三甲胺溶于甲醇水溶液配制具有浓度梯度的系列氧化三甲胺工作液；将系列氧化三甲胺工作液分别采用人血清白蛋白水溶液为基质配制成系列氧化三甲胺标准液。

先配制具有浓度梯度的系列氧化三甲胺工作液，再采用人血清白蛋白水溶液为基质配制成系列氧化三甲胺标准液，不仅有利于得到稳定的系列氧化三甲胺工作液，而且还有利于配置得到浓度较低且较准确的系列氧化三甲胺标准液。

进一步地，甲醇水溶液中甲醇的体积百分比为30～60％。优选地，甲醇水溶液中甲醇的体积百分比为50％。

进一步地，系列氧化三甲胺工作液的浓度范围为40～10000ng/ml。更进一步地，系列氧化三甲胺工作液的浓度从低到高依次为40、100、200、400、1000、2000、4000及10000ng/ml。

优选地，将氧化三甲胺溶于甲醇水溶液配制具有浓度梯度的系列氧化三甲胺工作液，采用高浓度依次稀释，得到低浓度的方式配置。如此不仅保证了溶液的统一性，而且减小了在后续配置低浓度的氧化三甲胺工作液时需要稀释的倍数，有利于提高系列氧化三甲胺工作液的浓度的准确性。

具体在一实施例中，首先将氧化三甲胺溶于甲醇水溶液配制1mg/ml的氧化三甲胺原液，稀释100倍得到10000ng/ml的氧化三甲胺工作液。10000ng/ml的氧化三甲胺工作液稀释2.5倍得到4000ng/ml的氧化三甲胺工作液。依此类推。

优选的，系列氧化三甲胺工作液分别配制成系列氧化三甲胺标准液时所稀释的倍数相同。进一步地，系列氧化三甲胺工作液分别配制成系列氧化三甲胺标准液时所稀释的倍数为20倍。

进一步地，系列氧化三甲胺标准液的浓度范围为2～500ng/ml。更进一步地，系列氧化三甲胺标准液的浓度从低到高依次为2、5、10、20、50、100、200及500ng/ml。如此采用本方法可检测的氧化三甲胺的浓度的下限值可达到2ng/ml，上限值可到达500ng/ml，因此该方法的检测范围广，实用性强。

步骤(2)：将系列氧化三甲胺标准液加入内标物及沉淀剂离心得上清液，分别进行液相色谱和质谱分析，得到各氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，并得到比值与氧化三甲胺标准液的氧化三甲胺浓度之间的关系。

在其中一个实施例中，还包括根据步骤(2)得到的比值与氧化三甲胺标准液的氧化三甲胺浓度之间的关系绘制标准回归曲线的步骤。标准回归曲线的方程为：y＝ax+b。

其中a为标准回归曲线的斜率，b为标准回归曲线的截距，y为氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，x为氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的浓度，单位为ng/ml。

如此采用内标法，并采用氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值为y值进行线性回归，得到标准回归曲线，有利于进一步提高检测结果的可靠性。

具体地，步骤(2)中离心步骤采用涡旋后离心。

优选地，标准回归曲线的方程的相关系数不小于0.99。

在其中一个实施例中，还包括对标准回归曲线进行自校的步骤：将步骤(2)得到的各比值代入标准回归曲线的方程，得到各氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的测试值；判断各氧化三甲胺标准液是否为校正标准液，并根据校正标准液的各比值与其浓度，得到自校后的标准回归曲线，其中校正标准液的数量不小于6个。

其中，判断各氧化三甲胺标准液是否为校正标准液具体包括：若系列氧化三甲胺标准液中最低浓度的氧化三甲胺标准液的浓度测试值与最低浓度的比值为80％～120％，则最低浓度的氧化三甲胺标准液为校正标准液；或若除最低浓度的氧化三甲胺标准液之外的其他氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的浓度测试值与其浓度的比值为85％～115％，则该氧化三甲胺标准液为校正标准液。

可以理解，不符合校正标准液的氧化三甲胺标准液，则为不可校正标准液；进而将该不可校正标准液剔除，根据校正标准液的各比值与对应的氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的浓度，重新得到自校后的标准回归曲线。相应地，步骤(3)根据自校后的标准回归曲线的方程得到待测血浆样本中氧化三甲胺的浓度。若该系列氧化三甲胺标准液不存在不可校正标准液，则自校后的标准回归曲线即为原标准回归曲线。

在其中一个实施例中，若剔除不可校正标准液后，校正标准液的数量小于6个，则需要重新进行步骤(1)，以保证系列氧化三甲胺标准液的统一性。

在其中一个实施例中，在步骤(2)之前还包括系列氧化三甲胺标准液的系统适用性测试步骤：

向系列氧化三甲胺标准液中最低浓度的氧化三甲胺标准液加入内标物及沉淀剂离心得上清液，平行进行多次液相色谱和质谱分析，分别得到多个最低浓度的氧化三甲胺标准液的氧化三甲胺的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值；

若多个最低浓度的氧化三甲胺标准液的氧化三甲胺的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值的变异系数小于预设值，则步骤(1)中的系列氧化三甲胺标准液的浓度范围能适用于液相色谱和质谱分析的系统。

通过对系列氧化三甲胺标准液中最低浓度的氧化三甲胺标准液进行多次液相色谱和质谱分析，判断该最低浓度的氧化三甲胺标准液与该液相色谱和质谱分析的系统的适用性。如果该最低浓度的氧化三甲胺标准液与该液相色谱和质谱分析的系统的适用性好，则说明步骤(1)中的系列氧化三甲胺标准液均适用于液相色谱和质谱分析的系统。这是因为浓度越低的氧化三甲胺标准液的变异系数越大，因此通过最低浓度的氧化三甲胺标准液的变异系数即可确定该系列氧化三甲胺标准液与该液相色谱和质谱分析的系统的适用性。

进一步地，变异系数的计算公式为：变异系数＝(标准偏差/平均值)×100％。

进一步地，该预设值为10％。

优选地，平行进行液相色谱和质谱分析的次数为6次，得到的该氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值的数量为6个。

在其中一个实施例中，当系列氧化三甲胺标准液的浓度范围确定时，将步骤(1)和步骤(2)平行进行多次，分别得到多个标准回归曲线。进一步地，步骤(1)和步骤(2)平行进行的次数为三次，分别得到三个标准回归曲线。

步骤(3)：将待测血浆样本加入内标物及沉淀剂离心得上清液，进行液相色谱和质谱分析，得到待测血浆样本中氧化三甲胺的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，并根据步骤(2)得到的所述比值与所述氧化三甲胺标准液的氧化三甲胺浓度之间的关系，得到待测血浆样本中氧化三甲胺的浓度。

如此对待测血浆样本加入内标物及沉淀剂离心预处理后得上清液，通过一次液相色谱和质谱分析及步骤(2)得到所述比值与所述氧化三甲胺标准液的氧化三甲胺浓度之间的关系，可以快速得到待测血浆样本的氧化三甲胺的浓度，避免了使用长柱或液相条件复杂导致方法检测的样本分析时间长，不能满足临床大样本量快速检测的要求的问题，为血浆样本中tmao浓度的定量提供了一种快速、准确的高灵敏度检测方法。

采用加标回收率的形式进行了方法学验证检测结果的准确度和精密度，说明上述氧化三甲胺定量检测方法提高了检测结果的准确度和精密度高。而且步骤(1)和步骤(2)步骤简单、耗时短，步骤(3)每个待测血浆样本的进样分析时间为1.5min，每个待测血浆样本的测试总过程可在30分钟内完成，大大缩短了分析检测时间，进而满足大批量样本的快速检测的要求。

此外，通过方法学验证，采用上述氧化三甲胺定量检测方法，氧化三甲胺的含量的检测下限达到2ng/ml，检测结果的可靠性和准确度高，能够满足低浓度临床血浆样本的检测需要。

更进一步地，步骤(2)和步骤(3)中，内标物为氘代氧化三甲胺，d9-tmao。优选地，内标物以其甲醇水溶液的形式加入。具体地，该内标物的甲醇水溶液中的甲醇水溶液，其甲醇的体积百分比为30～60％。优选地，甲醇水溶液中甲醇的体积百分比为50％。具体在一实施例中，内标物的甲醇水溶液中的内标物的浓度为21ng/ml。

在其中一个实施例中，沉淀剂为乙腈。优选地，沉淀剂的体积与氧化三甲胺标准液的体积比，或沉淀剂的体积与待测血浆样本的体积比均为2～5：1。更优选地，沉淀剂的体积与氧化三甲胺标准液的体积比，或沉淀剂的体积与待测血浆样本的体积比均为2.5：1。

具体在一实施例中，氧化三甲胺标准液和待测血浆样本每次进样3μl。

优选地，加入沉淀剂采用振荡和离心处理，得到上清液。更优选地，振荡的时间为10～20s，离心的速度为8000～13000rpm。具体地，步骤(3)中离心步骤采用涡旋后离心。

在其中一个实施例中，液相色谱和质谱分析中色谱分析采用的流动相为乙酸铵水溶液及甲酸的乙腈溶液，色谱柱为c18色谱柱，流动相的流速为0.2～0.8ml/min，色谱柱的柱温为25～35℃。在其中一个实施例中，液相色谱和质谱分析中质谱分析的条件为采用电喷雾离子源于正离子mrm模式检测。

优选地，乙酸铵水溶液与甲酸的乙腈溶液的体积比为20％～40％:80～60％。更优选地，乙酸铵水溶液的浓度为10mmol/l，甲酸的乙腈溶液的体积百分比为0.1％。

以下为具体实施例。

实施例1

1)仪器与设备

waterstq-d质谱系统；watersuplci-class液相系统；watersunifi软件；thermofisherthermost16r型高速冷冻离心机(赛默飞，美国)；xw-80a涡旋混合器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；移液器(gilson)。

2)试药与材料

氧化三甲胺：东京化成工业株式会社，纯度99.5％，批号：3evjg-mc；氘代氧化三甲胺：torontoresearchchemicals，纯度98％，批号：3-lxm-155-1；乙酸铵：分析纯，国药，批号：20160310；乙腈：gradientgradeforliquidchromatography，merck；甲酸：lc级，acs；人血清白蛋白：纯度96％-99％，solarbio，批号：730a0521；

3)液相色谱和质谱分析条件

色谱条件

色谱柱：acquitybehc18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：10mm乙酸铵水溶液∶体积百分比0.1％甲酸的乙腈溶液＝80:20(v/v)；流速0.2ml/min；柱温30℃；进样室温度：10℃；进样量3μl；洗针液：80％甲醇水。

质谱条件

采用电喷雾离子源(esi)，正离子mrm模式检测；氧化三甲胺：监测离子m/z75.99→m/z58.6；锥孔电压：18v，碰撞能：12ev；氧化三甲胺-d9：监测离子m/z85.1→m/z68，锥孔电压：18v，碰撞能：13ev；毛细管电压：0.5kv；锥孔气流：60l/h；去溶剂气流：1000l/h；离子源温度：150℃；去溶剂温度：500℃。

4)溶液配制

配置氧化三甲胺储备液i：精密称取氧化三甲胺晶体10.05mg，经纯度因子校正计算后得氧化三甲胺重量为：10mg。用体积百分比为50％的甲醇水定容至10ml容量瓶，得到1mg/ml的氧化三甲胺储备液，置于-20℃冰箱保存。

配置氧化三甲胺储备液ii：精密称取氧化三甲胺晶体10.05mg，经纯度因子校正计算后得氧化三甲胺重量为：10mg。用50％甲醇水定容至1l容量瓶，由此得出标准品浓度为0.01mg/ml，置于-20℃冰箱保存。

配置系列氧化三甲胺工作液：采用1mg/ml的氧化三甲胺储备液i稀释得到10000ng/ml的工作液8，采用工作液8稀释得到4000ng/ml的工作液7，依此类推，如表1所示，其中50％甲醇水为体积百分比为50％的甲醇水溶液。

表1

配置氘代氧化三甲胺储备液：精密称取氧化三甲胺-d9对照品粉末1mg，经纯度校正因子计算后得氧化三甲胺-d9标准品重量：1.06mg，标准品用50％甲醇水定容至25ml容量瓶，得到42μg/ml的氘代氧化三甲胺储备液，置于-20℃保存。

配置氘代氧化三甲胺储备液及乙腈的混合液：移取42μg/ml的氘代氧化三甲胺储备液80μl，加入160ml乙腈混匀，置于溶剂瓶中，超声5min后即可。

配置3～10％(人血清白蛋白的质量与水的体积比，kg/l)人血清白蛋白水溶液：使用千分之一天平称取150～500mg人血清白蛋白晶体加入5ml超纯水混匀即得，置于-20℃保存。

流动相配制：水相的配置：精密量取100ml去离子超纯水，加入0.385g乙酸铵，混匀后用0.22μm滤膜过滤，滤液再加400ml超纯水混匀超声5min即可。有机相的配置：精密量取200ml乙腈，加入200μl甲酸，混匀即可。

配制系列氧化三甲胺标准液：精密移取系列氧化三甲胺工作液1～8各5μl，加入95μl的10％人血清白蛋白水溶液，混匀，得到浓度依次为2、5、10、20、50、100、200及500ng/ml的系列氧化三甲胺标准液。

5)氧化三甲胺标准液或待测血浆样本的进样前处理及进样分析

进样前处理：分别精密移取浓度依次为2、5、10、20、50、100、200及500ng/ml的系列氧化三甲胺标准液或待测血浆样本100μl，加入250μl氘代氧化三甲胺储备液及乙腈的混合液，振荡10s，13000rpm离心5min，取上清液100μl，分别进样3μl到液相色谱和质谱分析系统进行分析。

系列氧化三甲胺标准液进样分析：得到各氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的色谱峰面积与所述内标物的色谱峰面积的比值；并得到所述比值与所述氧化三甲胺标准液的氧化三甲胺浓度之间的关系，并绘制标准回归曲线，如图1所示。

其中，标准回归曲线的方程为：y＝ax+b；a为标准回归曲线的斜率，b为标准回归曲线的截距，y为所述氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的色谱峰面积与所述内标物的色谱峰面积的比值，x为所述氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的浓度，单位为ng/ml。具体地，图1得到的标准回归曲线的方程为y＝0.00569x+0.00376，相关系数r²＝0.999471。

待测血浆样本进样分析：得到待测血浆样本中氧化三甲胺的色谱峰与内标物氘代氧化三甲胺的色谱峰分别如图2中a和b所示，且从中得到待测血浆样本中氧化三甲胺的色谱峰面积与所述内标物的色谱峰面积的比值为0.495。

根据标准回归曲线的方程y＝0.00569x+0.00376，得到待测血浆样本中氧化三甲胺的浓度为86.4ng/ml。

6)标准回归曲线的方程的自校步骤：

将各比值代入标准回归曲线的方程，得到各氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的测试值。比较2ng/ml的氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的测试值与2ng/ml的比值在80％～120％之内，比较除2ng/ml之外的其他氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的测试值与对应的氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的浓度的比值在85％～115％之内，则该系列氧化三甲胺标准液均为校正标准液，没有不可校正标准液，因此自校后的标准回归曲线即为原来的标准回归曲线，说明原来的标准回归曲线的准确度很高，得到的待测血浆样本中氧化三甲胺的浓度准确度高。

7)系列氧化三甲胺标准液的系统适用性测试步骤：

进样前处理：精密移取浓度为2ng/ml的氧化三甲胺标准液100μl，加入250μl氘代氧化三甲胺储备液及乙腈的混合液，振荡10s，13000rpm离心5min，取上清液100μl，分别进样3μl到液相色谱和质谱分析系统进行分析。重复进样6次，分别得到6个该氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值。并得到这6个比值的标准偏差和平均值，进而得到标准偏差与平均值的比值即变异系数小于10％。说明检测仪器在使用该方法检测氧化三甲胺时表现的很稳定。

其中，一个该氧化三甲胺标准液中氧化三甲胺的色谱峰与内标物的色谱峰，分别如图3的c和d所示，从中可以得知氧化三甲胺和内标物氘代氧化三甲胺的保留时间分别为0.537和0.534，氧化三甲胺的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值为31204/2057343＝0.015167。

8)方法验证学试验

基质干扰试验：另取2份10％人血清白蛋白水溶液，每份100μl。1份用乙腈沉淀，记为e。另1份用氘代氧化三甲胺储备液及乙腈的混合液沉淀，记为f。振荡10s，13000rpm离心5min，取上清液100μl，分别进样3μl到液相色谱和质谱分析系统进行分析。分别记录e和f两份空白人血清白蛋白水溶液的色谱图，用于评价空白10％人血清白蛋白水溶液的干扰情况；得到的色谱图分别如图4及图5所示。图4的e1和e2分别对应氧化三甲胺及氘代氧化三甲胺的色谱峰，图5的f1和f2分别对应氧化三甲胺及氘代氧化三甲胺的色谱峰。

从图4的e1和e2中可看出人血清白蛋白水溶液中均没有氧化三甲胺及氘代氧化三甲胺的保留时间的峰值。从图5的中f1和f2中可看出人血清白蛋白水溶液中只有氘代氧化三甲胺的保留时间的峰值，而没有氧化三甲胺的保留时间的峰值。因此说明e和f两份空白人血清白蛋白水溶液对氧化三甲胺的测试不存在干扰。

残留试验：分别精密移取500ng/ml的氧化三甲胺标准液、2ng/ml的氧化三甲胺标准液100μl，加入250μl氘代氧化三甲胺储备液及乙腈的混合液，振荡10s，13000rpm离心5min，取上清液100μl。同时处理1份10％人血清白蛋白水溶液空白样品150μl，加入250μl乙腈，振荡10s，13000rpm离心5min，取上清液100μl。按定量上限(500ng/ml)、空白样本、定量下限(2ng/ml)的顺序进样，考察仪器及色谱柱的残留情况。

残留试验结果说明，空白样品中的残留浓度低于定量下限的20％，且不超过氘代氧化三甲胺浓度的5％。符合残留可接受标准：定量上限样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20％，并且不超过内标的5％。

精密度与准确度验证试验：

采用氧化三甲胺储备液ii依次稀释分别得到8000ng/ml的高浓度氧化三甲胺溶液、800ng/ml的中浓度氧化三甲胺溶液及80ng/ml的高浓度氧化三甲胺溶液，如表2所示，其中50％甲醇水为体积百分比为50％的甲醇水溶液。

表2

将上述高、中、低浓度的氧化三甲胺溶液各取5μl，加入95μl的10％人血清白蛋白水溶液，混匀，得到浓度依次为400ng/ml、40ng/ml及4ng/ml的氧化三甲胺溶液。

根据标准回归曲线的方程y＝0.00569x+0.00376，相关系数r²＝0.999471得到氧化三甲胺浓度在2～4ng/ml的血浆样本。将该血样样本分为三组，分别加入400ng/ml、40ng/ml及4ng/ml的氧化三甲胺溶液作为加标试样得到加标后样本。每组平行6份，分别取100μl，加入250μl氘代氧化三甲胺储备液及乙腈的混合液，振荡10s，13000rpm离心5min，取上清液100μl，分别进样3μl到液相色谱和质谱分析系统进行分析。

根据标准回归曲线的方程y＝0.00569x+0.00376，得到加标后样本的测试浓度。根据加标后样本的测试浓度与加标后样本的标示浓度计算每组的变异系数和平均值，其中加标后样本的标示浓度为血浆样本的浓度与加标试样的浓度之和。其中变异系数为标准偏差与平均值的比值，其大小可表征精确度。平均值可表征准确度。试验结果显示，各组的变异系数未超过15％，各组的平均值在加标后样本的标示浓度的(100％±15％)范围内，符合标准，说明采用上述标准回归曲线的方程y＝0.00569x+0.00376及上述方法得到的待测血浆样本的测试浓度的准确度和精确度均很高。

8)稀释方法学试验

稀释10倍：

精密移取100μl人血浆样本，平行6份。精密移取同一份人血浆样本10μl加入10％人血清白蛋白水溶液90μl，混匀，得稀释10倍的人血浆样本，平行6份。将未稀释的人血浆样本及稀释10倍的人血浆样本分别加入250μl氘代氧化三甲胺储备液及乙腈的混合液，振荡10s，13000rpm离心5min，取上清液100μl，分别进样3μl到液相色谱和质谱分析系统进行分析。分别得到未稀释的人血浆样本及稀释10倍的人血浆样本的氧化三甲胺的色谱峰面积与氘代氧化三甲胺的色谱峰面积的比值。

根据上述标准回归曲线的方程y＝0.00569x+0.00376，计算得到未稀释的人血浆样本及稀释10倍的人血浆样本的测试浓度，进一步得到未稀释的人血浆样本的测试浓度平均值及稀释10倍的人血浆样本的测试浓度平均值。

将稀释10倍的人血浆样本的测试浓度平均值乘以稀释倍数与未稀释的人血浆样本的测试浓度平均值比较，试验结果表明，稀释10倍的人血浆样本的测试浓度平均值乘以稀释倍数在未稀释的人血浆样本的测试浓度平均值的(100％±15％)范围内，即符合稀释10倍的接受范围。

稀释20倍：

精密移取100μl人血浆样本，平行6份。精密移取同一份人血浆样本10μl加入10％人血清白蛋白水溶液190μl，混匀，得稀释20倍的人血浆样本，平行6份。将未稀释的人血浆样本及稀释10倍的人血浆样本分别加入250μl氘代氧化三甲胺储备液及乙腈的混合液，振荡10s，13000rpm离心5min，取上清液100μl，分别进样3μl到液相色谱和质谱分析系统进行分析。分别得到未稀释的人血浆样本及稀释20倍的人血浆样本的氧化三甲胺的色谱峰面积与氘代氧化三甲胺的色谱峰面积的比值。

根据上述标准回归曲线的方程y＝0.00569x+0.00376，计算得到未稀释的人血浆样本及稀释20倍的人血浆样本的测试浓度，进一步得到未稀释的人血浆样本的测试浓度平均值及稀释20倍的人血浆样本的测试浓度平均值。

将稀释20倍的人血浆样本的测试浓度平均值乘以稀释倍数与未稀释的人血浆样本的测试浓度平均值比较，试验结果表明，稀释20倍的人血浆样本的测试浓度平均值乘以稀释倍数在未稀释的人血浆样本的测试浓度平均值的(100％±15％)范围内，即符合稀释20倍的接受范围。

由此说明，待测血浆样本中氧化三甲胺的浓度采用人血清白蛋白液进行稀释，其浓度也具有按稀释倍数进行换算的可靠性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。