一种检测白酒中80种农药残留量的方法与流程

本发明属于农药残留分析检测
技术领域：
，尤其涉及一种运用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱同时测定白酒中80种农药残留量的方法。
背景技术：
：农药残留(pesticideresidues)，是农药使用后一个时期内没有被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水体、大气中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。粮食作物在种植的过程中不可避免的使用到除草剂、植物生长调节剂、杀虫剂、杀螨剂和杀菌剂等农药，这些农药最终可能残留在粮食中。白酒以高粱、小麦等淀粉质粮食为主要原料经发酵、蒸馏、勾兑、存储而成。含有农药的酿酒原料在蒸馏过程中，溶于酒精中的农药可能一起被蒸馏带出，最终残留于白酒中，对人身体健康有潜在的威胁。对食品中农药残留的控制，要求分析方法快速、准确、有效、灵敏度高、选择性好。显然，多种农药残留的分析方法可对不同种类、不同极性和不同化学性质的多种农药一次进样完全分析，缩短分析时间，提高检测效率。在多种农药残留分析中，使用最多的方法即色谱-质谱联用，包括用gc或lc进行分离，用质谱仪进行定性定量检测。白酒中农药残留检测多采用gc-ms或lc-ms方法，王蓉等运用lc-ms及gc-ms分别分析白酒中5种有机磷和8种有机氯农药，方法灵敏度高，但是前处理复杂，耗时长，而且每次检测农残种类较为单一。由于白酒是一种高乙醇含量的复杂饮料，其前处理多采用去除乙醇的基础上进一步净化或液液萃取法，导致样品前处理较为复杂，有机溶剂使用量较大。技术实现要素：鉴于国内外无针对白酒中多种农药残留限量标准、检测标准及现有白酒中多种农药残留技术的不足，本发明目的旨在于克服现有技术缺陷，简化样品前处理方法，缩短样品分析时间，从而提供一种一针进样，同时分析白酒中包含有机磷类、氨基甲酸酯类、除草剂类、杀菌剂类、杀虫剂类5个种类共计80种农药的超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定方法，该方法准确度高，重现性好，适用范围更广的多种农药残留同时检测。为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了如下检测白酒中多种农药残留的技术方案，该方案具体包括以下步骤：(1)、取样：如移取1.0ml白酒样品于2ml的刻度离心管中；(2)、氮吹：25℃以下氮吹至乙醇全部去除；(3)、定容：用质谱纯乙腈将氮吹好的样品定容到1.0ml；(4)、混匀：定容后的样品在漩涡振荡仪器上2000～6000rpm混匀2～5min；(5)、离心：混匀后的样品在4℃，6000～12000rpm，离心5～20min；作为优选的实施方式，10000rpm，离心10min；(6)、过滤：取离心上清液，用0.22μm针头式过滤头过滤，收集滤液于液相小瓶中；(7)、超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱分析。其中，步骤(7)中，液相条件为：色谱柱采用2.1×100mm，3.5μm的agilenteclipse-xdb-c18色谱柱，乙腈作为流动相a，5mm乙酸铵水溶液(含0.1％(v/v)甲酸)作为流动相b，进行梯度洗脱，其中柱温为30～35℃，流速为0.2～0.3ml/min，进样体积为5～10μl；优选柱温为30℃，流速为0.3ml/min，进样体积为10μl。作为优选的实施方式，梯度洗脱的条件为下表1：表1流动相线性洗脱条件时间/分钟a/％b/％0.020801.0208010.0851517.0100020.0100021.02080其中步骤(7)中，质谱条件为：带加热功能的电喷雾离子源(hesi)，鞘气：30arb；辅助气：10arb；反吹气：5arb；电离电压：3.5kv；离子传输管温度：280℃；离子源温度：150℃；正离子模式监测，采用fullms和targetms2同时扫描两种方式同时测定，扫描范围50～650m/z，fullms扫描的分辨率为35000，targetms2扫描模式分辨率为17500。此外，本发明的方法还包括标准曲线的制备，具体操作步骤如下：s1、标准储备液配制：农药按照有机磷类、氨基甲酸酯类、除草剂类、杀菌剂类、杀虫剂类区分，分别准确称取0.010g各种农药标准品，同类农药置于同一10.0ml容量瓶中，用丙酮溶解并定容，得到浓度为1000μg/ml的80种农药混合标准储备液；s2、混合标准溶液配制：将步骤(8)中5种农药混合标准储备液各吸取1.0ml置于10.0ml容量瓶中，乙腈定容，得到浓度为100μg/ml的80种农药标准混合储备液，然后用50％(v/v)乙腈水溶液逐级稀释，并最终配制成在5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml、200.0ng/ml的80种混合农药的标准工作溶液，标准工作溶液避光0～4℃保存，可使用3个月；s3、仪器测定：吸取配制好的不同浓度的混合标准工作溶液，过0.22μm滤膜后进入超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱进行测定；s4、农药残留计算：采用外标法进行农药目标物的定量分析，即以农药定量离子峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线。待测样品中进行超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱分析后，将测得检出农药定量离子峰面积，代入标准曲线，即可得到待测样品中农药的含量。在本发明中，所述的农药包含阿苯达唑、倍硫磷、倍硫磷砜、倍硫磷亚砜、苯并噻唑、苯霜灵、苯线磷、苯线磷砜、吡虫啉、吡氟禾草灵、丙硫磷、丙溴磷、残杀威、虫线磷、稻温灵、敌草胺、敌敌畏、地虫磷、定菌磷、啶虫脒、毒虫畏、毒死蜱、多菌灵、恶霜灵、恶唑菌酮、二嗪磷、丰索磷、伏杀硫磷、庚虫磷、谷硫磷、甲胺磷、甲拌磷、甲草胺、甲氟磷、甲基毒死蜱、甲基嘧啶磷、甲萘威、甲霜灵、腈菌唑、精喹禾灵、久效磷、抗蚜威、克百威、乐果、磷胺、螺虫乙酯、马拉硫磷、咪酰胺、嘧菌酯、灭虫威、灭虫威砜、灭多威、灭蚜磷、噻虫嗪、三唑醇、三唑磷、三唑酮、杀虫脲、杀虫畏、杀线威、双苯三唑醇、双苯酰草胺、速灭磷、特丁磷硫亚砜、特丁磷硫砜、涕灭威亚砜、烯酰吗啉、蚜灭磷、氧乐果、乙伴磷、乙伴磷砜、乙伴磷亚砜、乙基对硫磷、乙基谷硫磷、异丙甲草胺、异稻瘟净、异恶草酮、异菌脲、茚虫威和增效醚一种或多种，可同时检测80种或者更多中的农药残留。80种农药的定性、定量离子见实施例1中的表2。本发明方法的检出限为将不同浓度农药的基质配标工作溶液进入超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱进行检测，以3倍信噪比(s/n＝3)技术检测限(lod)，检测限在0.034ng/ml～0.089ng/ml之间。本发明方法的重复性和加标回收率：在空白样品中加入80种农药标准液，分别进行前处理后进入超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱进行检测分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见实施例中的表2。由表2可以看出，80种农药回收率在87.1％～116.1％之间，平均相对标准偏差(rsd)在1.3％～15.9％之间，表明本发明方法的回收率高，重复性好。需要说明的是，本发明采用两步除杂，第一步是冷冻离心除杂，第二步是过滤膜除杂。现有技术中，超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱一般仅采用过滤除杂，本发明还设置了冷冻离心除杂，不仅为了初步除去样品中的大颗粒杂质，而且还可以除去了样品中部分脂溶性物质及大分子物质，起到了对样品快速净化作用。且两步除杂不会损失待分析物质，因为除杂是在定容后进行。尤其突出的是，本发明可以同时测定80种或更多的农药残留，且最低检测限在0.034ng/ml～0.089ng/ml之间。现有的农药残留限量标准中，大部分农药限量均高于10ng/ml，本发明的检测限显着低于现有技术中农药残留的限量限，灵敏度高，可以检测到白酒中及其微量的农药残留。该灵敏度的提升不仅仅是得益于仪器检测性能的提升，还得益于本发明的前处理方法简单，仅进行除醇和过滤，无净化等步骤，样品中农药残留损失小，检测限显著降低。此外，本发明还具有以下优势：(1)本发明方法样品前处理过程中采用氮吹除去乙醇，全过程温度控制在室温以下，解决了热不稳定性农药易分解特性难题，提高了样品回收率。(2)本发明样品前处理过程中采用乙腈定容，提高了农药的溶解性，在喷雾离子化过程中提高了稳定性及离子化效率。(3)本发明采用高速冷冻离心方式，除去了样品中部分脂溶性物质及大分子物质，起到了对样品快速净化作用。(4)本发明采用氮吹除醇，高速冷冻离心净化等前处理方式，样品前处理简便、快速、使用有机溶剂少，经济且环保。(5)本发明采用了高灵敏度，高分辨率和强抗干扰能力的超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱进行检测，因此具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。附图说明图1为本发明实施例1中80种农药标准品tic图。图2为白酒空白标准品tic图。图3为本发明实施例2中高速冷冻离心处理样品tic图。图4为本发明实施例2中仅进行过滤处理的样品tic图。图5为本发明实施例3中甲酸对农药在仪器中响应的影响。图6为本发明实施例3中乙酸铵对农药峰型的影响；其中a为灭多威在加入5mm乙酸铵离子提取图，b为灭多威在不加入5mm乙酸铵离子提取图，c为杀虫脒在加入5mm乙酸铵离子提取图，d为杀虫脒在不加入5mm乙酸铵离子提取图。图7为本发明实施例4中流动相不同梯度处理的噻虫嗪离子提取图；其中a为乙腈相的起始浓度为0％时，噻虫嗪离子提取图，b为乙腈相的起始浓度为20％时，噻虫嗪离子提取图；c为乙腈相的起始浓度为50％时，噻虫嗪离子提取图。具体实施方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。1、仪器与试剂：农药标准品：阿苯达唑、倍硫磷、倍硫磷砜、倍硫磷亚砜、苯并噻唑、苯霜灵、苯线磷、苯线磷砜、吡虫啉、吡氟禾草灵、丙硫磷、丙溴磷、残杀威、虫线磷、稻温灵、敌草胺、敌敌畏、地虫磷、定菌磷、啶虫脒、毒虫畏、毒死蜱、多菌灵、恶霜灵、恶唑菌酮、二嗪磷、丰索磷、伏杀硫磷、庚虫磷、谷硫磷、甲胺磷、甲拌磷、甲草胺、甲氟磷、甲基毒死蜱、甲基嘧啶磷、甲萘威、甲霜灵、腈菌唑、精喹禾灵、久效磷、抗蚜威、克百威、乐果、磷胺、螺虫乙酯、马拉硫磷、咪酰胺、嘧菌酯、灭虫威、灭虫威砜、灭多威、灭蚜磷、噻虫嗪、三唑醇、三唑磷、三唑酮、杀虫脲、杀虫畏、杀线威、双苯三唑醇、双苯酰草胺、速灭磷、特丁磷硫亚砜、特丁磷硫砜、涕灭威亚砜、烯酰吗啉、蚜灭磷、氧乐果、乙伴磷、乙伴磷砜、乙伴磷亚砜、乙基对硫磷、乙基谷硫磷、异丙甲草胺、异稻瘟净、异恶草酮、异菌脲、茚虫威、增效醚，乙腈、甲醇均为lc-ms级试剂，蒸馏水符合gb/t6682中一级水的要求。美国thermofisher超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱；美国labnetvtexmixervx200振荡器；德国sigma高速冷冻离心机。实施例1白酒样品a中80种农药残留量检测1.样品前处理：准确移取1.0ml的白酒样品与2.0ml的pv管中，装有样品的pv管置于氮吹仪中氮吹除去乙醇，用乙腈定容到1.0ml，漩涡振荡2min，在4℃、12000rpm离心10min，取上清液，用0.22μm针头式过滤头过滤，收集滤液于液相小瓶中。2.准备标准工作液：农药按照有机磷类、氨基甲酸酯类、除草剂类、杀菌剂类、杀虫剂类区分，分别准确称取0.010g各种农药标准品，同类农药置于同一10.0ml容量瓶中，用丙酮溶解并定容，得到浓度为1000μg/ml的80种农药混合标准储备液；将混合标准储备液中5类农药混合标准储备液各吸取1.0ml置于10.0ml容量瓶中，乙腈定容，得到浓度为100μg/ml的80种农药标准混合储备液1，然后用50％(v/v)乙腈逐级稀释，并最终配制成在5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml、200.0ng/ml的80种混合农药的标准工作溶液，标准工作溶液避光0～4℃保存，可使用3个月；3.仪器测定：吸取配制好的不同浓度的混合标准工作溶液，用0.22μm针头式过滤头过滤，收集滤液于液相小瓶中。将装有标准工作液和样品的液相小瓶进入超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱进行检测分析(80种农药标准品tic图如图1所示)；此外，本发明还测定了不含标准品的空白白酒，其tic图如图2所示。4.农药残留计算：采用外标法进行农药目标物的定量分析，即以农药定量离子峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对处理后的样品进行测定，测得检出农药定量离子峰面积，代入标准曲线，求的样品中农药的含量。5.在超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定时，液相条件为：色谱柱采用2.1×100mm，3.5μm的agilenteclipse-xdb-c18色谱柱，乙腈作为流动相a，5mm乙酸铵溶液(含0.1％(v/v)甲酸)作为流动相b，进行梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1。表1流动相线性洗脱条件时间/分钟a/％b/％0.020801.0208010.0851517.0100020.0100021.02080其中柱温为30℃，流速为0.3ml/min，进样体积为10μl。质谱的质谱条件为：带加热功能的电喷雾离子源(hesi)，鞘气：30arb；辅助气：10arb；反吹气：5arb；电离电压：3.5kv；离子传输管温度：离子源温度：150℃；6.数据采集方式：正离子模式监测，采用fullms和targetms2扫描两种方式同时测定，扫描范围50-650m/z，fullms扫描的分辨率为35000，targetms2扫描模式分辨率为17500。80种农药标准品tic图见图1，质谱参数见下表2；白酒空白标准品tic图见图2，白酒样品的检测结果见表3。由下表2可知，本发明的80种农药的回收率在在87.1％～116.1％之间，平均相对标准偏差(rsd)在1.3％～15.9％之间，表明本发明方法的回收率高，重复性好。更突出的是，80种农药的最低检测线在0.034ng/ml～0.089ng/ml之间，与现有的农药残留限量标准中，大部分农药限量均高于10ng/ml相比，本发明灵敏度高，可以检测到白酒中及其微量的农药残留。表280种农药的质谱参数及方法学参数(n＝6)续表2表3样品a中农药目标物的检测结果注：“-“表示未检出。实施例2不同的除杂方式对于分析效果的影响现有技术中，前处理除杂一般仅采用过滤或者是离心，主要考虑到步骤越多，样品损失越多，且会增加工作量。本发明实验摸索了除杂方式对于本发明中80种农药的分析效果影响，具体步骤如下：准确移取1.0ml的白酒样品与2.0ml的pv管中，装有样品的pv管置于氮吹仪中氮吹除去乙醇，用乙腈定容到1.0ml，漩涡振荡5min，分别采用高速冷冻离心除杂，0.22μm针头式过滤头过滤除杂，高速冷冻离心加过滤除杂三种方式进行净化，其余参数和方式保持不变，得到的样品置于液相小瓶中。其余步骤参照实施例1。实验结果及讨论：结果见图1、图3和图4，图3为仅高速冷冻离心样品tic图，图4仅进行过滤处理的样品tic图。由图3和图4对比可以看出，冷冻离心后样品的tic图响应低于过滤处理，仅过滤处理的样品干扰峰明显多于冷冻离心处理，样品在除醇复溶后，某些醇溶性物质会析出，形成微小颗粒，在进入仪器检测时，不进行滤膜过滤除去杂质，容易堵塞液相管线及液质喷雾针，所以样品在进入仪器分析前必须进行过滤处理。高速冷冻离心可以除去复溶后溶液中部分醇溶性物质，降低样品进入仪器分析后的背景值，本发明最终选择高速冷冻离心后过滤除杂的方式进行净化，其处理样品得到的tic图见图1。实施例3不同的流动相对于分析效果的影响为了分析不同的流动相对本发明分析结果的影响，本发明采用甲醇-水，乙腈-水，乙腈-甲酸水(含0.1％(v/v)甲酸)，乙腈-5mm乙酸铵水溶液(含0.1％(v/v)甲酸)4组流动相分别进行梯度洗脱对比试验。其余的实验步骤、条件参照实施例1。实验结果及讨论：以80种农药完全分离所需的分析时间为参考依据，分别考察甲醇-水，乙腈-水两种流动相梯度洗脱情况，在使用甲醇-水为流动相时，80种农药完全分离需要35分钟，而采用乙腈-水溶液为流动相时，80种农药完全分离仅需要20min，所以采取乙腈-水为流动相进一步优化。以农药的峰面积为参考依据，对比分析加入甲酸和不加入甲酸对农药在仪器响应中的影响，结果见图5(因本发明中农药种类太多，所以以甲霜灵、马拉硫磷、三唑醇、除草定、双苯酰草胺的响应为例)。由图5可知，在流动相中加入甲酸后，可以促进农药的离子化，提高农药在仪器中的相应强度，所以在流动相中加入一定量的甲酸溶液，考虑到仪器及色谱柱的耐受性，甲酸浓度为0.1％(v/v)。此外，本发明还对比了在流动相中加入5mm乙酸铵对化合物峰型的影响实验，即对比了乙腈-甲酸水(含0.1％(v/v)甲酸)，乙腈-5mm乙酸铵水溶液(含0.1％(v/v)甲酸)两组流动相对农药在仪器中峰型的影响，结果见图6。在加入乙酸铵后(图6a、6c)，灭多威和杀虫脒的峰型较不加入(图6b、6d)的好，表明适量的乙酸铵在流动相中，可以一定程度上优化化合物的峰型，提高其相应强度作用。所以本发明最终选择乙腈-5mm乙酸铵水溶液(含0.1％(v/v)甲酸)为梯度洗脱的流动相。实施例4流动相的不同梯度对于分析效果的影响为了分析流动相的不同梯度对于分析效果的影响，本发明采用乙腈-5mm乙酸铵水溶液(含0.1％(v/v)甲酸)为流动相，探索了不同梯度分析对分析效果的影响。其余的实验步骤、条件参照实施例1。实验结果及讨论：乙腈相的起始浓度分别设定为0％，20％，50％，结果显示，以噻虫嗪为例，当乙腈为0％时，保留时间在3min之前的化合物有严重的溶剂效应，峰出现分裂(图7a)；当乙腈浓度50％时，样品基质中的强极性物质随流动相流出快，保留时间3min之前的化合物有较强的基质效应(图7c)，而乙腈起始浓度为20％时，效果较为适中(图7b)。在洗脱梯度中，以85％乙腈为梯度界限，有45种农药在乙腈20％-85％区间出峰，34种农药在乙腈85％-100％区间出峰，为了所有的化合物都有较好的分离度，同时缩短分析时间，取得较高的分析效率，对梯度洗脱时间进行分析，在乙腈20％-85％区间和85％-100％区间，以目标化合物取得完全分离，有足够的扫描点用于定性和定量为参考依据，结果见表4和表5。从表中可以看出，在乙腈浓度20％-85％区间，最佳洗脱时间为8-10min，通过进一步实验验证，当洗脱时间为9min时，所有的化合物可以达到定性定量的要求；在乙腈浓度85％-100％区间，最佳洗脱时间为7-9min，通过进一步实验验证，当洗脱时间为8min时，所有的化合物可以达到定性定量的要求。最终流动相的梯度洗脱表见表1。表4.乙腈浓度20％-85％洗脱时间的选择表5.乙腈浓度85％-100％洗脱时间的选择当前第1页12