一种同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法与流程

本发明属于蛋白检测方法，特别涉及一种同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，属于食品分析的免疫分析技术领域。

背景技术：

牛乳及其乳制品中含有丰富的蛋白质，几乎含有人体所有的必需氨基酸。在发达国家，乳蛋白及其制品提供了20％-30％的食物蛋白，是人们的重要蛋白质来源。尤其对于婴幼儿来说，牛乳是除了母乳之外的重要营养物质，但是牛乳又是较易引起过敏的食物之一。牛乳过敏对婴幼儿的健康成长已经造成了越来越大的影响，它可以引起婴幼儿腹泻、皮疹、缺铁性贫血、发育不良，严重时甚至可以引起喉头水肿和过敏性休克最终导致死亡。引起牛乳过敏的主要过敏原是乳蛋白，绝大多数牛乳蛋白都具有潜在的致敏性，其中的酪蛋白、p-乳球蛋白、a-乳白蛋白被认为是主要的过敏原。大量的流行病学研究表明，乳蛋白过敏在婴幼儿中最为普遍，发生率大约是2％-6％。据统计，大约有20％的婴儿在1岁时用牛奶喂养都会发生牛奶蛋白过敏。

牛乳中α-乳白蛋白占总乳清蛋白的22％，易溶于水，属于溶菌酶家族，呈球状，由123个氨基酸残基构成，分子量为14.4kda，含有4个二硫键。牛乳中α-乳白蛋白与人乳中α-乳白蛋白的同源性约为74％，另有6％的氨基酸残基化学性质相似。β-乳球蛋白是乳清中含量最多的蛋白，占乳清蛋白的50％，牛乳总蛋白的10％，在鲜牛乳中以36kda的二聚体形式存在，属lipoca1in蛋白，其单体由162个氨基酸残基组成。β-乳球蛋白不存在于母乳中，且胃蛋白酶不能将其消化水解，因此可通过胃肠道进入血液循环。据报道，这一类蛋白具有强致敏性，作为牛乳中的首要过敏成分，刺激婴儿免疫系统的发生超敏反应。乳铁蛋白是一种分子量约为80kd的铁结合糖蛋白，其来源主要是由动物的乳腺上皮细胞分泌。乳铁蛋白是人乳中的4种主要蛋白质之一，大约占人乳总蛋白的10％，它属于一种先天免疫系统的成分物质，可以促进铁元素的吸收，还具有抗菌杀菌、抗病毒及调节机体免疫反应等多种功能。婴儿出生后，自身免疫系统还没有完全健全，母乳中的乳铁蛋白是保证婴幼儿健康生长的一种重要物质，而大部分婴幼儿配方奶粉中几乎不含这种营养物质。在婴幼儿配方奶粉中添加使用牛乳铁蛋白，使其营养成分更接近母乳，对婴幼儿的生长发育极为重要；但是如果摄入过量，又会对婴幼儿的肝肾功能造成负担。

牛乳营养价值高、但致敏性强，而牛乳又常作为原料用于各种食品，所以开展针对食品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的检测方法具有重要的理论和现实意义。目前，国内外对食品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的检测方法包括：以检测蛋白为基础的免疫化学检测方法，如酶联免疫吸附法(elisa)和仪器检测方法高效液相色谱法(hplc)等。elisa一次只能检测一种蛋白，无法做到多指标同时检测。hplc法虽可同时检测多种蛋白但前处理操作繁琐，耗时长，且需要专业的技术人员进行操作，检测成本高。此外，hplc的检测灵敏度低，乳铁蛋白含量相对较低，无法和α-乳白蛋白、β-乳球蛋白同时检测。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种可同时检测食品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，在于弥补现有方法无法同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的空白，满足快速、高灵敏度，低成本检测要求。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明所述的一种同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，包括以下步骤：

(1)将α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品在载体片基内进行点样操作，然后固定、封闭、洗涤；

(2)在经由步骤(1)处理后的部分反应孔内加入不同浓度梯度的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品混合溶液和相应的混合抗体，在剩余反应孔内加入待测样品溶液和α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白混合抗体，然后所有反应孔反应并洗涤；

(3)在经由步骤(2)处理后的每个反应孔内加入纳米材料或者生物酶标记标记二抗，继续反应并洗涤；

(4)在经由步骤(3)处理后的每个反应孔内加入显色剂，避光反应；

(5)用芯片扫描仪对步骤(4)反应后的载体片基进行图像扫描，根据不同浓度的灰度值信号，利用外标曲线法定量检测待测样品中α-乳白蛋白，β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。

步骤(1)中，所述的载体片基为多孔板、高聚物片基、膜或玻片。其中，所述多孔板可以为24孔板、48孔板、96孔板以及384孔板等。点样可直接通过生物芯片点样仪进行。

步骤(1)中，所述固定是指点好后的载体片基在37℃中固定0.5h-4h。

步骤(1)中，所述封闭是指向固定后的每个反应孔内加入10～300μl1～20mg/ml的蛋白质缓冲溶液封闭0.5h-4h；所述的蛋白质缓冲溶液为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或多聚赖氨酸。封闭的目的是防止待测样品中的蛋白质与其他活性基团非特异性结合，形成高背景或假阳性。

步骤(1)中，所述洗涤是指pbst洗涤3-4次，每次3-10min。

步骤(2)中，加入的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品混合溶液和相应的混合抗体，以及待测样品溶液和α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白混合抗体，均为10～100μl。

本发明中，待测样品可以为牛奶、奶粉、奶酪、饲料、血样、动物组织、鸡蛋和水产品。其中，步骤(2)中，所述待测样品溶液的制备方法为：当待测样品为液体时，取50μl～1ml于10mlep管中，用缓冲液稀释10～1000倍即得待测样品溶液；当待测样品为固体时，取粉碎样品5g，加入8ml缓冲液，混合2～5min，置50℃水浴下放置10～30min，离心5～10min，取50μl上清液，加入450μl缓冲液混匀，取50μl～500μl即得待测样品溶液。

步骤(2)中，所述反应是指在20～37℃下反应0.5～2h。

步骤(2)中，所述洗涤是指用pbst洗涤3～4次，每次3～10min。

步骤(3)中，所述的标记二抗为羊抗鼠、羊抗兔、兔抗鼠、兔抗羊、鼠抗羊、鼠抗兔、驴抗羊或者驴抗兔。

步骤(3)中，所述的标记二抗加入量为10～100μl。

步骤(3)中，所述反应是指在20～37℃下反应0.5～2h；所述洗涤是指用pbst洗涤3～4次，每次3～10min。

步骤(4)中，所述的显色剂为生物催化剂及其底物或者化学催化剂及其底物。具体的，所述显色剂可以为生物催化剂及其底物，包括：辣根过氧化物酶及其底物邻苯二胺/过氧化氢体系或四甲基联苯胺/过氧化氢体系、碱性磷酸酶及其底物bcip/nbt体系；化学催化剂及其底物包括：纳米金或纳米银及其底物氯金酸/单宁酸体系或氯金酸/氢醌体系或硝酸银/氢醌体系。生物催化剂对反应条件要求较高，例如部分催化剂在37℃的催化效率最高；而化学催化剂的稳定性高，适应范围广。

步骤(4)中，所述的显色剂的加入量为10～100μl。

步骤(4)中，避光反应时间为5～30min。

所述的洗涤液为盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或tris缓冲液。

本发明中，所述的pbst洗涤液的配制方法为：用137mmol/l氯化钠、2.7mmol/l氯化钾、10mmol/l磷酸二氢钠、2mmol/l磷酸二氢钾配制ph7.4的pbs缓冲液，再加0.05％tween20。

有益效果：相比较于现有技术，本发明方法：(1)经过显色反应后终点颜色的深浅可目视定性判断样品中待测物的含量，使用仪器利用外标曲线定量计算待测物溶液中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量；(2)检测限低分别可达到0.04μg/ml(α-乳白蛋白)、0.05μg/ml(β-乳球蛋白)、0.03μg/ml(乳铁蛋白)，并且孔间cv值均低于15％，孔内cv值低于10％，方法精密度高；(3)对牛奶加标回收率在90％-110％之间，适于实际样品的检测。总之，本发明方法可以快速准确的同时测定α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量，灵敏度高，检测时间短，操作简单易行。

附图说明

图1为实施例1α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的标准曲线；

图2为实施例1检测牛奶样品时的结果扫描图；

图3为本发明方法和hplc方法对比结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作出详细说明。

实施例1

本实施例检测的是牛奶中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量，其中牛奶样品溶液的制备方法为：取50μl～1ml待测牛奶于10mlep管中，用缓冲液稀释200倍即得待测样品溶液；其中缓冲液为为磷酸盐缓冲液。本实施例选用生鲜乳和高温灭菌奶进行了检测。

一种同时检测上述牛奶样品溶液中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，包括如下步骤：

(1)将α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品通过生物芯片点样仪在96孔板内进行点样操作，点好后的96孔板在37℃中固定2h；向固定后的每个反应孔内加入100μl10mg/ml的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭1h，然后pbst洗涤3次，每次5min；

(2)在经由步骤(1)处理后的部分反应孔内加入25μl不同浓度梯度的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品混合溶液和相应的混合抗体，在剩余反应孔内加入25μl牛奶样品溶液和α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白混合抗体，所有反应孔25℃反应0.5h，然后pbst洗涤3次，每次5min；

(3)向经由步骤(2)处理后的每个反应孔内加入50μl纳米银标记兔抗羊，37℃反应0.5h，然后pbst洗涤3次，每次5min；

(4)在经由步骤(3)处理后的每个反应孔内加入50μl显色剂氯金酸/氢醌，避光显色反应10min后，终止反应；

(5)用芯片扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。

实施例1检测结果如下：

图1为α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的标准曲线。其中：α-乳白蛋白:y＝-0.3258x+0.5171,r＝0.9829；β-乳球蛋白:y＝-0.2738x+0.5986,r＝0.9702；乳铁蛋白:y＝-0.2558x+0.5658,r＝0.9952。由图1可见，曲线在0.05μg/ml-25μg/ml范围内线性良好，r²>0.97，并且孔间rsd值低于15％，孔内rsd值低于10％，表明方法精密度高；且牛奶加样回收率在90％-110％之间，方法的准确度高。

图2为检测牛奶样品时的结果扫描图。第一列从上往下6孔为不同浓度的标准品，余下的均为牛奶样品检测结果图。检测数据见表1：

表1不同种类牛奶中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的检测结果

由图2和表1可见，不同牛奶的样品检测结果精密度高，rsd均小于15％。且结果肉眼可视，可实现快速高通量检测。

对比例1

为证实检测结果的可靠和准确性，将本发明方法和hplc的方法进行对比。结果如图3所示，曲线的回归方程和相关系数分别为：y＝1.031x-9.30,r＝0.9604(α-乳白蛋白)；y＝1.094x-35.33,r＝0.9872(β-乳球蛋白)；y＝1.1096x-1.054,r＝0.9889(乳铁蛋白)；结果表明，两方法的结果一致性很好，本发明的方法检测结果准确可靠。

实施例2

一种同时检测上述牛奶样品溶液中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，包括如下步骤：

(1)将α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品通过生物芯片点样仪在96孔板内进行点样操作，点好后的96孔板在37℃中固定0.5h；向固定后的每个反应孔内加入50μl10mg/ml的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭0.5h，然后pbst洗涤3次，每次3min；

(2)在经由步骤(1)处理后的部分反应孔内加入25μl不同浓度梯度的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品混合溶液和相应的混合抗体，在剩余反应孔内加入25μl牛奶样品溶液和α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白混合抗体，所有反应孔25℃反应0.5h，然后pbst洗涤3次，每次3min；

(3)向经由步骤(2)处理后的每个反应孔内加入50μl纳米银标记兔抗羊，25℃反应0.5h，然后pbst洗涤3次，每次3min；

(4)在经由步骤(3)处理后的每个反应孔内加入50μl显色剂氯金酸/氢醌，避光显色反应5min后，终止反应；

(5)用芯片扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。

实施例3

一种同时检测上述牛奶样品溶液中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法，包括如下步骤：

(1)将α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品通过生物芯片点样仪在96孔板内进行点样操作，点好后的96孔板在37℃中固定4h；向固定后的每个反应孔内加入300μl10mg/ml的牛血清白蛋白缓冲溶液对芯片进行封闭4h，然后pbst洗涤3次，每次10min；

(2)在经由步骤(1)处理后的部分反应孔内加入100μl不同浓度梯度的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白标准品混合溶液和相应的混合抗体，在剩余反应孔内加入100μl牛奶样品溶液和α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白混合抗体，所有反应孔37℃反应2h，然后pbst洗涤3次，每次10min；

(3)向经由步骤(2)处理后的每个反应孔内加入200μl纳米银标记兔抗羊，37℃反应2h，然后pbst洗涤3次，每次10min；

(4)在经由步骤(3)处理后的每个反应孔内加入200μl显色剂氯金酸/氢醌，避光显色反应10min后，终止反应；

(5)用芯片扫描仪进行图像扫描，根据不同浓度的灰度值信号，利用外标曲线法定量检测样品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量。