本发明涉及检测女贞子中齐墩果酸和熊果酸方法，尤其涉及一种HPLC检测女贞子中齐墩果酸和熊果酸的方法。
背景技术：
齐墩果酸(oleanolic acid)和熊果酸(ursolic acid)都是五环三萜类化合物，是多种中药材均含有的活性成分，具有保肝、消炎、抗肿瘤、调血脂、免疫双向调解等药理作用。其检测的方法有分光光度法、薄层扫描和高效液相色谱法，齐墩果酸和熊果酸互为同分异构体，仅29、30位的甲基位置不同，分离存在一定困难，要将两者分开，色谱条件的选择非常重要，近年来采用HPLC测定的方法大多流动相组成复杂，出峰时间长，峰形和分离度不太理想。
快速溶剂萃取(ASE)是指在密闭容器内于高温(50～200℃)和高压(3448～20685kPa)条件下，在短时间内，用有机溶剂提取固体或半固体样品的一种新型样品前处理方法。与超声、微波、回流、超临界萃取等成熟方法相比，ASE有萃取溶剂用量少、提取时间短、萃取效率高、操作简单方便、安全和自动化程度高等优点。国外已有学者将这项技术应用于植物药定量和定性分析中样品的前处理，但在中药材有效成分的定量和定性分析中作为样品的前处理方法应用较少。
女贞子果实含齐墩果酸(Oleanolic acid)、甘露醇、葡萄糖、棕榈酸、硬脂酸、油酸及亚麻酸。果皮含熊果酸(Ursolic acid)、齐墩果酸、乙酰齐墩果酸(Acetyloleanolic acid)。种子含脂肪油14.9％，油中棕榈酸与硬脂酸为19.5％、油酸及亚麻酸等为80.5％。女贞子中尚含铜、锌、铁、锰等微量元素。
技术实现要素：
本发明的目的旨在提供一种HPLC检测女贞子中齐墩果酸和熊果酸的方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种HPLC检测女贞子中齐墩果酸和熊果酸的方法，包括以下步骤：
(1)制备对照品溶液：取齐墩果酸和熊果酸的对照品分别用甲醇制成对照品溶液；
(2)制备待测样品溶液：取女贞子药材经快速溶剂萃取，获得的萃取液用甲醇稀释，得到待测样品溶液；
(3)制定标准曲线：取不同浓度的齐墩果酸和熊果酸的对照品溶液混合后上高效液相色谱仪进行定量测定，分别获得齐墩果酸和熊果酸的标准曲线；
(4)测定待测样品溶液：取待测样品溶液上高效液相色谱仪进行定量测定，获得齐墩果酸和熊果酸的峰面积，然后根据齐墩果酸和熊果酸的标准曲线获得待测样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。
所述步骤(3)和(4)中的色谱条件：150mm×2.1mm，3μm Thermo Acclaim C30色谱柱，进样量1μ量，以体积比为88∶12的乙腈-0.2％醋酸溶液为流动相，检测波长为205nm，柱温18℃，体积流量0.2mL/min。
所述步骤(1)中，分别精密称取齐墩果酸对照品54.2mg至50mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度为1.084mg/mL对照品溶液；精密称取熊果酸对照品81.6mg至100mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度为0.8160mg/mL对照品溶液。
所述步骤(2)中，取女贞子药材待测样品研成粉末，精密称取样品粉末0.5g，与1g硅藻土混合均匀后，置预先铺上纤维滤膜的5mL萃取池中，加入硅藻土以填满萃取池为宜，拧紧萃取池上盖，进行快速溶剂萃取，萃取溶剂为甲醇、萃取温度100℃、静态萃取时间6min、冲洗体积100％、静态萃取1次、吹扫时间为100s，萃取结束后，把萃取液转移至25mL量瓶中，用甲醇清洗萃取瓶3次并合并至容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得待测样品溶液。
所述步骤(4)中，不同浓度的齐墩果酸和熊果酸的对照品溶液按体积比为1:1进行混合。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明采用快速溶剂萃取法提取女贞子药材，时间仅需10min，提取效率大为提高。
2.本发明使用150mm×2.1mm，3μm Thermo Acclaim C30色谱柱分析时间仅为88min，分析效率提高了至少4倍。
3.流动相使用0.2％醋酸作为流动相配制过程更简便。
具体实施方式
实施例1
(1)制备对照品溶液：分别精密称取齐墩果酸对照品54.2mg至50mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度为1.084mg/mL对照品溶液；精密称取熊果酸对照品81.6mg至100mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度为0.8160mg/mL对照品溶液。
(2)制备待测样品溶液：取女贞子药材待测样品研成粉末，精密称取样品粉末0.5g，与1g硅藻土混合均匀后，置预先铺上纤维滤膜的5mL萃取池中，加入硅藻土以填满萃取池为宜，拧紧萃取池上盖，进行快速溶剂萃取，萃取溶剂为甲醇、萃取温度100℃、静态萃取时间6min、冲洗体积100％、静态萃取1次、吹扫时间为100s，萃取结束后，把萃取液转移至25mL量瓶中，用甲醇清洗萃取瓶3次并合并至容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得待测样品溶液。
(3)制定标准曲线：分别精密吸取上述2个对照品储备液各0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2mL，置6个10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得一系列混合对照品溶液，上高效液相色谱仪进行定量测定。以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程及相关系数，齐墩果酸Y＝4785.9528X+98.7319，R2＝0.9999。熊果酸Y＝7906.0774X+1.2709，R2＝0.9997，齐墩果酸在9.84～131.08μg/mL、熊果酸在7.655～92.85μg/mL内呈良好的线性关系。
色谱条件：150mm×2.1mm，3μm Thermo Acclaim C30色谱柱，进样量1μ量，以体积比为88∶12的乙腈-0.2％醋酸溶液为流动相，检测波长为205nm，柱温18℃，体积流量0.2mL/min。
(4)测定待测样品溶液：取待测样品溶液上高效液相色谱仪进行定量测定，色谱条件与步骤(4)相同，获得齐墩果酸和熊果酸的峰面积，然后根据齐墩果酸和熊果酸的标准曲线获得待测样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。
(5)精密度：取混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果峰面积RSD分别为1.5％、1.7％，表明仪器精密度良好。
(6)稳定性试验：取女贞子供试品溶液，室温下放置，分别于0、1、3、6、12h测定，记录峰面积。结果女贞子中齐墩果酸峰面积的RSD为2.2％，熊果酸峰面积的RSD为2.5％。
(7)重复性试验：取女贞子供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，测得女贞子中齐墩果酸质量分数的RSD为2.2％，熊果酸质量分数的RSD为1.6％。
(8)加样回收试验：取女贞子供试品溶液按上述色谱条件进行测定，齐墩果酸加样回收率为96.0％～100.2％，RSD为0.5％～1.5％；熊果酸回收率为97.1％～100.7％，RSD为0.4％～1.5％。
(9)样品测定：共取女贞子3批按上述方法进样检测，结果3批样品中齐墩果酸含量分别为1.8905％、1.5547％、1.5948％；熊果酸含量分别为0.6502％、0.5735％、0.6029％。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不是限制，因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。