一种同时检测花生中白藜芦醇的四种异构体的方法与流程

本发明涉及食品中活性物质的检测领域，具体涉及一种同时检测花生中白藜芦醇及其苷的四种异构体含量的方法。

背景技术：

白藜芦醇是在植物受到病原性进攻和环境恶化所产生的一种植物抗毒素,主要来源于花生、葡萄、虎杖、桑椹等植物中，自然界中白藜芦醇有4种存在形式：反式白藜芦醇、顺式白藜芦醇、反式白藜芦醇苷和顺式白藜芦醇苷。研究表明，植物中白藜芦醇主要以反式形式存在，反式白藜芦醇和反式白藜芦醇苷的热稳定性好，顺式白藜芦醇和顺式白藜芦醇苷的热稳定性较差，多种研究证明反式白藜芦醇的生物活性高于顺式，白藜芦醇苷在人体肠道中的糖苷酶作用下可以释放出白藜芦醇，在紫外线照射下反式异构体能够转化为其顺式异构体，所以建立一种准确检测花生中白藜芦醇四种异构体的方法，对花生加工过程中白藜芦醇及其苷的转化和损失进行更详细的跟踪调查，掌握白藜芦醇及其苷的的加工损失规律，促进白藜芦醇产业开发具有重要意义。白藜芦醇及其苷的四种异构体的分子结构如图7所示。

白黎芦醇具有非常重要的应用前景，研究发现，白藜芦醇及白藜芦醇苷具有多种药理作用，白藜芦醇可以治疗癣，皮炎等过敏性急病，也具有降低血清和肝脏脂质，预防动脉粥样硬化，减小血小板凝聚，保护肝脏，防止冠心病的作用，另外白藜芦醇能有效的抑制与癌症各过程相关的细胞活动，同时，作为一种天然的抗氧化剂，在美国的《抗衰老圣典》中，白藜芦醇被列为“100种最热门有效抗衰老物质”之一。

随着人们对花生的深入开发，发现花生的各个部位均有较高含量的白藜芦醇，如花生芽中含有四种白藜芦醇的异构体，花生红衣中含有三种白藜芦醇的异构体，花生酱中也含有一种白藜芦醇。因此，研究出一种快速高效地提取花生中的白藜芦醇，并且简易、快速、准确的检测花生中的白藜芦醇及其苷的四种结构含量的方法，可为后续白藜芦醇资源开发打下良好基础。

可用于白藜芦醇的检测方法很多，主要包括高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和毛细管电泳法。

1.高效液相色谱法(hplc)

目前对白藜芦醇进行定量分析最广泛的方法是高效液相色谱法，高效液相色谱法具有重现性良好，选择性高，灵敏度高，结果可靠等优点。hplc不仅可以用于白藜芦醇的常规分析，还可用于葡萄酒中白藜芦醇的痕量分析，但hplc的检测时间较长，样品分析量有限，不能大批量的进行样品分析。

2.气相色谱-质谱法(gc/ms)

气相色谱-质谱(gc/ms)法用固相萃取柱萃取,乙酸乙酯进行洗脱,洗脱液用n2吹干,用硅烷化试剂衍生化后进入gc/ms分析检测。

gc/ms的优点是可以对顺、反两种白藜芦醇进行同步测定，样品用量少(仅需1ml),测定速度较快(约16分钟),检测限低(最低3.72μg/l)，但此法需对样品进行硅烷化衍生处理,不仅增加了处理环节,并导致顺式白藜芦醇的测定结果偏高,而反式白藜芦醇偏低。

3.毛细管电泳法(cze)

毛细管区带电泳(capillaryzoneelectrophoresis，cze)，别名为毛细管自由电泳。作为近年来发展较快的一种检测方法，在白藜芦醇的检测中也得到了应用。应用毛细管电泳法分析白藜芦醇，由于白藜芦醇的多羟基结构，比较容易造成样品的吸附，导致定量重现性较差。如果采用紫外检测器，由于毛细管电泳的光程短，造成检测的灵敏度较低，比较难达到μm级。

白藜芦醇的检测一直向着更简便、更快捷、更全面的方向发展，因此，需要提供克服现有技术中常用方法检测时间长、分析效率低、灵敏度低、重现性差等难题，在保证方法真实性的基础上的一种方法。

技术实现要素：

针对现有技术在花生白藜芦醇的检测过程中存在的检测时间长，分析效率低、灵敏度低、重现性差等问题，本申请提供一种利用超高效液相色谱对花生中的白藜芦醇进行快速、准确检测的方法。

本发明所述的方法包括如下步骤：

1)对待测样品进行预处理；

2)利用超高效液相色谱法对预处理后的待测样品进行检测，选择c18色谱柱，pda二极管阵列检测器，控制柱温为33～38℃，检测波长：2d：285nm；3d：210-400nm；

流动相为甲醇(b)和0.1％甲酸的水溶液(d)；

洗脱条件为：0min：10％b，90％d；0.5min：10％b，90％d；2min：25％b，75％d；3.5min：30％b，70％d；4min：35％b，65％d；5min：50％b，50％d；7min：90％b，10％d；7.2min：10％b，90％d；10min：10％b，90％d；流动相的流速为0.4～0.5ml/min。

本发明采用超高效液相色谱法对待测样品进行检测，通过调整流动相的组成和检测条件，可对待测样品中的四种白藜芦醇的异构体进行有效地分离和快速地检测。上述对四种异构体的检测不仅限于来源于花生中的白藜芦醇，也可实现对其他来源的白藜芦醇中四种异构体的检测。

优选的，所述待测样品包括待测鲜样、待测干样和直接待测样；

所述待测鲜样包括：花生芽或花生红衣；所述待测干样包括：花生根或花生仁；所述直接待测样包括花生酱。

优选的，所述待测鲜样或待测干样的预处理方法包括如下步骤：

1)将待测样鲜样或干样干燥至水分含量小于5％；

2)将干燥后的样品粉碎后过60目筛；

3)将过筛后的粉末状样品置于80％的乙醇提取液中，在70～80℃的恒温水浴中振荡提取40～50min；

4)对提取完成后得到的混合物进行离心处理，取上清液，过0.2～0.25um的滤膜，得预处理后的待测样品；

和/或所述直接待测样的预处理包括如下步骤：

1)将待测样品置于80％的乙醇提取液中在70～80℃的恒温水浴中振荡提取40～50min；

2)对提取完成后得到的混合物进行离心处理，取上清液，过0.2～0.25um的滤膜，得预处理后的待测样品。

优选的，所述待测鲜样的干燥方法为冻干机冻干；所述待测干样的干燥方法为将干样置于鼓风干燥箱中，在50～60℃的条件下烘干。

在冻干的过程中，优选在-50～-55℃下冻干45～50h效果最佳。

在烘干的过程中，优选在55℃下烘干效果最佳。

0.22um的滤膜较为常用，整个预处理过程在避太阳光直射的条件下可更有效地对白藜芦醇进行保护。

优选的，所述提取方法包括如下步骤：

1、样品的预处理

1)将待测样鲜样或干样干燥至水分含量小于5％；

2)将干燥后的样品粉碎后过60目筛；

3)将过筛后的粉末状样品置于80％的乙醇提取液中，在80℃的恒温水浴中以130～150r/min振荡提取45～50min，样品与乙醇提取液的质量体积比为1～1.5：50，；

4)对提取完成后得到的混合物进行离心处理，取上清液，过0.22um的滤膜，得预处理后的待测样品；

和/或所述直接待测样的预处理包括如下步骤：

1)将过筛后的粉末状样品置于80％的乙醇提取液中，在80℃的恒温水浴中以130～150r/min振荡提取45～50min，样品与乙醇提取液的质量体积比为1～1.5：50，

2)对提取完成后得到的混合物进行离心处理，取上清液，过0.22um的滤膜，得预处理后的待测样品。

优选的，在检测的过程中，所述柱温为35℃。

优选的，在检测的过程中，所述流动相的流速为0.45ml/min。

优选的，所述超高效液相色谱检测过程中，所述c18色谱柱为watersacquityuplchssc18柱(2.1mm×100mm,1.8μm)。

优选的，所述pda二极管阵列检测器为acquityuplcpda二极管阵列检测器。

优选的，所述超高效液相色谱仪为watersacquityuplch-class。

优选的，在对花生样品中的白藜芦醇进行检测的过程中，本发明所述的方法包括如下步骤：

1、样品的预处理

1)将待测样鲜样或干样干燥至水分含量小于5％；

2)将干燥后的样品粉碎后过60目筛；

3)将过筛后的粉末状样品置于80％的乙醇提取液中，在80℃的恒温水浴中以130～150r/min振荡提取45～50min，样品与乙醇提取液的质量体积比为1～1.5：50，；

4)对提取完成后得到的混合物进行离心处理，取上清液，过0.22um的滤膜，得预处理后的待测样品；

和/或所述直接待测样的预处理包括如下步骤：

1)将过筛后的粉末状样品置于80％的乙醇提取液中，在80℃的恒温水浴中以130～150r/min振荡提取45～50min，样品与乙醇提取液的质量体积比为1～1.5：50，

2)对提取完成后得到的混合物进行离心处理，取上清液，过0.22um的滤膜，得预处理后的待测样品。

2、样品的检测

利用超高效液相色谱法对预处理后的待测样品进行检测，选择c18色谱柱，pda二极管阵列检测器，控制柱温为33～38℃，检测波长：2d：285nm；3d：210-400nm；

流动相为甲醇(b)和0.1％甲酸的水溶液(d)；

洗脱条件为：0min：10％b，90％d；0.5min：10％b，90％d；2min：25％b，75％d；3.5min：30％b，70％d；4min：35％b，65％d；5min：50％b，50％d；7min：90％b，10％d；7.2min：10％b，90％d；10min：10％b，90％d；流动相的流速为0.45ml/min；

检测的过程中，选择超高效液相色谱仪watersacquityuplch-class，所述c18色谱柱为watersacquityuplchssc18柱(2.1mm×100mm,1.8μm)，所述pda二极管阵列检测器为acquityuplcpda二极管阵列检测器，通过以上方法，实现四种异构体的有效分离；

对于存在于花生任何部位中的白藜芦醇，采用上述的方法可最大限度进行提取，且保持提取物的活性，进而实现准确地检测和分离，得到大量的高纯度的产品。

本发明所述的方法还可实现对待测样品中白藜芦醇的四种异构体的定量检测，其为：

a、向所述c18色谱柱中通入分别通入反式白藜芦醇、反式白藜芦醇苷、顺式白藜芦醇和顺式白藜芦醇苷不同浓度的标准品，采用步骤2)所述方法进行检测，根据所述标准品的浓度和峰面积绘制标准曲线；

b、将步骤2)中测得的待测样品的峰面积分别代入上述的标准曲线，得待测样品中相应物质的浓度，计算出待测样品中的白藜芦醇的四种异构体的含量。

计算的过程中，按下述公式进行

c＝(a–b)×1/a×c×1/w×1/1000

其中：

c＝待测样品中白藜芦醇异构体浓度；

a＝白藜芦醇异构体的峰面积；

w＝样品称样量(g)；

a＝标准曲线的斜率；

b＝标准曲线的截距；

c＝稀释倍数。

本发明所述的方法具有如下有益效果：

1)现有方法已经有使用乙醇进行提取，但是提取时间较本发明时间长，本发明通过加热提取，并控制乙酸的浓度、加热提取的温度和时间，既缩短了提取时间，还可最大限度地保留白藜芦醇这种不稳定的物质的活性。与现有技术相比，溶剂环保无污染，方法简易快捷，样品纯净对仪器污染程度低。

2)由于本申请采用的超效液相色谱法，可实现连续进样，对样品进行批量的分析，每个样品的检测时间仅需10min左右，极大地提高了检测效率。

附图说明

图1为白藜芦醇四种异构体的uplc检测图谱；

图2为花生芽中白藜芦醇四种异构体的uplc检测图谱；

图3为花生红衣中白藜芦醇三种异构体的uplc检测图谱；

图4为花生酱中白藜芦醇一种异构体的uplc检测图谱；

图5为白藜芦醇四种异构体的hplc检测图谱

图6为采用对比例方法提取后，花生红衣中白藜芦醇的uplc检测图谱；

图7为白藜芦醇及糖苷异构体的结构。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例涉及对花生芽中的白藜芦醇进行定性和定量检测的方法，包括如下步骤：

1、待测样品的预处理：

1)新鲜花生芽若干，置于冻干机中冻干处理48h；

2)经高速粉碎机粉碎，过60目筛，收集粉末，低温避光保存备用；

3)准确称取1g花生芽粉末，放入150ml具塞三角瓶中，加入50ml乙醇溶液(80％，v/v)，于恒温水浴振荡器(80℃，140r/min)提取45min，

4)对所述提取液在5000rpm离心10min取上清液，过0.22μm的微孔滤膜待测，全过程避太阳光，得待测样

2、将待测样品通过超高效液相色谱进行分析检测，仪器条件如下：

液相条件：

色谱柱：watersacquityuplchssc18柱(2.1mm×100mm,1.8μm)；pda二极管阵列检测器，柱温35℃，检测波长2d：285nm；3d：210-400nm，进样体积1μl，进样方式：自动进样。流动相为甲醇(b)和0.1％甲酸水溶液(d)，洗脱条件0min：10％b，90％d；0.5min：10％b，90％d；2min：25％b，75％d；3.5min：30％b，70％d；4min：35％b，65％d；5min：50％b，50％d；7min：90％b，10％d；7.2min：10％b，90％d；10min：10％b，90％d。流速0.45ml/min。

3、定量检测

所述定量检测方法包括以下步骤：采用标准曲线法，包括标准曲线的准备：以标准溶液的浓度为x轴(mg/l)，峰面积为y轴绘制曲线，计算线性回归如下：

反式白藜芦醇y＝8957.3x–2488r2＝0.9999

反式白藜芦醇苷y＝4695.4x-1687.8r2＝0.9997

顺式白藜芦醇y＝6894.1x+32769r2＝0.9989

顺式白藜芦醇苷y＝4047.5x+4740.6r2＝0.9979

确保线性关系良好(r²＞0.997)；

用下述公式计算样品中白藜芦醇各异构体的浓度(mg/kg):

c＝(az–b)×1/a×c×1/w×1/1000

其中：

c＝样品中白藜芦醇异构体浓度

a＝白藜芦醇异构体的峰面积

w＝样品称样量(g)

a＝斜率

b＝截距

c＝稀释倍数

为判断四种异构体的出峰时间，用标准品进样，得图1。对样品进行检测，得到的色谱图如图2，计算得到花生芽样品中反式白藜芦醇(trans-chun)的含量为0.030mg/kg，反式白藜芦醇苷(trans-gan)的含量为0.099mg/kg，顺式白藜芦醇(cis-chun)的含量为0.025mg/kg，顺式白藜芦醇苷(cis-gan)的含量为0.049mg/kg。

实施例2

本实施例涉及对花生红衣中的白藜芦醇进行定性和定量检测的方法，包括如下步骤：

1、待测样品的预处理：

1)花生红衣样品若干，置于55℃鼓风干燥箱中烘干9h；

2)经高速粉碎机粉碎，过60目筛，收集粉末，低温避光保存备用；

3)准确称取1g花生红衣样品粉末，放入150ml具塞三角瓶中，加入50ml乙醇溶液(80％，v/v)，于恒温水浴振荡器(80℃，140r/min)提取45min；

4)对所述提取液在5000rpm离心10min取上清液，过0.22μm的微孔滤膜待测，全过程避太阳光，得待测样。

仪器分析、数据处理步骤同实施例1

得到的色谱图如图3，计算得到花生红衣样品中反式白藜芦醇苷(trans-gan)的含量为1.492mg/kg，顺式白藜芦醇(cis-chun)的含量为0.073mg/kg，反式白藜芦醇(trans-chun)的含量为0.489mg/kg，顺式白藜芦醇苷(cis-gan)未检出。

实施例3

本实施例涉及对花生酱中的白藜芦醇进行定性和定量检测的方法，包括如下步骤：

1)准确称取1g花生酱样品，放入150ml具塞三角瓶中，加入50ml乙醇溶液(80％，v/v)，于恒温水浴振荡器(80℃，140r/min)提取45min，

2)对所述提取液在5000rpm离心10min取上清液，过0.22μm的微孔滤膜待测，全过程避太阳光，得待测样。

仪器分析、数据处理步骤同实施例1

得到的色谱图如图4，计算得到花生酱样品中反式白藜芦醇苷(trans-gan)的含量为2.572mg/kg，反式白藜芦醇(trans-chun)、顺式白藜芦醇(cis-chun)、顺式白藜芦醇苷(cis-gan)未检出。对比例1

在对超高效液相的色谱条件转化为高效液相色谱条件后，如图5所示(英文名称为全称)，实际测得的白藜芦醇四种标品的出峰时间为：反式白藜芦醇14.663min(trans-resveratrol)，顺式白藜芦醇17.069min(cis-resveratrol)，反式白藜芦醇苷10.681min(trans-resveratrolglucoside)，顺式白藜芦醇苷12.326(cis-resveratrolglucoside)min，且整个样品检测需要35min，而本发明的超高效液相色谱检测仅需10min。

对比例2

与实施例2相比，其区别在于，采用花生红衣进行检测，其预处理方法为：准确称取花生红衣3g，置于150ml具塞三角瓶中，加入45ml体积分数75％的无水乙醇，50℃下超声提取64min，5000r/min离心10min取上清液，过0.22μm滤膜待测。

采用上述方法制备的样品只能检测出两种有效成分，如图6所示，分别为反式白藜芦醇苷(trans-gan)和顺式白藜芦醇(cis-chun)，进一步证明本发明所述的预处理方法可对白藜芦醇进行充分地提取。

本发明的附图中有文字与谱图重叠的部分，由于出峰时间决定了物质的种类，因此，即便文字与谱图重叠，也不影响内容的清楚公开。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，在不偏离本发明精神的基础上所做的这修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。