一种基于表面增强拉曼光谱的乙酰胆碱检测方法与流程

本发明涉及一种基于表面增强拉曼光谱的乙酰胆碱检测方法,属于生物光子学和纳米光子学技术领域。

背景技术：

神经递质是神经元之间传递信息的重要物质，也是中央神经系统控制和调节人体生理功能的重要途径，任何一种神经递质的失衡会引起一系列相关疾病，比如帕金森、抑郁症、阿尔茨海默症等。因此，准确有效的检测神经递质浓度对于相关疾病的临床诊断和治疗以及研究神经递质的作用机理等都具有深远意义。

乙酰胆碱是人体内非常典型的一种神经递质，也是中枢胆碱能系统中重要的神经递质之一。乙酰胆碱在人体内的浓度水平和人体认识活动密切相关，对于维持人体意识清醒、调节学习记忆能力有着重要作用，有研究发现人体内的乙酰胆碱浓度还和阿尔茨海默病显著相关，乙酰胆碱含量增多有助于阿尔茨海默病的症状改善。目前对乙酰胆碱的检测方法，主要有荧光检测、高效液相色谱法检测、电化学检测等。以荧光检测为例，通常需要多次酶催化反应将乙酰胆碱逐步转化成对某些荧光分子敏感的物质后再进行荧光检测，其操作过程较为冗长、成本较高且转化效率有限；高效液相色谱法、电化学检测通常存在成本高、操作复杂、耗时较长、灵敏度不够等不足之处。表面增强拉曼光谱(sers)是一种高灵敏、快速、低成本的一种光谱检测手段，但是乙酰胆碱本身的sers活性低，直接利用表面增强拉曼散射对乙酰胆碱进行检测的灵敏度难以应付生理环境下乙酰胆碱的痕量检测。因此，一种高灵敏、低成本、简单有效快速的乙酰胆碱检测方法仍然是迫切需求的，对于临床诊断和研究应用都具有重要价值。

技术实现要素：

技术问题：本发明的目的是提供一种基于表面增强拉曼光谱的乙酰胆碱检测方法，该方法利用乙酰胆碱和有机分子在表面增强拉曼散射衬底上的竞争作用，不同浓度的乙酰胆碱会对有机分子在表面增强拉曼散射衬底的吸附产生不同程度的影响，从而产生不同强度的表面增强拉曼散射信号，结合表面增强拉曼光谱，建立起有机分子的表面增强拉曼光谱强度和乙酰胆碱浓度之间的对应关系，从而实现对乙酰胆碱高灵敏、低成本、简单快速的检测。

技术方案：本发明提供了一种基于表面增强拉曼光谱的乙酰胆碱检测方法，该方法包括以下步骤：

1)利用金属纳米材料制备表面增强拉曼散射衬底：根据静电作用的原理，利用聚合物分子对玻璃基底或硅基底表面进行改性，使玻璃基底或硅基底表面电性与金属纳米材料所带电荷电性相反，从而利用静电作用将金属纳米材料吸附在玻璃基底或硅基底表面，形成表面增强拉曼散射衬底。

2)将乙酰胆碱和有机分子溶液加至表面增强拉曼散射衬底表面进行反应，且乙酰胆碱与所述有机分子竞争性吸附于表面增强拉曼散射衬底表面；

3)检测表面增强拉曼散射衬底表面上有机分子的拉曼光谱，根据乙酰胆碱浓度和有机分子表面增强拉曼光谱之间的校准曲线，实现对乙酰胆碱的定量检测。

其中：

步骤1)所述的利用金属纳米材料制备表面增强拉曼散射衬底的具体步骤如下：

①当金属纳米材料表面带负电荷时，将清洗吹干的玻璃基底或硅基底与0.02wt％以上的聚二烯丙基二甲基氯化铵、3-氨丙基三乙氧基硅烷或3-氨丙基三甲氧基硅烷水溶液反应30min以上，清洗残余的反应溶液后将该玻璃基底或硅基底与金属纳米溶液反应30分钟以上，去除残余金属纳米溶液得到表面增强拉曼散射衬底；

②当金属纳米材料表面带正电荷时，将清洗吹干的玻璃基底或硅基底先与0.02wt％以上的聚二烯丙基二甲基氯化铵、3-氨丙基三乙氧基硅烷或3-氨丙基三甲氧基硅烷水溶液反应30min以上，之后再与0.02wt％以上的聚丙烯酸钠或聚苯乙烯磺酸钠水溶液反应30min以上，清洗残余的反应溶液后将该玻璃基底或硅基底与金属纳米溶液反应30min以上，去除残余金属纳米溶液得到表面增强拉曼散射衬底。

所述的清洗吹干的玻璃基底或硅基底是指经过食人鱼溶液清洗1h以上并经氮气吹干的玻璃基底或硅基底。

步骤3)所述的乙酰胆碱浓度和有机分子表面增强拉曼光谱之间的校准曲线绘制过程如下：保持有机分子浓度不变，改变乙酰胆碱浓度，检测有机分子的表面增强拉曼光谱强度，根据检测到的有机分子的表面增强拉曼光谱强度和所用的乙酰胆碱浓度之间的对应关系，建立乙酰胆碱浓度和有机分子表面增强拉曼光谱之间的校准曲线。

所述的金属纳米材料为金纳米材料、银纳米材料。

所述的表面增强拉曼散射衬底具有粗糙金属表面，能够吸附乙酰胆碱和与乙酰胆碱具有竞争性吸附作用的有机分子，并产生表面增强拉曼散射效应。

所述的有机分子为括罗丹明6g、罗丹明b、结晶紫、尼罗蓝、亚甲基蓝或中性红中的一种。

所述的有机分子的浓度为10nm以上。

所述的将乙酰胆碱和有机分子溶液加至表面增强拉曼散射衬底表面进行反应，其反应时长为10min～120min。

步骤3)所述的检测表面增强拉曼散射衬底表面上有机分子的拉曼光谱，所用仪器为拉曼光谱仪。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1、利用乙酰胆碱和有机分子在表面增强拉曼散射衬底表面上的吸附竞争作用，建立起乙酰胆碱浓度和有机分子吸附之间的对应关系，由此提出了一种检测乙酰胆碱的新方法；

2、利用表面增强拉曼光谱对有机分子进行检测，实现了对乙酰胆碱的高灵敏、低成本检测，且操作简单、耗时短；

其三，通过对有机分子种类和浓度的选择，可以调节对乙酰胆碱的浓度检测范围。

附图说明

图1：基于表面增强拉曼光谱的乙酰胆碱检测方法原理示意图；

图2：实施例1中检测不同浓度乙酰胆碱的表面增强拉曼光谱结果图；

图3：实施例2中检测不同浓度乙酰胆碱的表面增强拉曼光谱结果图；

图4：实施例3中检测不同浓度乙酰胆碱的表面增强拉曼光谱结果图；

图5：实施例4中检测不同浓度乙酰胆碱的表面增强拉曼光谱结果图。

具体实施方式

下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

实施例1

该实施例中涉及的食人鱼(piranha)溶液为质量分数98％的浓硫酸和质量分数30％的双氧水按体积比3：1比例混合而成。

1、制备银胶溶液：将11mg硝酸银溶解在61.25ml去离子水中，加热搅拌至沸腾后，加入1.25ml1％重量百分比的二水合柠檬酸三钠溶液，继续反应50分钟后停止加热，自然冷却后得到银胶溶液，待用；

2、制备表面增强拉曼光谱(sers)衬底：将玻璃片用piranha溶液浸泡清洗后用去离子水将玻璃片上残余的piranha溶液冲洗干净，放入烘箱100℃烘干两小时；之后将烘干的玻璃片和干净的聚二甲基硅氧烷(pdms)芯片键合，得到微流控芯片；将1wt％的聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)水溶液注入微流控芯片反应1h后用去离子水将未反应的残余pdda冲洗干净；之后再将步骤1制备的银胶溶液注入微流控芯片反应1小时后用去离子水将未反应的残余银胶溶液冲洗干净，在微流控芯片中的微流通道内得到银胶sers衬底。

3、sers光谱检测：分别将不同浓度的乙酰胆碱和1μm罗丹明6g混合溶液注入上述微流芯片不同微流通道内，反应10min后用去离子水将未反应的残余混合溶液冲洗干净，用拉曼光谱仪测量罗丹明6g的sers光谱，将测量得到的罗丹明6g的拉曼光谱强度与罗丹明6g的拉曼光谱强度和乙酰胆碱浓度之间的对应关系图谱进行对比，实现对乙酰胆碱的定量检测。

实施例2

该实施例中涉及的食人鱼(piranha)溶液为质量分数98％的浓硫酸和质量分数30％的双氧水按体积比3：1比例混合而成。

1、制备金核银壳纳米棒

1)依次往2.5ml、0.2m的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中分别加入1.5ml、1mm的氯金酸溶液和600μl、0.01m硼氢化钠溶液，搅拌反应2min形成种子溶液待用；

2)依次往2.5ml0.2m的ctab溶液中分别加入250μl、15mm硝酸银溶液和1.25ml、15mm氯金酸溶液，再加入0.08m抗坏血酸至溶液无色，之后加入种子溶液125μl反应后形成金纳米棒待用；

3)2ml金纳米棒溶液和0.0728g的ctab混合后依次加入4ml去离子水、260μl、0.1m抗坏血酸溶液、200ul、15mm硝酸银溶液、480μl、0.1m氢氧化钠溶液搅拌反应生成金核银壳纳米棒待用。

2、制备金属sers衬底：将硅基底用piranha溶液浸泡清洗后用去离子水将玻璃片上残余的piranha溶液冲洗干净，放入烘箱100度烘干2小时，之后将烘干的硅基底和干净的聚二甲基硅氧烷(pdms)芯片键合，得到微流控芯片；将1wt％的3-氨丙基三甲氧基硅烷水溶液和2wt％的聚苯乙烯磺酸钠(pss)水溶液依次分别注入微流控芯片反应1小时后用去离子水冲洗干净；最后将金核银壳纳米棒溶液注入微流控芯片反应1小时后用去离子水将未反应的残余金核银壳纳米棒溶液冲洗干净，在微流控芯片中的微流通道内得到金核银壳纳米棒sers衬底。

3、sers光谱检测

分别将不同浓度的乙酰胆碱和0.1mm罗丹明6g混合溶液注入上述微流芯片不同微流通道反应120min后用去离子水将未反应的残余的混合溶液冲洗干净，用拉曼光谱仪测量罗丹明6g的sers光谱，将测量得到的罗丹明6g的拉曼光谱强度与罗丹明6g的拉曼光谱强度和乙酰胆碱浓度之间的对应关系图谱进行对比，实现对乙酰胆碱的定量检测。

实施例3

该实施例中涉及的食人鱼(piranha)溶液为质量分数98％的浓硫酸和质量分数30％的双氧水按体积比3：1比例混合而成。

1、制备金胶溶液：将100ul质量分数10％的氯金酸溶液加入100ml去离子水中，加热搅拌至沸腾后，加入4ml1％重量百分比的二水合柠檬酸三钠溶液，继续反应50分钟后停止加热，自然冷却后得到金胶溶液，待用；

2、制备表面增强拉曼光谱(sers)衬底：将玻璃片用piranha溶液浸泡清洗后用去离子水将玻璃片上残余的piranha溶液冲洗干净，放入烘箱100℃烘干两小时；之后将烘干的玻璃片和干净的聚二甲基硅氧烷(pdms)芯片键合，得到微流控芯片；将0.02wt％的3-氨丙基三乙氧基硅烷水溶液注入微流控芯片反应1h后用去离子水将未反应的残余3-氨丙基三乙氧基硅烷冲洗干净；之后再将步骤1制备的金胶溶液注入微流控芯片反应1小时后用去离子水将未反应的残余银胶溶液冲洗干净，在微流控芯片中的微流通道内得到金胶sers衬底。

3、sers光谱检测：分别将不同浓度的乙酰胆碱和1mm罗丹明6g混合溶液注入上述微流芯片不同微流通道内，反应15min后用去离子水将未反应的残余混合溶液冲洗干净，用拉曼光谱仪测量罗丹明6g的sers光谱，将测量得到的罗丹明6g的拉曼光谱强度与罗丹明6g的拉曼光谱强度和乙酰胆碱浓度之间的对应关系图谱进行对比，实现对乙酰胆碱的定量检测。

实施例4

该实施例中涉及的食人鱼(piranha)溶液为质量分数98％的浓硫酸和质量分数30％的双氧水按体积比3：1比例混合而成。

1、制备银胶溶液：将11mg硝酸银溶解在61.25ml去离子水中，加热搅拌至沸腾后，加入1.25ml1％重量百分比的二水合柠檬酸三钠溶液，继续反应50分钟后停止加热，自然冷却后得到银胶溶液，待用；

2、制备表面增强拉曼光谱(sers)衬底：将硅基底用piranha溶液浸泡清洗后用去离子水将玻璃片上残余的piranha溶液冲洗干净，放入烘箱100℃烘干两小时；之后将烘干的玻璃片和干净的聚二甲基硅氧烷(pdms)芯片键合，得到微流控芯片；将2wt％的聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)水溶液注入微流控芯片反应2小时后用去离子水将未反应的残余pdda冲洗干净；之后再将步骤1制备的银胶溶液注入微流控芯片反应2小时后用去离子水将未反应的残余银胶溶液冲洗干净，在微流控芯片中的微流通道内得到银胶sers衬底。

3、sers光谱检测：分别将不同浓度的乙酰胆碱和0.01μm亚甲基蓝混合溶液注入上述微流芯片不同微流通道内，反应2小时后用去离子水将未反应的残余混合溶液冲洗干净，用拉曼光谱仪测量亚甲基蓝的sers光谱，将测量得到的亚甲基蓝的拉曼光谱强度与亚甲基蓝的拉曼光谱强度和乙酰胆碱浓度之间的对应关系图谱进行对比，实现对乙酰胆碱的定量检测。