用于免疫组化物检测配合显微镜载物片的生物盖片的制作方法

本发明属于医疗器械领域，具体的涉及一种用于免疫组化物检测配合显微镜载物片的生物盖片。

背景技术：

用于生物样本(诸如解剖学病理样本)的处理方法和自动处理的仪器是众所周知的。这种处理方法可包括在免疫化学、原位杂交、特殊染色和细胞学中典型的那些类型的染色过程。在传统的实验方式中，操作人员采用免疫组织化学的方法对生物样本进行检测，需要经历至少六十多道工序，花费至少5个多小时，时间长、程序繁琐。目前，国内外各大医院以及检测机构、实验室采用的自动检测仪器如德国莱卡公司生产的bond-max型号的设备，瑞士罗氏公司生产的benchmarkxt全自动免疫组化染色仪等，利用检测设备将上述工序自动化，极大地提高了病理测试可以完成的速度，从而导致了更早的诊断，并且在某些情况下，导致了更早的干预。通常在被置于显微镜载玻片上的样本上执行染色以便突出显现生物样本中的某些组织学特征。

但是在一些情况下，自动仪器实现的染色、杂交等是不均衡的或不可靠的，病理学家因此无法接受或使用检测的结果。检测失败的原因可能是试剂(反应液)中的气泡、来自于试剂的残渣或者其他，这种情况下，将造成对仪器和试剂的极大浪费。现有技术中公开了一种带有一体的贮槽的显微镜载物片盖(cn100342973c)，提供了用于显微镜载物片的盖子，包括形成一空腔的本体，用于放在显微镜载物片上形成一个反应腔室，以及从本体的一端延伸的突出部分，以在突出部分和位于盖子的两侧上的腿部之间形成一流体贮槽，当盖子装于显微镜载物片时该流体贮槽与空腔流体连通。

在应用过程中，反应腔室即为样品与反应液进行反应的空间，在这个空间中要尽量避免气体的产生，又需要适当的减少反应流体的用量，因此，通过在流体贮槽一端加入反应液，盖子与载物片的贴合的平面是呈一定倾斜角度的，利用流体的重力以及狭窄空间对于液体的虹吸现象，使反应液进入反应腔室，并且将其中的气体赶出反应腔室，反应液的用量一般大约为100-200微升，这个反应腔室的容积大概为110微升，使整个反应腔室被反应液充满。由于反应腔室的厚度非常的薄，如果反应腔室仅通过流体贮槽与外部连通，反应液将无法进入反应腔室，至少无法将其中的气体(空气)完全赶出。该盖子是采用在盖子相对于流体贮槽的另外一侧作为流体的流出口，反应液通过这个流口的口子，将反应腔室中的气体赶出，并且利用液体的张力，使反应腔室中保持被液体全部充满而不至于使反应液全部流出。

但值得注意的是，采用这种方式，这将导致一个无法避免的问题：1、为了保证液体充满反应腔室，通过流体贮槽加入的反应液的量将大大超过反应腔室的容积，因此在该技术方案公开的技术中有流体贮槽的容器超过反应腔室容积的50％，而实际操作过程中反应液的需求量还更多。同时，随着反应液的不停加入，反应液也将通过流出的口子不停的流出，这将造成反应液的极大浪费。2、由于加液过程中，前期进入反应腔室的反应液与样品已经进行了接触和反应，产生了反应效果，但因为反应液的不停加入，前期进入反应腔室的反应液将被排出反应腔室，这部分反应液与样品反应的结果将无法在反应结束后进行观察，即反应效果将因为反应液的大量使用而被稀释，影响对反应结果的视觉观测，会导致检测结果出现更大的偏差。3、由于现有技术中盖子中的反应腔室与外界的接触面积较大，因此蒸发量也大。特别是反应液与样品反应过程中需要加热，此时液体因受热膨胀，蒸发量更大，为了减少蒸发，现有技术中必须在反应液中添加大剂量的防沸物质。但随着防沸物质的比重增加，反应液中的有效成分比重减小，反应液与样品反应的效果受影响。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的反应液用量大、反应液与样品反应后的色相容易冲淡以及防沸物质用量大影响反应效果的问题，本发明通过改变反应液在反应腔室中的进出方式，达到节约反应液、保持反应品相和降低防沸物质占比的目的。具体提供了一种用于免疫组化物检测配合显微镜载物片的生物盖片，具有一个本体，所述本体的下部形成一个与显微镜载物片配合的凹部，定位在显微镜载物片上时，所述凹部周围结构与载物片上表面紧密贴合，形成一个贮液腔；还包括一加液部，所述加液部与贮液腔连通；所述本体中还包括排气孔，所述排气孔位于贮液腔相对于加液部的另一端；所述贮液腔仅通过加液部、排气孔与外部连通。

本体上的凹部，并不拘泥于一种规则形状，其截面既可以为长方形，也可以是圆形、椭圆形，甚至是其他不规则形状，但需要满足检测生物样品的最低要求，即盖片与显微镜载物片贴合后，形成的贮液腔，应满足检测之需要，一般其容积为50-200微升。

进一步，对于形成的贮液腔，在厚度上，优选的应该是0.1mm-0.2mm。实际应用中，盖片定位在载物片上时，整体结构具有一定的倾斜角度，一般为5°-10°左右，这样可以使反应液在重力的作用下进入贮液腔，并且将贮液腔中的空气赶出。当然，如果盖子与载物片的贴合平面没有倾斜角度，通过虹吸现象，也是可以使液体进入贮液腔的。

随着反应液的进入，贮液腔中的气体(基本上是空气)从排气孔中被挤出。排气孔位于本体中的意思表示是：排气孔是本体上开设的一个孔，其并不在本体的哪个边缘位置，其应该是贯穿本体的，其截面的形状可以是多种的，最重要的是需要达到排气的功能，同时至少在排气孔的部分位置的截面上，不应当有缺口。进一步，排气孔可以有多个，但至少有1个排气孔位于本体凹部的顶部位置，这样的目的就在于，在往贮液腔中加入反应液时，可以使反应液充满整个贮液腔；同时，如果有多个排气孔，且在使用过程中处于不同的高度，那么其处于最低处的那个排气孔的顶部位置，不应低于贮液腔的顶部位置，这样就避免了反应液从最低处的排气孔漏出。

优选的是，上面所述的排气孔，其相对于本体来说更加的高，即排气孔在本体的上部形成一个凸起的凸台，整个排气孔比如说形成一个中空的圆柱体，这样做的目的在于延长气体排出时的长度。因为在注入反应液后，因为需要对待测的物质进行加热，反应液将随着加热而出现蒸发。通过加长排气孔，可以使蒸发出去的汽相反应液粘附在排气孔的内壁上，进一步减少反应液的损耗，同时，这样还可以在一定程度上避免反应台溢出。

本发明中，盖片定位在载物片上时，贮液腔中的气体通过排气孔排出，但进入至贮液腔中的反应液，由于贮液腔仅通过排气孔与加液部与外界连通，反应液将贮液腔中气体挤出后，在排气孔口利用液体的张力，使加液口的液体无法加入，此时，贮液腔中完全被反应液充满。此时，由于反应液无法继续进入贮液腔，也不会从贮液腔中流出，可以根据需要精准地往贮液腔中加入反应液，就避免了反应液的浪费；同时，实际操作中，进入贮液腔的反应液与样品进行接触，其任何一部分反应液与样品反应的效果均被很好地保持在贮液腔中，而不会像现有技术中一部分与样品接触并发生过反应的反应液流失，导致观察结果的不准确；再者，采用排气孔排气，反应液与外界环境的接触面积小，在加热过程中蒸发量也小，在这种情况下，就可以使用防沸物质占比少的反应液，可以更进一步的增强反应效果，提高检测的准确性。

优选的是，所述加液部包括补充腔室和加液口，本体定位在显微镜载物片上时，所述凹部形成补充腔室与贮液腔。这个补充腔室更接近于加液口，反应液通过加液口进入补充腔室，尔后再进入贮液腔。补充腔室与贮液腔，可以通过形成不同的厚度进行区分，补充腔室的厚度大约在0.5-2mm之间。

进一步，所述补充腔室的厚度大于所述贮液腔；盖片定位在显微镜载物片上时，所述贮液腔仅通过所述排气孔、加液部的加液口与外部连通。补充腔室的厚度大于贮液腔，通过加液口将反应液注入补充腔室，利用液体自身的重力，使补充腔室的反应液进入贮液腔与生物样品进行接触并反应，而补充腔室中仍然停留一定量的反应液。因为整个生物样品的检测过程工序复杂，需要反应液多次加入与流出，同时有的工序，反应液与样品反应结束后，还需要利用反应液对样品及贮液腔进行冲洗。反应液与样品反应结束后，拖动盖片，使反应液流出，此时，补充腔室中停留的反应液即可进入贮液腔，对样品进行冲洗，为下一步加入反应液进行反应作好准备。通过设计补充腔室，可以减少反应液注入的工序，提高了工作效率。

优选的是，盖片定位在显微镜载物片上时，所述加液口从所述补充腔室向外延伸，位于所述本体中。加液口的位置选择，主要是需要实现往贮液腔注入液体，或者往补充腔室中注入液体，然后补充腔室中的反应液再进入贮液腔。加液口的设计，可以实现反应液的快速进入贮液腔，提高了检测的效率。特别是在所述的凹部分为贮液腔和补充腔室的情形下，可以根据反应所需要的量，快速将反应液加入至补充腔室。此时，反应液再由补充腔室进入贮液腔。这样有两个好处：一是精准定量，根据检测需要从加液口加入反应液，与现有技术相比，节约了反应液，降低了检测成本；二是加快了反应液加入的速度，提高了检测效率。

进一步，盖片定位在显微镜载物片上时，所述凹部与显微镜载物片结合处远离所述贮液腔的一端形成缺口，所述缺口与所述显微镜载物片围成所述的加液口。这是本发明的一种变形，基本设计思路保持不变，同时凹部处仍然可以分成贮液腔和补充腔室，通过这个缺口与载物片形成的加液口，向补充腔室加入液体。

进一步，所述加液部为凸出所述本体上表面且具有一定高度的加液孔。这是一种变形的方式，即加液部仅为凸出本体上表面的加液孔，这个加液孔的容积大于检测所需反应液用量的200微升，利用液体的重力，使反应液进入到贮液腔，并将贮液腔中的气体从排气孔赶出。这样设计简单易操作，只要加液孔的容积满足要求，且保证加热过程中样品放置的部位浸入在反应液中，就可以根据外部设备的尺寸设计所述加液孔的高度。

优选的是，所述本体在所述排气孔的一端延伸，还包括用于与外部机械结构连接的连接部。本发明所述的盖片，并不排除利用手动操作的方式进行样品的检测，只要操作得当，检测人员仍然可以通过手动方法实现检测目的。而在盖片的一端设置连接部，是有助于采用机械结构控制盖片动作的一种方式。由于生物样品检测需要多达几十道工序，现有技术中可以采用机械结构，通过计算机程序实现对反应液进入贮液腔以及排出贮液腔的智能控制。比如说盖片运用的载体为某些现有品牌的检测仪时，盖片通过连接部连接在仪器的机械结构上动作。其动作的一般流程是：将盖片置于架子上，通过一拉片装置将盖片在在玻片上拖动，达到染色和排液的目的。

另一方面，将生物样品放置在载物片上，盖片定位在载物片的位置，反应液与样品反应过后需要排出，此时仪器内的风机将在贮液腔中产生一定的负压，使反应液能够更彻底的排出。由于样品检测过程中不同的步骤使用的反应液不同，可以减少不同反应液之间的干扰。

优选的是，在本体相对于所述连接部的另外一端的两侧，还包括具有导向作用的导杆。导杆的作用是将盖片卡置在仪器的固定装置上，使本体更佳地定位在载物片上，并且根据检测过程的要求，在预定的轨迹上进行滑动。同时，也有利用盖片在不同动作中的定位，使盖片的位置能够满足检测的要求。

优选的是，所述凹部的表面具有不沾水涂层。不沾水涂层的作用是使得反应液在排出的时候，在负压和重力的共同作用下，将反应过后的反应液排出的更加干净彻底。这种不沾水涂层可以是二氧化硅或者其他具备这种功效的材质。

本发明是相对现有技术的优点在于：

一是在加入反应液的过程中，不会出现反应液满溢出来的情况，实现了检测过程中反应液的定量加入，节约了检测成本。

二是在每一个加入反应液的步骤中，与样品接触的反应液均保持在贮液腔中，样品与反应液反应出的结果都会保持住，不会出现反应结果被冲淡的情况，使检测都更容易观察检测效果。

需要说明的是，免疫组化主要步骤分为，烤片，脱蜡，修复，染色等步骤，其中烤片是不需要用到反应液的，其余步骤均需要用到反应液，而在这其中，染色步骤使用的反应液较为昂贵。

以目前市场上运用的莱卡公司生产的盖片为例，莱卡的盖片在机器上加入价值高的反应液(常用名：抗体)分为两个不同的容量，一个为100微升，一个为150微升，正因为价值高，所以在降低液体使用量的同时而不使效果降低则是极为重要的，其中液体的容量与盖片相对玻片形成的容积有关，莱卡的盖片容积为110微升左右，如果再初始位置加入液体，则需要的液体容量远远超过100微升，所以，莱卡的盖片中100微升位置处在玻片的中间，这对待测样品的要求较高，必须处于盖片的下部，否则无法进行染色，也就意味着结果会出现偏差，这是不允许的。其次，莱卡的盖片在加液中存在稀释反应液的问题，也就是说在加入抗体的时候，莱卡盖片存在抗体有效成分被稀释，这对于反应液的用量或者说是浓度有着较高的要求，也就意味着需要付出更高的代价得到实验较为清晰的观察效果。

所以，为了解决这些问题，我们在盖片的设计上采用封闭设计，其中腔室的容积减少，且实现样本的覆盖，降低样品暴露的可能性。在稀释的问题上，我们采用将液体排干，减少稀释，让有效成分充分得与样品进行接触和反应，提供更好的观察效果。

三是反应液中的防沸物质减少了用量，使得反应液中的有效成分增加，更好地增强了反应效果；四是加液部的形式比较灵活，可以实现一次性加入反应液，尔后再依靠反应液自身的重力，使反应液进入贮液腔，提高了检测的效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是对本发明的实施例的描述，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据技术方案进行简单变形或者名称变化，或者是采取惯用手段，也可以实现发明目的。

图1为实施例1中所述生物盖片的立体图

图2为实施例1中所述生物盖片的俯视图

图3为实施例1中所述生物盖片的正视图

图4为实施例1中所述生物盖片的仰视图

图5为实施例1中所述生物盖片的底面视图

图6为实施例1中所述生物盖片定位在显微镜载物片时的示意图

图7为实施例1中所述生物盖片在反应液排出时的位置

图8为实施例2中所述生物盖片的立体图

图9为实施例3中所述生物盖片定位在载物片时的立体图

图10为实施例4中所述生物盖片的立体图

图11为实施例5中所述生物盖片的局部示意图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1。

如图1到4所示，本实施例详细介绍一种用于免疫组化物检测配合显微镜载物片的生物盖片，盖片具有一个本体，本体上有一块基片1，基片的下部四周为四条方棱2，并形成一个长方形槽，本实施例中的长方形槽，相当于前述的凹部。长方形槽的规格是46mm×20.6mm，基片上的四条方棱与载物片接触的面，是处于同一平面的，用以保证长方形槽与载物片紧密贴合，当盖片定位在显微镜载物片3上时，盖片上的方棱2与载物片3形成了一个贮液腔4和一个补充腔室5，贮液腔4和补充腔室5均是长方形槽的一部分，在盖片与载物片3分离状态时示出。补充腔室5的主体厚度为1mm，贮液腔4的厚度为0.12mm，如图5所示，补充腔室5与贮液腔4通过一个斜坡6进行分隔。这个斜坡制成一个倒圆角，这样有利于反应液进入贮液腔，同时可以防止贮液腔与补充腔室衔接处出现反应液粘附的问题。整个补充腔室的容积略大于200微升。

在基片中，有一个加液口7，加液口贯穿基片，与补充腔室连通，加液口与补充腔室共同构成了发明内容中的加液部。在基片中还包括一个排气孔8，排气孔8位于贮液腔相对于补充腔室5的另一端，具体的为靠近远离补充腔室的那边方棱21；从图中我们可以看到，贮液腔4仅通过与补充腔室5连通的加液口7、排气孔8与外部进行连通。

本实施例还包括两段导杆9，导杆位于基片1的的一端，在本实施例中位于补充腔室的那一端，从基片位置向大致平行基片的两侧延伸。两端导杆卡入仪器固定部位处，使盖片沿着限位用的轨道进行动作。本实施例中，在盖片的贮液腔一端，本体延伸段还包括有一个连接部10，这个连接部是连接到仪器的外部机械结构上，外部机械结构可以根据每一步骤需要实施的动作，按照仪器预设的程序，对盖片进行一系列地拉动、归位等动作。盖片定位在载物片上时，整体结构具有5°的倾斜角度。

对于本实施例，最优选的方案是，本体、导杆9和连接部10是一体成型，其中本体上的四根方棱2、基片1也是一体成型，这样的结构稳定性好。

对于某一种可以实现生物样品检测的仪器来说，其利用本实施例中的盖片，进行样品检测的步骤大致为：1、将待检测的生物样品放置在显微镜载物片上；2、将载物片放置在仪器的指定位置；3、盖片被限定在仪器的指定位置；4、根据预定程序，盖片被定位在载物片上，此时盖片与载物片形成贮液腔、补充腔室，值得注意的是，此时盖片与载物片所接触的平面，是具有一定倾斜角度的，而样品所处的区域，是在贮液腔的位置；5、仪器根据预设程序，通过加液口向补充腔室迅速加入约200微升反应液；6、反应液经补充腔室，在重力以及虹吸现象的作用下，进入至贮液腔，与样品进行接触并反应；7、贮液腔中的气体逐渐被反应液挤出，整个腔体被反应液充满；8、仪器开始加热，反应液受热与样品进行反应；9、反应结束，此时观察并记录反应结果；10、仪器根据预设步骤，通过连接部向外拉动盖片，反应液流出，此时因为仪器本身具有xx部件，增强了盖片贮液腔的负压，使反应液可以更加干净地流出；同时，在某些步骤中，补充腔室中还有存留的反应液，可以对样品表面进行冲洗；11、通过连接部的回复，盖片回到原来位置，再重复进行下一次动作。

当然，本实施例使用的对象是针对某些可以适用的仪器，而如果不需要仪器，对于生物样品检测各个不同环节进行人工操作的话，本实施例中导杆、连接部是不必要的。那就是说，只需要加上一些额外的操作，比如说，在本体上，或者在盖片对应使用对象的载物片上设计一个扣紧装置，使盖片固定在载物片上，通过人工进行加热等，也是可行的。

本实施例中可以使用多种反应液，比如现在常用的有脱蜡液、清洗液、修复液、酒精等液体。在一些需要加热的步骤中，所用到的反应液中防沸物质(比如甘油)含量低，与样品可以进行反应的有效成分高，较好地提高的反应的效果，节约了成本。

实施例2

如图8所示，本实施例与实施例1的不同点在于，长方形槽并不分割成贮液腔及补充腔室，而仅有贮液腔。盖片定位在载物片的接触面仍然具有一定的倾斜度。加液部是贯穿基片的一个加液柱11，其高度为2mm，横截面为圆环形，加液柱11的容积为50微升，加液柱的形状和规格是受到配合使用的仪器的限制的。往贮液腔4中加入反应液时，反应液在重力的作用下，进入贮液腔4与样品进行接触和反应。排气孔的孔径较小，由于反应液中加入了防沸物质，反应液无论是在常温状态下或者加热状态下，均具有一定的张力，可以防止反应液从排气孔中溢出。当然，在某些环节，由于加液柱11中的反应液在将贮液腔中气体完全赶出后，其中仍存储有一定量的反应液，用于后期对特征样品的冲洗，而这些液体保持的高度，不会使在重力作用下继续进入，而将里面的液体从排气孔中赶出。基于这个原因，本实施例中，加液柱的高度实际为2mm,而排气孔的孔径为1mm，盖片定位在载物片的接触面的倾斜角度为5°。

实施例3

如图9所示，本实施例与实施例1的不同之处在于，加液口的位置不同。实施例1中的加液口位于基片上，而本实施例中，加液口7是这样的：在本体上相对于贮液腔的另一端的方棱21，具有一个斜切面，这个斜切面在盖片定位在载物片3上时，即形成了加液口7。在这个加液口7上，也可以形成倒圆角，便于反应液顺利进入补充腔室，尔后通过补充腔室进入贮液腔。

当然，还有另外一种更进一步的设计，即加液口7就是的两端形成一定的角度，缺口处形成一种漏斗式的形状。这样设计的加液口，在工业生产上比较容易实现。

实施例4

如图10所示，本实施例与图9所示实施例3的不同之处在于，排气孔具有两个，均靠近远离加液口的方棱，贯穿基片，使贮液腔通过两个排气孔与外部连通。这样有利于加速贮液腔内部的气体向外排出。

实施例5

如图11所示，本实施例与实施例1的不同点在于，排气孔8在本体的基片形成了一个中部透空的圆柱形凸台。这个凸台的作用在于可以延长加热过程中反应液的汽化的排气长度，使汽化的反应液会粘附在排气孔的内壁上，减少反应液的损耗；另外，还可以有效地避免反应液在注入过程中溢出。

实施例6

本实施例与实施例1的不同点在于，实施例中的长方形槽内具有一层不沾水涂层，这一涂层为二氧化硅。内部涂有一层不沾水涂层，可以降低反应液与长方形槽内侧的粘附，提高反应液进入及排出补充腔室、贮液腔的效率。

本发明中，我们利用莱卡原装盖片、实施例1中的盖片与实施例5中的盖片，对生物样品进行检测，形成了一个对比数据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的变动与润饰，均应属于本发明的保护范围。