本发明涉及生物技术领域，且特别涉及一种细胞蜡块及其直接制备方法。
背景技术：
脱落细胞学检查是肿瘤诊断有效手段之一，普通涂片制作过程中吸取的少量胸腹水不能代表整个胸腹水的状况，且制作完毕之后剩余的胸腹水往往被遗弃，而细胞蜡块可以收集送检胸腹水中的绝大部分细胞，以便观察大部分细胞的形态，且细胞蜡块易于保存，大大提高了细胞病理学诊断的敏感性和特异性，弥补了常规细胞涂片制作有限而不够作多种染色的不足之处，可进行进一步研究和前瞻性研究。但现有的细胞蜡块制作中固定时间长，细胞丢失明显。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种细胞蜡块，其细胞结构清楚，提高了病理诊断的阳性检出率及准确率。
本发明的另一目的在于提供一种细胞蜡块直接制备方法，操作简单，固定时间较短，有效固定样本中的几乎所有的细胞，防止细胞的浪费。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种细胞蜡块的直接制备方法，其包括：
将细胞样本在800-2100r/min的条件下第一次离心进行5-10min，收集第一沉淀样本，加入第一固定液，混合均匀后，在1800-2100r/min的条件下第二次离心5-6min，得第二沉淀。
于第二沉淀中加入第二固定液，混合均匀后，静置，将收集的第三沉淀脱水、透明、浸蜡以及包埋。
本发明提出一种由上述直接制备方法制得的细胞蜡块。
本发明实施例的细胞蜡块及其直接制备方法的有益效果是：
通过在800-2100r/min的条件下第一次离心进行5-10min，有效沉淀所需细胞，同时防止所需要的细胞破碎。第一次离心后，去除破碎的细胞、杂质混合的上清液后，在第一固定液与第二次离心的配合下，进一步去除杂质，同时固定细胞，使最后细胞蜡块的细胞保持较佳的形态结构，接着，通过第二沉淀中与第二固定液的配合，静置，有效得到最终所需要的细胞，操作简单，固定时间较短，有效固定样本中的几乎所有的细胞，防止细胞的浪费。
同时，制得的细胞蜡块便于切片，其中的细胞结构清楚，提高了病理诊断的阳性检出率及准确率。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的细胞蜡块及其直接制备方法进行具体说明。
本发明提供一种细胞蜡块，用于应用于病理学的检测研究等，其由以下方法制得：
S1.将细胞样本在800-2100r/min的条件下第一次离心进行5-10min，收集第一沉淀样本。
当细胞样本为血性细胞样本时，为了去除红细胞对最终得到的细胞蜡块的干扰，优选地，将血性样本与乙醇乙酸液混合，振荡后进行第一次离心。
其中，乙醇对组织细胞的处理既有固定作用又有脱水作用，乙醇借沉淀作用使蛋白质变性，乙酸不能沉淀白蛋白，但能沉淀核蛋白，渗透性强，固定快，能使红细胞膨胀而破碎，与乙醇配合使用效果佳。
该乙醇乙酸液由体积分数为24-25.5％的乙醇与乙酸按照体积比为18-19：1混合而得。可选地，乙醇乙酸液与血性细胞样本的体积比率应为12-16:1，有效破坏红细胞，同时经第一次离心，使破碎的红细胞随上清液去除，提高最后细胞蜡块的精准性。
同时振荡处理，促进乙醇乙酸液破坏红细胞，同时便于操作，有效节省制备的时间以及工艺。
当细胞样本为非血性细胞样本时，可直接进行第一次离心处理。
优选地，在第一次离心前，将细胞样本静置，使细胞沉积于底部，取底部样本进行第一次离心处理，有效提高第一次离心的效率。第一次离心在1800-2100r/min的条件下进行5-10min，有效沉淀所需细胞，同时防止所需要的细胞破碎。
S2.在第一沉淀样本中加入第一固定液，混合均匀后，在1800-2100r/min的条件下第二次离心5-6min，得第二沉淀。
其中，第一固定液为浓度为3.5-4.3wt％的中性缓冲甲醛溶液，中性缓冲甲醛溶液的温度为3-5℃。因甲醛能与蛋白质的氨基结合，使蛋白质凝固，进而有效固定细胞，防止细胞自溶，影响细胞蜡块的质量。需要说明的是，第一沉淀样本与第一固定液混合均匀，需要先将第一沉淀样本轻轻打散。
优选地，第二次离心在1800-2100r/min的条件下进行5-6min，有效沉淀所需细胞。
S3.于第二沉淀中加入第二固定液，混合均匀后，静置，收集第三沉淀。
第二固定液为体积分数为90-95％的乙醇溶液，优选为体积分数为95％的乙醇溶液，需要说明的是，本发明中乙醇溶液均指乙醇水溶液。其中，90-95％的乙醇溶液有效使蛋白质析出，固定效果佳。需要说明的是，第二沉淀样本与第二固定液混合均匀，需要先将第二沉淀样本轻轻打散。
优选地，第二固定液沿盛有第二沉淀的管壁，沿管壁加入，使固定效果较为充分，固定效果佳，有效防止固定不均匀，导致细胞蜡块的效果差。
可选地，静置1-2h，使细胞充分沉淀、分层，去除上清液，采用尖头的硬签轻轻将沉淀物挑出。得到第三沉淀。
S4.将收集的第三沉淀脱水、透明、浸蜡以及包埋。
具体地，将将收集的第三沉淀置于脱水盒进行脱水，具体地，脱水包括：在44-46℃，于体积分数为90-96％的乙醇溶液中脱水110-125min，接着在无水乙醇中脱水1-2次，每次脱水85-120min。在脱水前进行固定，使第三沉淀更容易形成细胞块。
于脱水后进行透明操作，具体地，透明包括：在45-47℃的条件下，采用二甲苯对脱水后的第三沉淀进行连续1-2次浸泡，进行透明处理，每次进行25-30min，该时间以及次数范围内，透明处理效果佳，细胞结构佳，可有效防止因浸泡时间过长导致的细胞变脆，不利于后期进行切片的问题。
优选地，本发明较佳的实施例中，于58-65℃的条件下浸蜡，便于石蜡充分浸润于细胞，得到的细胞蜡块的结构完整，不松散。
浸蜡包括：将透明处理后的第三沉淀涂敷于表面熔融状的蜡后，将第三沉淀快速压平于蜡的表面，快速冷却至20-25℃，静置5-20min后于60-65℃烘烤4-6min，蜡块中细胞分散均匀，同时进一步使石蜡充分浸润于细胞。同时，将第三沉淀快速压平于蜡的表面，快速冷却至20-25℃，静置5-20min，有效使细胞分散于蜡的表面。同时于60-65℃烘烤4-6min，一方面进一步促进浸蜡的效果，使蜡充分浸润于细胞。
采用上述方法浸蜡，细胞蜡块位于蜡块顶部，一方面容易切片,同时光镜下细胞结构较完整，细胞与背景清晰，厚薄均匀，间皮、肿瘤及炎细胞染色鲜艳，细胞分散均匀，细胞清晰，核浆染色对比明显，细胞形态与常规组织制作石蜡切片HE近似，容易鉴别，便于观察分析，另一方面石蜡块可以长期保存。
浸蜡还可以为在60-65℃第一次浸蜡30-35min后，保温10-20min后，接着在60-65℃第二次浸蜡进行110-130min。有效提高浸蜡的效率。
可选地，在包埋后，还包括切片以及染色。其中，切片例如可以为将包埋后的细胞样本切至厚度为3-6um的薄片，有效解决因切片太厚导致的细胞结构不清楚的问题。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种细胞蜡块，其由以下方法制得：
将细胞样本静置1h，使细胞沉积于底部，取底部样本20ml在2100r/min的条件下第一次离心进行6min，收集第一沉淀样本，加入温度为4℃，浓度为4.3wt％的中性缓冲甲醛溶液，混合均匀后，在2100r/min的条件下第二次离心5min，得第二沉淀。
于第二沉淀中加入体积分数为95％的乙醇溶液，混合均匀后，静置2h，将收集的第三沉淀脱水、透明、浸蜡以及包埋。
其中，脱水包括：在44℃，于体积分数为96％的乙醇溶液中脱水110min，接着在无水乙醇中脱水1次，每次脱水120min。
透明包括：在45℃的条件下，采用二甲苯对脱水后的第三沉淀进行连续浸泡2次，每次进行25min。
浸蜡包括：于65℃的条件下，将透明处理后的第三沉淀涂敷于表面熔融状的蜡后，将第三沉淀快速压平于蜡的表面，快速冷却至20℃，静置10min后于65℃烘烤4min。
实施例2
一种细胞蜡块，其由以下方法制得：
细胞样本为血性样本，将血性样本与乙醇乙酸液混合，振荡后在2000r/min的条件下第一次离心进行7min，收集第一沉淀样本，加入温度为4℃，浓度为4wt％的中性缓冲甲醛溶液，混合均匀后，在1900r/min的条件下第二次离心5min，得第二沉淀。
于第二沉淀中加入体积分数为95％的乙醇溶液，混合均匀后，静置1.5h，将收集的第三沉淀脱水、透明、浸蜡以及包埋。
其中，脱水包括：在45℃，于体积分数为94％的乙醇溶液中脱水120min，接着在无水乙醇中脱水2次，每次脱水85min。
透明包括：在45℃的条件下，采用二甲苯对脱水后的第三沉淀进行浸泡30min。
浸蜡包括：于62℃的条件下，将透明后的第三沉淀涂敷于表面熔融状的蜡后，将第三沉淀快速压平于蜡的表面，快速冷却至23℃，静置10min后于63℃烘烤6min。
实施例3
一种细胞蜡块，其由以下方法制得：
细胞样本为血性样本，将血性样本与乙醇乙酸液混合，振荡后在1900r/min的条件下第一次离心进行7min，收集第一沉淀样本，加入温度为4℃，浓度为4.3wt％的中性缓冲甲醛溶液，混合均匀后，在2000r/min的条件下第二次离心5min，得第二沉淀。
于第二沉淀中加入体积分数为94％的乙醇溶液，混合均匀后，静置1.5h，将收集的第三沉淀脱水、透明、浸蜡以及包埋。
其中，脱水包括：在45℃，于体积分数为93％的乙醇溶液中脱水120min，接着在无水乙醇中脱水120min。
透明包括：在46℃的条件下，采用二甲苯对脱水后的第三沉淀进行连续浸泡2次，每次进行25min。
浸蜡包括：于62℃的条件下，将透明处理后的第三沉淀涂敷于表面熔融状的蜡后，将第三沉淀快速压平于蜡的表面，快速冷却至24℃，静置15min后于63℃烘烤6min。
实施例4
一种细胞蜡块，其由以下方法制得：
将细胞样本静置1h，使细胞沉积于底部，取底部样本20ml在2000r/min的条件下第一次离心进行7min，收集第一沉淀样本，加入温度为4℃，浓度为4wt％的中性缓冲甲醛溶液，混合均匀后，在2000r/min的条件下第二次离心5.5min，得第二沉淀。
于第二沉淀中加入体积分数为95％的乙醇溶液，混合均匀后，静置1.5h，将收集的第三沉淀脱水、透明、浸蜡以及包埋。
其中，脱水包括：在45℃，于体积分数为95％的乙醇溶液中脱水115min，接着在无水乙醇中脱水2次，每次脱水85min。
透明包括：在47℃的条件下，采用二甲苯对脱水后的第三沉淀进行连续浸泡2次，每次进行25min。
浸蜡包括：于65℃的条件下，将透明处理后的第三沉淀涂敷于表面熔融状的蜡后，将第三沉淀快速压平于蜡的表面，快速冷却至25℃，静置5min后于62℃烘烤5min。
实施例5
一种细胞蜡块，其由以下方法制得：
将细胞样本静置1h，使细胞沉积于底部，取底部样本20ml在1900r/min的条件下第一次离心进行7min，收集第一沉淀样本，加入温度为5℃，浓度为4wt％的中性缓冲甲醛溶液，混合均匀后，在2100r/min的条件下第二次离心5min，得第二沉淀。
于第二沉淀中加入体积分数为95％的乙醇溶液，混合均匀后，静置1-2h，将收集的第三沉淀脱水、透明、浸蜡以及包埋。
其中，脱水包括：在45℃，于体积分数为92％的乙醇溶液中脱水110min，接着在无水乙醇中脱水2次，每次脱水100min。
透明包括：在45℃的条件下，采用二甲苯对脱水后的第三沉淀进行浸泡30min。
浸蜡包括：于59℃的条件下，将透明处理后的第三沉淀涂敷于表面熔融状的蜡后，将第三沉淀快速压平于蜡的表面，快速冷却至23℃，静置12min后于62℃烘烤5min。
综上，本发明实施例提供的细胞蜡块直接制备方法，操作简单，固定时间较短，有效固定样本中的几乎所有的细胞，防止细胞的浪费。由上述方法制得的细胞蜡块，其细胞结构清楚，提高了病理诊断的准确率。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。