本发明涉及生物技术领域，具体涉及能快速预测和提高brca1/2野生型卵巢癌细胞对parp1抑制剂olaparib抑制剂敏感性的方法。
背景技术：
parp1(poly(adp-ribose)polymerase1，多聚二磷酸腺苷酸核糖聚合酶1)抑制剂是目前卵巢癌治疗中最主要、最有效的靶向药物。2014年年底，美国fda批准了第一个parp1抑制剂olaparib用于晚期卵巢癌的治疗。2016年5月，另一个parp1抑制剂niraparib在美国上市，也用于卵巢癌的治疗。然而，parp1抑制剂主要用于brca1/2(乳腺癌1号/2号基因)发生突变的卵巢癌病人，因为前期的研究表明，parp1抑制剂在具有brca1/2突变的卵巢癌细胞中的作用较其在brca1/2野生型的卵巢癌细胞的作用更为明确，不同的brca1/2野生型卵巢癌细胞对parp1抑制剂的反应差异非常大。在临床上，超过70％的卵巢癌是brca1/2野生型的。目前缺乏在brca1/2野生型的卵巢癌细胞中筛选出对parp1抑制剂敏感的细胞类型的检测方法，也缺乏增强brca1/2野生型的卵巢癌病人对parp1抑制剂敏感性的方法。
非折叠蛋白质相应通路(unfoldedproteinresponse，upr)是一系列在进化中非常保守的旨在维持细胞内质网(endoplasmicreticulum，er)中蛋白质合成后正确折叠并形成功能性构象的信号传导通路。其中，upr的一个关键分支通路是由内质网膜蛋白偶联的perk蛋白引发的：当被上游信号激活后，perk自身磷酸化，继而磷酸化其直接的下游分子eif2α，后者则增强转录因子atf4的翻译，atf4最终进入细胞核启动相关的基因转录，包括chop、asns和gadd34等，引起细胞存活或者凋亡的效应。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种能快速预测和提高brca1/2野生型卵巢癌细胞对parp1抑制剂抑制剂敏感性的方法。通过本发明的方法能快速的预测brca1/2野生型卵巢癌病人对parp1抑制剂的敏感性并提高brca1/2野生型卵巢癌病人对parp1抑制剂的敏感性。本发明提供的技术方案如下所述。
一种能快速预测brca1/2野生型卵巢癌细胞对parp1抑制剂敏感性的方法，通过检测细胞upr中perk通路的激活水平，即eif2a蛋白的磷酸化程度和atf4蛋白的表达水平来预测brca1/2野生型卵巢癌细胞对parp1抑制剂的敏感性。
本发明的另一目的是提供一种提高brca1/2野生型卵巢癌细胞对parp1抑制剂敏感性的方法，通过抑制upr中perk通路的激活水平来提升brca1/2野生型卵巢癌细胞对olaparib抑制剂的敏感性。
附图说明
图1是本发明实施例中1的结果图；
图2是本发明实施例中2的结果图；
图3是本发明实施例中3的结果图；
图4是本发明实施例中4的结果图；
图5是本发明实施例中5的结果图；
图6是本发明实施例中6的结果图；
图7是本发明实施例中7的结果图。
具体实施方式
下面给出本发明的较佳的实施例，这些实施例并非限制本发明的内容。
实施例1
在体外细胞培养条件下，用“浓度—效应”法测定8株brca1/2野生型卵巢癌细胞系对olaparib处理的半致死浓度(ec50)。
实验方法：
1.8株brca1/2野生型卵巢癌细胞ovca1，ovca2，ovca3，ovca4，ovca5，ovca6，ovca7和ovca8用rpmi-1640培养基进行培养(同时添加10％胎牛血清，10unit/ml青霉素和10unit/ml链霉素)。培养条件为37℃，5％co2。olaparib(selleckchem公司)用dmso进行溶解，储存液浓度为10mm。
2.在96孔细胞培养板上，以4000细胞/孔的密度种植8株细胞。在细胞种植24小时后，对细胞进行olaparib的处理，浓度为40μm，20μm，10μm，5μm，2.5μm，1.25μm，0.625μm，0.31μm和0μm(dmso)。处理72小时后，用celltiterglo(promega公司)试剂进行细胞活性测定，用prism软件进行“浓度—效应”的计算，得出8株细胞对olaparib处理的半致死浓度(ec50)。
实验结果：
见图1。
实施例2
通过蛋白质印迹技术(westernblotting)，获得8株brca1/2野生型卵巢癌细胞系中eif2α磷酸化，atf4表达水平和内参gapdh(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的数据。然后把上述蛋白的表达量和各自细胞株对的ec50浓度进行相关性分析，发现磷酸化eif2α和atf4的水平与细胞对olaparib的ec50呈显著相关：eif2α磷酸化水平越高，atf4的表达水平越高，brca1/2野生型卵巢癌细胞对olaparib的敏感性越低(ec50越高)。
实验方法：
1.8株brca1/2野生型卵巢癌细胞ovca1，ovca2，ovca3，ovca4，ovca5，ovca6，ovca7和ovca8用rpmi1640培养基进行培养(同时添加10％胎牛血清，10unit/ml青霉素和10unit/ml链霉素)。培养条件为37℃，5％co2。olaparib用dmso进行溶解，储存液浓度为10mm。
2.用标准的ripa缓冲液(20mmtris-hcl(ph7.5)，150mmnacl，1mmna2edta，1mmegta(ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraaceticacid)，1％np-40，1％sodiumdeoxycholate(脱氧胆酸钠)，2.5mmsodiumpyrophosphate(焦磷酸钠)，1mmbeta-glycerophosphate(β-甘油磷酸钠)，1mmna3vo4(钒酸钠)，1μg/mlleupeptin(亮抑蛋白酶肽)，1mmpmsf(phenylmethanesulfonylfluoride))在冰上收集上述8株细胞的细胞裂解液。用bradford方法测定上述裂解液的蛋白质浓度，并用ripa缓冲液(abcam公司)，350mmdtt(dl-dithiothreitol)，25％glycerol，2％sds，0.01％bromophenolblue(溴酚蓝bpb)配成1μg/μl的蛋白裂解液。75℃加热10分钟。
3.用蛋白印记技术(westernblotting)法对上述8株细胞的蛋白样本中的eif2a磷酸化水平，eif2a表达水平，atf4表达水平和gapdh表达水平进行测定。
1)用sds-page法(分离胶浓度为10％)进行蛋白质的分离；
2)把蛋白转移到硝酸纤维膜上；
3)用含5％脱脂牛奶的tbst缓冲液在室温封闭1小时；
4)一抗孵育：抗磷酸化eif2α(cellsignalingtechnology#9721)，抗atf4(cellsignalingtechnology#11815)，抗gapdh抗体在4℃孵育12小时；
5)用与上述一抗相应的辣根过氧化物酶偶联的二抗进行室温孵育1小时。
6)用supersignaltmwestpico化学发光底物进行显色，在胶片上进行曝光。胶片用epson扫描仪(爱普生公司)扫描后各个样本中的蛋白条带的强度用imagej软件进行定量。4.用prism如见对上述蛋白的表达量和各自细胞对olaparib的ec50进行pearson相关性分析，获得相应的相关系数和统计学显著性。
实验结果：
磷酸化eif2α和atf4的水平与细胞对olaparib的ec50呈显著相关：eif2α磷酸化水平越高，atf4的表达水平越高，brca1/2卵巢癌细胞对olaparib的敏感性越低(ec50越高)。结果见图2。
实施例3
把5株细胞ovca1，ovca2，ovca4，ovca6和ovca7种植到裸鼠皮下并形成肿瘤，在种植两周后进行olaparib的处理，得到5株细胞在形成肿瘤过程被olaparib抑制的程度的数据(tgi值)。然后把5株细胞中eif2a的磷酸化水平和atf4表达水平与5株细胞在裸鼠体内被olaparib抑制的程度进行相关性分析。结论为eif2a的磷酸化水平和atf4表达水平与细胞在裸鼠体内对olaparib响应程度显著相关。
实验方法：
采取实施例1中的方法进行株细胞ovca1，ovca2，ovca4，ovca6和ovca7这5株细胞的培养，维持和扩增。采集106的细胞注射到8周龄的裸小鼠(nudemice)的右腹股沟皮下，每种细胞注射10只裸鼠。注射后，把10只动物随机分成两组，a组为对照组，b组为olaparib注射组。b组的动物接受50mg/kg/d剂量的olaparib悬液的腹腔注射，注射期限为动物接种肿瘤细胞后的第三周到第六周。a组动物用相同的注射方法在相同的时间内进行生理盐水的注射。在接种肿瘤细胞六周后，各组动物的肿瘤被取出，称重。肿瘤抑制率的计算方法为：tgi＝(a组肿瘤平均值-b组肿瘤平均值)/a组肿瘤平均值×100％。
采用prism软件对5株细胞的eif2a磷酸化水平和atf4表达水平(结果来自实施例1)和来自5株细胞的tgi数值进行pearson相关性分析。
实验结果：
上述5株细胞中磷酸化eif2α和atf4的水平与细胞对olaparib的tgi呈显著的负相关：eif2α磷酸化水平越高，atf4的表达水平越高，brca1/2野生型卵巢癌细胞在裸鼠体内被olaparib的抑制程度(tgi)越低，即敏感性越低。结果见图3。
实施例4
在细胞体外培养的条件下，通过rna干扰技术降低perk的表达水平可以有效降低ovca7细胞在olaparib处理时的ec50，提高细胞对olaparib的敏感性。
实验方法：
采用plko.1(来自美国addgene公司)空质粒，把化学合成的小dna片段tgcatctgcctggttacttaa(shperk-1)和gttgtgctagcaaccctaata(shperk-2)克隆进去plko.1质粒。把上述质粒，包括对照的空质粒(shcontrol)，shperk-1和shperk-2，通过lipofectamine2000试剂(thermofisherscientific公司)转染ovca7细胞，用2ug/ml浓度的puromycin(cst公司)对转染后的ovca7细胞进行筛选，获得稳定表达上述质粒的ovca7细胞(ovca7-shcontrol，ovca7-shperk-1，和ovca7-shperk-2)。ovca7细胞中的perk蛋白的表达水平，eif2a的磷酸化水平和gapdh蛋白的表达水平用实施例2中的蛋白印记技术和定量方法进行检测和定量。
利用上面获得的ovca7-shcontrol，ovca7-shperk-1，和ovca7-shperk-2细胞，进行实施例1中的olaparib处理，获得olaparib对上述细胞的ec50值。
实验结果：
通过对比蛋白印记的实验定量结果和ec50值，发现ovca7细胞的perk蛋白通过rna干扰技术降低后，olaparib对细胞的ec50值降低了，表明细胞对olaparib变得更加敏感。见图4。
实施例5
在细胞体外培养的条件下，通过rna干扰技术降低atf4的表达水平可以有效降低ovca7细胞中atf4的表达水平，同时，也降低细胞在olaparib处理时的ec50。实验方法：
采用plko.1(来自美国addgene公司)质粒，把化学合成的小dna片段ccactccagatcattccttta(shatf4-1)和gcctaggtctcttagatgatt(shatf4-2)克隆进去plko.1质粒。把上述质粒，包括对照的空质粒(shcontrol)，shatf4-1和shatf4-2，通过lipofectamine2000试剂转染ovca7细胞，用2ug/ml浓度的puromycin对转染后的ovca7细胞进行筛选，获得稳定表达上述质粒ovca7细胞(ovca7-shcontrol，ovca7-shatf4-1和ovca7-shatf4-2)。用cell-to-ct试剂盒(thermofisherscientific公司)和试剂盒自带的程序提取细胞的mrna并同时进行反转录，获得cdna。然后，利用荧光定量pcr技术，采用正向引物gaccacgttggatgacacttg和反向引物gggaagaggttgtaagaaggtg对ovca7细胞中的atf4的mrna水平进行检测，使用的荧光定量pcr仪器为thermofisher的quantstudiotm6，荧光素使用sybrgreen，荧光定量pcr的程序使用该仪器的自带标准程序。
利用上面获得的ovca7-shcontrol，ovca7-shatf4-1和ovca7-shatf4-2细胞，进行实施例1中的olaparib处理，获得olaparib对上述细胞的ec50值。
实验结果：
通过对atf4mrna水平的荧光定量pcr检测，发现ovca7细胞的atf4蛋白通过rna干扰技术降低后，olaparib对细胞的ec50值也相应降低了，表明细胞对olaparib变得更加敏感。见图5
实施例6
在细胞内外培养的条件下，加入perk的小分子抑制剂可以增强ovca7细胞对olaparib的敏感性。
实验方法：
50000个ovca7细胞种植在3.5cm直径的细胞培养皿上，加入终浓度为0.5μm的perk小分子抑制剂(gsk2656157，emdmillipore公司)进行预处理，处理时间为48小时。预处理后，未经处理的ovca7对照细胞和进行过perk抑制剂预处理的ovca7细胞按照实施例1中的方法种植到96孔板上，进行同样浓度梯度的olaparib处理，测试细胞存活，对比两种细胞对olaparib的ec50值。
实验结果：
经过perk小分子抑制剂预处理后，ovca7对olaparib的ec50值被降低了54％。见图6。
实施例7
使用ovca7细胞进行裸鼠皮下的成瘤实验，通过进行a)对照、b)perk抑制剂处理、c)olaparib处理和d)perk抑制剂和olaparib共同处理等四种方式的处理，对比各组动物中肿瘤的生长情况，发现perk抑制剂可以增强olaparib的体内抑瘤作用。
实验方法：
采取实施例1中的方法进行ovca7细胞的培养，维持和扩增。采集106的细胞注射到8周龄的裸小鼠(nudemice)的右腹股沟皮下，共注射40只裸鼠。注射后，把40只动物随机分成四组，a组为对照组(pbs处理)，b组为perk小分子抑制剂gsk2656157处理组，c组为olaparib处理组，d组为gsk2656157和olaparib联合处理组。gsk2656157的处理剂量为50mg/kg/d，olaparib处理的剂量为50mg/kg/d，均为腹腔注射，注射期限为动物接种肿瘤细胞后的第三周到第六周。a组动物用相同的注射方法在相同的时间内进行生理盐水的注射。在接种肿瘤细胞六周后，各组动物的肿瘤被取出，称重。肿瘤抑制率的计算方法为：tgi＝(a组肿瘤平均值-b/c/d组肿瘤平均值)/a组肿瘤平均值×100％。
实验结果：
使用perk抑制剂降低perk通路的活性可以有效提高olaparib在动物体内抑制brca1/2野生型卵巢癌生长的能力。见图7。