一种小儿消积止咳口服液多指标定量指纹图谱的建立方法与流程

本发明涉及对小儿消积止咳口服液中化学成分进行分析鉴别、含量测定及质量控制，具体涉及一种小儿消积止咳口服液多指标定量指纹图谱的建立方法。

背景技术：

小儿消积止咳口服液是由山楂、槟榔、枳实、枇杷叶、瓜蒌、莱菔子、葶苈子、桔梗、连翘、蝉蜕等十种中药材组成的复方制剂，具有“清热肃肺，消积止咳”等功效，对小儿食积咳嗽具有非常明显的疗效。2015版《中国药典》一部中规定采用hplc法测定辛弗林的含量来用于小儿消积止咳口服液的质量控制。但是该制剂的化学成分极其复杂，仅靠单一成分的含量测定并不能完全反映中药多成分多靶点的特点，难以实现对该品种的质量控制。

中药指纹图谱是整体评价多维组分复杂基质中药质量的有效控制方法。将能够标识中药材或制剂特征成分的光谱图或色谱图结合现代数理统计软件进行分析处理，得到的指纹图谱信息能全面、综合地反映所含成分的相对关系，较好地体现中药成分的复杂性和相关性，在中药质量评价和控制方面得到了大量应用。为了更全面地控制该制剂的质量，保证其临床疗效，应建立准确可靠的方法来量化其中的化学成分，对多种活性成分进行研究，并结合中药色谱指纹图谱对其进行质量控制。

近年来，研究者们采用单个或多个化学成分的含量作为主要评价指标对小儿消积止咳口服液的分析和质量控制方法进行了大量研究。周佳宝等建立了hplc测定小儿消积止咳口服液中辛弗林含量的方法；郭时运等以连翘苷为控制指标来评价小儿消积止咳口服液质量；康四和等先后以小儿消积止咳口服液中的君药枳实和槟榔为研究药材，分别将其中的辛弗林、氢溴酸槟榔碱与柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等成分作为定量指标对小儿消积止咳口服液进行研究。但以上研究主要测定了几种主要活性成分的含量，缺乏对该制剂整体质量的控制研究。

技术实现要素：

针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种小儿消积止咳口服液多指标定量指纹图谱的建立方法。该方法采用hplc-dad-esi-q-tof/ms技术分析鉴别小儿消积止咳口服液中化学成分，结合中药配伍原则并参考2015版《中国药典》一部中单味药质控指标选择其质控指标，并在此基础上建立其hplc多指标定量指纹图谱，以期为小儿消积止咳口服液的整体质量评价研究提供较为全面的方法和技术支持。

为了解决以上问题，本发明的技术方案为：

一种小儿消积止咳口服液多指标定量指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：采用高效液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱联用检测多个批次小儿消积止咳口服液中的多种共有化学物质的化学信息特征峰，根据检测得到的多个批次小儿消积止咳口服液中多种共有化学物质的色谱峰并结合多指标成分含量测定建立小儿消积止咳口服液的指纹图谱，即为小儿消积止咳口服液的多指标定量指纹图谱；其中色谱条件为：采用的色谱柱为xselect^tmhsst3色谱柱(3.0×150mm，3.5μm)，采用的流动相为乙腈—0.4％冰醋酸水，检测波长为254nm，流动相流速为0.6ml/min；质谱条件为：采用电喷雾正、负离子模式，雾化气压力45psi，干燥气(n2)流速10.0ml/min，干燥气体温度350℃，毛细管电压3500v，裂解电压175v，锥孔电压65v，全扫描质荷比(m/z)范围50～1100。

0.4％冰醋酸水是指冰醋酸的质量分数为0.4％的冰醋酸水溶液。

本发明首次通过高效液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱联用检测多个批次小儿消积止咳口服液中的共有化学物质，并基于这些共有化学物质优化色谱条件，获得小儿消积止咳口服液的高效液相色谱的指纹图谱，对提高小儿消积止咳口服液的质量标准，保证其安全合理用药提供了方法和技术支持。

在检测获得小儿消积止咳口服液的高效液相色谱的指纹图谱的过程中，其存在以下困难：1.小儿消积止咳口服液由10味中药材复配制成，其化学成分及其复杂，色谱分离难度大，不同化学成分对色谱分离的条件要求不同，容易出现部分化学成分峰形较好，而部分化学成分的峰形较差，甚至出现严重的拖尾现象，因而难以实现对化学成分的分离效果的掌控，影响检测的准确性；2.检测器的检测波长范围在190～400nm，不同的检测波长检测出的小儿消积止咳口服液化学成分的信息不同，难以确定哪个波长能够更全面的检测金鸣片中的化学成分。

首先，本发明选择xselect^tmhsst3(3.0×150mm，3.5μm)色谱柱，在相同的条件下，该色谱柱对小儿消积止咳口服液的分离效果比其它色谱柱的分离效果好，能够最大程度的将小儿消积止咳口服液中更多的化学成分分离出来。

其次，本发明选择乙腈—0.4％冰醋酸水体系作为流动相时得到的色谱峰峰形较好且稳定，解决了小儿消积止咳口服液在分离过程中出现的色谱峰拖尾现象，提高了检测结果的准确性。

第三，本发明的检测波长为254nm，该检测波长能够全面反映金鸣片中的化学成分，并且基线较平稳，同时能够使各色谱峰之间有较好的分离度。

进一步的，高效液相色谱的进样量为15μl，柱温为25℃。

进一步的，高效液相色谱的色谱条件采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为0～16min，0％a；16～22min，0％～3％a；22～34min，3％a；34～35min，3％～5％a；35～45min，5％～6％a；45～58min，6％～7％a；58～59min，7％～10％a；59～68min，10％～11％a；68～80min，11％～13％a；80～100min，13％～15％a；100～115min，15％～20％a；115～125min，20％～24％a；125～127min，24％～60％a；127～130min，60％～90％a；130～140min，90％～100％a，其中，“％”均代表体积百分含量，a为乙腈。

进一步的，根据各共有峰的指认结果，结合中药配伍原则并参考2015版《中国药典》一部中单味药质控指标，选择了10中化学成分作为小儿消积止咳口服液的质控指标，分别为新橙皮苷、辛弗林、柚皮苷、3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇、橙皮苷、连翘酯苷a、连翘苷、绿原酸、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖-7-o-β-d-龙胆双糖苷和金丝桃苷。

进一步的，该方法中供试品溶液的制备方法，包括如下步骤：量取小儿消积止咳口服液置于容量瓶中，加水定容后，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得，小儿消积止咳口服液的体积与容量瓶的体积比为1:10。

进一步的，该方法还包括分别配制辛弗林、绿原酸、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖-7-o-β-d-龙胆双糖苷、金丝桃苷、连翘酯苷a、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、连翘苷、3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的标准储备溶液的步骤。

再进一步的，标准储备溶液的浓度为1.0mg/ml。

更进一步的，标准储备溶液的配制方法如下：3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇加二氯甲烷溶解后，再用甲醇定容，其余标准品直接用甲醇进行定容。

上述建立方法得到的小儿消积止咳口服液多指标定量指纹图谱。

上述小儿消积止咳口服液多指标定量指纹图谱在小儿消积止咳口服液质量控制中的应用。

上述小儿消积止咳口服液多指标定量指纹图谱在监控小儿消积止咳口服液生产中的应用。

本发明的有益效果为：

1、本发明的小儿消积止咳口服液指纹图谱的建立方法中，精密度试验、重复性试验、稳定性试验的相似度评价都表明，该方法具有检测准确性高、稳定性好的优点。

2、本发明的小儿消积止咳口服液指纹图谱的建立方法对有效成分既能定性检测又能定量检测，可适用于监控小儿消积止咳口服液的原料药材、中间体半成品的质量以及生产工艺的质量控制，适用范围广。

3、本发明的小儿消积止咳口服液指纹图谱的方法，能更完整、全面、有效地判断小儿消积止咳口服液的质量，有利于全面监控产品质量及鉴别产品的真伪。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为混标(a)和样品(b)的色谱图；

图2为10批样品的hplc指纹图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

1、仪器与材料

华普s6000高效液相色谱仪；agilent6520q-tof液质联用仪(agilenttechnologies,usa)；万分之一电子分析天平(sartouriusbsa)；指纹图谱相似度评价软件为“中药色谱指纹相似度评价系统”(国家药典委员会2004a)；sb-5200d型高功率数控超声波仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。色谱柱：xselect^tmhsst3(3.0mm×150mm，3.5μm)，美国agilenteclipsexdb-c18(4.6mm×250mm，5.0μm)，美国agilentzorbaxsb-c18(4.6mm×250mm，5.0μm)。

对照品辛弗林(lot:y26o7y17088)、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖-7-o-β-d-龙胆双糖苷(lot:p23m7f11664)、金丝桃苷(lot:y20j7x9353)、连翘酯苷a(lot:r21j7f16577)、新橙皮苷(lot:z31j6l2067)、3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇(lot:p09j8f28357)，纯度均大于98％，购于上海源叶生物科技有限公司；绿原酸、柚皮苷、橙皮苷、连翘苷为实验室自制，结构经过波谱数据鉴定，峰面积归一化法质量分数均大于98％。甲醇(山东禹王实业有限公司化工分公司)、乙腈(美国fisherscientific)均为色谱纯，哇哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。10批样品于2016年11月8日购于济南各大药店，见表1。

表1样品来源

2方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1标准品溶液的制备

分别精密称取辛弗林、绿原酸、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖-7-o-β-d-龙胆双糖苷、金丝桃苷、连翘酯苷a、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、连翘苷、3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇标准品各1.0mg，置于1ml容量瓶中。其中，3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇加少量二氯甲烷溶解并用甲醇定容，其余标准品均直接用甲醇定容至刻度线，配制成浓度为1.0mg/ml的标准储备溶液。

2.1.2供试品溶液的制备

精密量取小儿消积止咳口服液100μl，置于1ml容量瓶中，加水至刻度线，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2色谱条件

色谱柱：xselect^tmhsst3色谱柱(3.0×150mm,i.d.3.5μm；waterstechnologies,美国)；流动相：乙腈(a)—0.4％冰醋酸水(b)，梯度洗脱模式见表2，对照品及样品色谱图见图1。

表2梯度洗脱模式

注：进样量：15μl；检测波长：λ＝254nm；流速：0.6ml/min；柱温：25℃。

2.3质谱条件

色谱柱后分流进入高分辨飞行时间质谱的流速为0.4ml/min。分别采用电喷雾正、负离子模式，雾化气压力45psi，干燥气(n2)流速10.0ml/min，干燥气体温度350℃，毛细管电压3500v，裂解电压175v，锥孔电压65v，全扫描质荷比(m/z)范围50～1100。

2.4esi-tof/ms鉴别

将色谱条件进一步优化后，采用hplc-dad-esi-q-tof/ms对样品进行分析，根据获得的化合物精确分子量信息推断出可能的分子式，结合dad检测器获得的紫外吸收信息，并参考以往研究报道的小儿消积止咳口服液中单味药材化学成分研究进展和中科院上海有机化学研究所中药化学成分数据库，对指纹图谱中各共有峰进行指认。结果见表3。

表3样品中38个化合物的esi-tof/ms测量结果

2.5多指标含量测定

2.5.1标准曲线及检出限

将每种标准储备液充分混合并稀释，得到八种不同浓度的混合对照品(分别是，266.67μg·ml^-1、200.00μg·ml^-1、133.33μg·ml^-1、66.67μg·ml^-1、40.00μg·ml^-1、26.67μg·ml^-1、6.67μg·ml^-1、3.33μg·ml^-1)，按“2.2”项下色谱条件进行分析。以峰面积为纵坐标，以各标准品质量浓度(μg·ml^-1)为横坐标，绘制标准曲线，确定相关系数。以3倍信噪比计算检测限(lod)，以10倍信噪比计算定量限(loq)，结果见表4，各成分在其相应浓度范围内线性关系良好。

表410种成分hplc-dad分析的线性回归数据及lod、loq测定结果

2.5.2精密度

取s7号供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，测得10个特征峰的保留时间rsd分别为0.35％、0.23％、0.47％、0.47％、0.42％、0.39％、0.42％、0.37％、0.22％、0.02％，均小于1％；峰面积rsd分别为0.36％、0.50％、0.79％、2.12％、1.80％、2.67％、0.10％、1.83％、4.18％、4.45％，均小于5％，结果表明仪器精密度良好。

2.5.3重复性

取s7号样品6份，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，测得10个特征峰的保留时间rsd分别为0.04％、0.13％、0.23％、0.19％、0.22％、0.22％、0.24％、0.24％、0.37％、0.01％，均小于1％；峰面积rsd分别为1.02％、1.90％、1.52％、1.48％、1.43％、0.77％、0.39％、1.18％、2.21％、3.13％，均小于5％，结果表明方法重现性良好。

2.5.4稳定性

取s7号供试品溶液分别于0h、3h、6h、12h、18h、24h按“2.2”项下色谱条件进样分析，测得10个特征峰的保留时间rsd分别为0.67％、0.8％、0.85％、0.49％、0.51％、0.57％、0.56％、0.47％、0.22％、0.01％，均小于1％；峰面积rsd分别为1.48％、2.32％、3.27％、4.65％、1.82％、2.27％、3.37％、2.46％、1.33％、3.74％，均小于5％，表明样品在24h内化学性质稳定。2.5.5回收率实验

取同一批号的样品，分别按已知含量80％、100％和120％共三个水平加入对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，以上述色谱条件分别测定辛弗林、绿原酸、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖-7-o-β-d-龙胆双糖苷、金丝桃苷、连翘酯苷a、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、连翘苷、3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的含量并计算回收率。从表5可知，本方法的回收率良好。

表5加标回收率

2.5.6样品测定

按上述“2.1.2供试品溶液的制备”方法制备样品溶液，按“2.2色谱条件”分别测定10个批次小儿消积止咳口服液样品中10种化学成分的含量(见表6)。从表中可以看出，10批样品中各化合物的rsd在2.38-4.89％之间，说明不同批次样品中各成分的差异性不大。其中，新橙皮苷和辛弗林的含量最高，柚皮苷、3,29-二苯甲酰基栝楼仁三醇、橙皮苷次之，连翘酯苷a、连翘苷、绿原酸、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖-7-o-β-d-龙胆双糖苷的含量依次减少，金丝桃苷含量最少。

表6样品中10种成分含量(μg·ml^-1)测定结果(n＝10)

2.6指纹图谱

2.6.1指纹图谱的建立

按“2.1.2”项下方法处理10个批次小儿消积止咳口服液样品制备成供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，不同批次小儿消积止咳口服液的hplc指纹图谱见图2。在样品的色谱图中选择了38个分离度较好且稳定出现的峰作为“共有峰”。各色谱峰保留时间rsd％均在1％以内，峰面积rsd均在5％以内，说明不同批次试剂的各共有峰重现性较好，可以选为指纹图谱的共有峰用于其质量评价。2.6.2相似度评价

采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004a版)对10批小儿消积止咳口服液样品的hplc指纹图谱进行分析与评价，各批次试剂图谱相对于上述标定的38个共有峰的相似度结果见表7。从表7中可看出小儿消积止咳口服液各批次间质量差异性较小。

表7相似度评价结果

3讨论

3.1色谱条件的优化

小儿消积止咳口服液共由10种中药配伍而成，化学成分含量较多。为了获得最佳的色谱分离效果和较少的分离时间，在本文中对色谱柱类型、流动相组成、梯度洗脱程序、流速、柱温和检测波长等色谱条件进行了考察。

在相同的梯度和流动相条件下，考察了3根不同的反相色谱柱，即agilentzorbaxsb-c18、agilenteclipsexdb-c18、watersxselect^tmhsst3的分析效果。结果watersxselect^tmhsst3柱分离效果较好。进一步对比了甲醇-水和乙腈-水体系组成的各种流动相的分离效果，结果发现乙腈-水体系对样品的色谱峰分离效果更好。在不同的梯度洗脱模式下对一些改性剂包括不同比例的甲酸和冰醋酸也进行了研究，考虑到峰的对称性、分离度以及分离时间等因素，发现乙腈-0.4％冰醋酸水溶液的梯度洗脱模式更适合于分离研究。不同流速(0.4、0.6、0.8、1.0ml·min^-1)以及柱温(25、30、35℃)对色谱分离效果的影响也做了相应的研究对比。发现当流速为0.6ml·min^-1时柱效高，可缩短分析时间且不影响分离效果，故选择0.6ml·min^-1的恒定流速；而柱温对分离效果影响较小，故柱温选择25℃。通过紫外检测器在190～400nm波长范围内对样品进行检测，结果显示在254nm时样品溶液中色谱峰个数较多且各峰比例适中，基线较平稳。

3.2质控指标的选择

小儿消积止咳口服液系根据中医对小儿食积咳嗽发病机理的认识和古医籍治疗食积咳嗽的有关方药并结合其长期临床经验研制而成。具有清热肃肺、消积止咳的功效，针对食积咳嗽有很好的疗效。方中山楂、槟榔，消食导滞为君药，以治其本，食积得消，则蕴郁的痰浊无以依附，生热生痰无源。以枇杷叶、瓜蒌、桔梗、连翘清肺化痰，宣散肺气为臣药，使咳嗽易愈。葶苈子泻肺平喘，菜菔子消食化积兼降气化痰，蝉蜕清肺热、宣肺气，枳实行气消痰，以上均为佐药。桔梗除宣肺祛痰止咳外，还能引导诸药直达病所，是为使药。本研究结合中药“君臣佐使”配伍原则，并参考《药典》中单味药质控指标和小儿消积止咳口服液指纹图谱共有峰指认结果来选择质控指标，建立其多指标定量指纹图谱，以提高质量控制的整体性和特征性。

4小结

鉴于现有的小儿消积止咳口服液含量测定指标较为单一，其检测指标在实际生产过程中难以实现对该制剂质量的全面控制。本文中首先采用hplc-dad-esi-tof/ms法对该制剂中的多种活性成分进行鉴别分析,在此基础上结合中药“君臣佐使”配伍原则并结合《药典》中单味药质控指标来选择中成药质控指标，对其进行含量测定，进一步结合中药色谱指纹图谱，用于其质量控制。本文为小儿消积止咳口服液的整体质量评价研究提供了较为全面的方法和技术支持。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。