一种快速鉴别白蛋白类、球蛋白类制品的方法与流程

本发明涉及生物测定技术领域，具体涉及一种快速鉴别白蛋白类、球蛋白类制品的方法。

背景技术：

《中国药典》第四部(2015版)中的3403免疫双扩散法和3404免疫电泳法介绍了蛋白类制品的特异性及分辨鉴别方法，对应的抗原、抗体在一定的浓度、比例情况下，在一定时间后，抗原与抗体之间形成免疫复合物的沉淀线，能对供试品的特异性进行检查，可根据其特异性判断供试品是否为人血浆或者血清。再将供试品通过电泳分离成区带的两个个抗原，然后与相应的抗体进行双向免疫扩散，同样在一定的浓度及比例情况下，会形成可见的沉淀线(弧)，而将沉淀线与已知标准抗原、抗体生成的沉淀线(弧)的位置、形状进行比较，从而分析供试品的成分及性质，从而判断血浆或血清中蛋白的种类。而在双扩散法和电泳法中均会使用脱色液进行脱色，以便后续的观察与判断，而清晰的观察结果是准确判断的前提，因此对脱色要求较高，需要背景脱色至无色状态，常常在脱色环节需要耗费大量时间，判断结果产生滞后性。

生物企业要对未包装制品进行检验、鉴别，防止交叉混合，避免引起使用事故的情况，一般根据《中国药典》中对蛋白的鉴别实验方法进行，其中，在最后的脱色环节中，使用《中国药典》中记载的脱色液需要长达48小时的时间才能对琼脂糖凝胶板上产生沉淀线后的背景脱色到接近无色，以便于清楚的观察与判定，从而提供可靠的鉴别结果。而在《中国药典》中明确了脱色液的配制方法：“量取乙醇45ml、冰醋酸5ml与水50ml，混合均匀”，目前的生物企业在血浆、血清的鉴别中均使用此种配液，鉴别一项结果往往需要长达几天的时间，不仅耗费了大量的时间，也降低了有效工作效率。随着未来对血浆、血清类制品需求量得逐渐增大，亟需一种快速鉴别方法，而目前还没有可靠手段对反应、扩散得时间进行减少，但可对耗时时间最长得脱色环节进行研究，以克服目前背景脱色时间长的问题。

技术实现要素：

针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种快速鉴别白蛋白类、球蛋白类制品的方法，解决了现有方法中反应产生沉淀线后对背景脱色时间长的问题。

为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：一种快速鉴别白蛋白类、球蛋白类制品的方法，包括以下步骤：

s1：在琼脂糖凝胶板负极1/3处上方打一测定孔，下方打一对照孔，在测定孔中加制品溶液10μl及溴酚蓝指示液1滴；对照孔加正常人血清或人血浆10μl及溴酚蓝指示液1滴；

s2：采用3层滤纸搭桥和电泳缓冲液接触，在100v恒定电压电泳2小时左右，并在测定孔及对照孔之间挖3～4mm宽的凹槽，在槽中加入人血清抗体或人血将抗体后放入湿盒，在温度37℃～38℃下扩散24h；

s3：扩散结束后，用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板，浸泡好的琼脂糖凝胶板放入染色剂中进行染色；

s4：将染色后的琼脂糖凝胶板放入装有浓度≥75％乙醇的脱色盒中进行脱色，静置15min以上，使背景脱色而沉淀线清晰可见；

s5：将沉淀线与对照品进行比较，快速鉴别制品溶液中含有的蛋白种类。

进一步的，所述测定孔及对照孔的孔径均为3mm，且测定孔与对照孔的孔距为13～14mm。

进一步的，所述琼脂凝胶板的制作方法包括以下步骤：

a、称取琼脂糖1.5g，加水50ml及电泳缓冲液50ml，加热并溶胀形成1.5％琼脂糖溶液；

b、将1.5％琼脂糖溶液倒于水平玻板上，厚度3妈妈左右，静置至凝固成无气泡的均匀薄层。

进一步的，所述凹槽两端均距离琼脂糖凝胶板两端各3～5mm。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、采用本发明中的脱色方法，直接使用浓度≥75％的乙醇代替《中国药典》中记载的脱色液，使琼脂糖凝胶板染色背景在20min内便脱色至无色状态，并且沉淀线清晰可见、符合鉴别标准；而采用脱色液对琼脂糖凝胶板染色背景需要48小时左右才能脱色到满足沉淀线清晰可见、符合鉴别标准的无色状态，脱色时间大大降低，使得整个鉴别实验的持续时间从之前的4～5天缩短至1～2天，提升了50％的效率。

2、采用浓度≥75％的乙醇，可直接进行采购，避免了需要对脱色液进行配置的工序，成本降低，节约时间。

附图说明

图1为人血白蛋白制品采用两种方法脱色的过程对比图；

图2为静注人免疫球蛋白制品采用两种方法脱色的过程对比图；

图3为识别人血浆中采用两种方法脱色的过程对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：

本发明所述的一种快速鉴别白蛋白类、球蛋白类制品的方法，包括以下步骤：

s1：在预先制得的琼脂糖凝胶板负极1/3处上方打一测定孔，下方打一对照孔，在测定孔中加制品溶液10μl及溴酚蓝指示液1滴；对照孔加正常人血清或人血浆10μl及溴酚蓝指示液1滴；

为了使后续反应产生沉淀线的轮廓更清晰，更便于观察，测定孔与对照孔的孔径均取3mm，且测定孔与对照孔的孔距取13mm～14mm。

其中，琼脂糖凝胶板采用以下方法制作：a、称取琼脂糖1.5g，加水50ml及电泳缓冲液50ml，加热并溶胀形成1.5％琼脂糖溶液；b、将1.5％琼脂糖溶液倒于水平玻板上，厚度3mm左右，静置至凝固成无气泡的均匀薄层。

另外，溴酚蓝指示液通过溴酚蓝50mg与水溶解成100ml；而且，人血清或人血浆需要加入生理氯化钠溶液稀释成0.5％。

s2：采用3层滤纸搭桥和电泳缓冲液接触，在100v恒定电压电泳2小时左右，然后在测定孔及对照孔之间挖3～4mm宽的凹槽，在槽中加入人血清抗体或人血将抗体后放入湿盒，在温度37℃～38℃下扩散24h；

其中，凹槽两端均距离琼脂糖凝胶板两端各3～5mm。

另外，电泳缓冲液又称巴比妥缓冲液，其配制方法是，称取巴比妥4.14g与巴比妥钠23.18g，加适量水并加热使之溶解，冷却到室温后在添加叠氮钠0.15g，加水溶解成1500ml，即可。

s3：扩散结束后，用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板，浸泡好的琼脂糖凝胶板放入染色剂中进行染色；

使用生理氯化钠溶液浸泡琼脂糖凝胶板是为了出去未结合的蛋白质，防止在后续染色过程中产生干扰项。其中染色剂采用0.5％氨基黑染色剂，并通过氨基黑10b0.5g与50ml甲醇、冰醋酸10ml、40ml水混合溶解而成。

s4：将染色后的琼脂糖凝胶板放入装有浓度≥75％乙醇的脱色盒中进行脱色，静置15min以上，使背景脱色而沉淀线清晰可见；

s5：将沉淀线与对照品进行比较，快速鉴别制品溶液中含有的蛋白种类。

为了验证本发明方法优于《中国药典》中的方法的效果，特做了如下对比实验：

1)、采用人血白蛋白作为试供品原料，按照上述方法制作并进行染色，分别编号a、b后待用，其中，将a板放入《中国药典》中描述的脱色液(量取乙醇45ml、冰醋酸5ml与水50ml，混合均匀)中，而将b板放入浓度为75％的乙醇中，同时计时观察。

如图1，在浸泡20min时，b板的染色背景已经接近无色状态，可清晰对沉淀线进行观察，而a板背景还较深，沉淀线的轮廓还分辨不清晰，还具有混合区域，不符合观察对比的标准状态。

2)采用静注人免疫球蛋白作为试供品原料，同样按照上述方法制作并染色，分别编号c、d待用，将c板放入脱色液中，而将d板放入浓度大于75％的乙醇中，并计时观察。

如图2，在浸泡20min时，d板的染色背景已经接近无色状态，且可清晰分辨沉淀线的轮廓，符合观察判断标准；而c板背景与沉淀线轮廓混合，无法清晰辨别，不符合观察判断标注。

通过上述实验，可以得知，采用浓度≥75％乙醇代替《中国药典》中提出的脱色液，能够在20min内就可对琼脂糖凝胶板染色背景脱色至无色，使沉淀线清晰可见，相比于脱色液需要长达48h的脱色时间以及期间需要更换脱色液，不仅浪费时间还浪费材料，通过本发明的鉴别方法，大大提升了脱色时间，使得整个鉴别时间缩短，可从原来的4～5天缩短至1～2天。

实施例2：

实施例1中是试供品已经为确定为人血浆作为原料，并进行蛋白种类的分辨，在《中国药典》中的双扩散法作为对蛋白制品特异性的判断能够区别人血浆与其他动物的血浆，同样可对凝血因子类制品采取此方法进行鉴别，是属于鉴别蛋白种类前需要做的必要鉴别工序，其中也同样采用了如实施例1中提到的浓度≥75％乙醇替代《中国药典》中的脱色液。

辨别人血浆(凝血因子类制品)的方法包括以下步骤：

1、使用实施例1中制作的琼脂糖凝胶板，然后在琼脂糖凝胶板上打孔，孔直径为3mm，孔距间隔3mm，并形成方阵型分布；

其中方阵型的数量可根据需要进行扩展，以适应扩散需要。

2、在中央孔加入抗血清20μl，周边孔中加入供试品溶液μl，并留1孔加入对应阳性对照血清μl后，将整个琼脂糖凝胶板放置于湿盒中，在37℃条件下水平扩散24h；

3、扩散完毕后，用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板，去除未结合蛋白质；

4、浸泡结束，将琼脂糖凝胶板放入实施例1中的染色剂中进行染色；

5、将染色完毕的琼脂糖凝胶版放入装有浓度≥75％乙醇的脱色盒中进行脱色，静置15min以上，背景脱色而沉淀线清晰可见止；

6、阳性对照出现相应的沉淀线则成立，供试品与人血清抗体之间出现沉淀线，则供试品与人血清具有同源性。

通过实施例2能对事先未知供试品是否为人血清或人血浆进行特异性检查，比实施例1中鉴定蛋白种类要求更迅速，因此在实施例2中同样采用浓度≥75％乙醇替代脱色液，因为脱色原理相同，也能大大缩短实验时间。

如图3所示，采取方阵型数量为5个，分别采用人、马、牛、猪、羊血浆作为试供品溶液，按照实施例2中的方法制作并染色，分别编号e、f待用，将e组板放入《中国药典》中描述的脱色液中，而将f组板放入浓度≥75％乙醇中，并计时观察。

如图3所示，在20min时，f组板上的背景已接近无色而沉淀线的轮廓清晰可见，符合观察判断标准，而e组板上的背景与沉淀线还处于混合阶段，无法清晰的辨别沉淀线轮廓，不符合观察判断标准。

无论是实施例1中对蛋白种类的鉴别，还是实施例2中对人血浆的辨别，均具有脱色过程，若按照之前的脱色方法进行脱色，则需要长达4～5天，若还需要对血浆进行判断，时间会更长。实施例1与实施例2中，在脱色阶段均采用浓度≥75％乙醇作为脱色剂使用，从原来48h的脱色时间直接降低至20min左右，使得整个实验程序时间大大降低。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。