本发明涉及生物信号分子检测技术领域，尤其涉及一种微萃取/微电极双功能探针及其制备方法和应用。
背景技术：
近年来，通过精准调控细胞内外信号转导实现精准的疾病分类及诊断，制定具有个性化的疾病预防和治疗方案，悄然成为生命科学研究中的中心问题，研究“多通路信号分子的协同作用”是实现精准调控细胞信号转导系统的最有效前提。由于细胞信号转导过程需要多个通路共同完成(协同或拮抗作用)，因此了解信号转导系统的组成及多通路信号分子的协同作用，对于深入认识生命过程和揭示生命的本质具有重要意义，有助于阐明疾病的发生和发展的机制，并为精准医学提供思路，达到预防和治疗疾病的目的。
多年来细胞信号转导系统的研究取得了很多激动人心的进展。多途径、多层次的细胞信号通路具有收敛或发散的特点。细胞信号分子协同作用研究中采用的主要方法是基于细胞内生物大分子间的相互作用、生物大分子与小分子相互作用等许多分子间相互作用信息的获取，化学信号分子作为信号转导通路系统中的关键因子，是信号通路之间的沟通基质。目前国内外检测小分子信号分子时，通常采用高效液相色谱法、电化学、毛细管电泳法、表面增强拉曼散射光谱法、比色法、荧光及质谱检测等方法。这些方法虽然比较成熟，但存在许多缺点，操作复杂，无法实现多通路精准定位、实时定量分析。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种微萃取/微电极双功能探针及其制备方法和应用。本发明制得的双功能探针集微萃取和微电极为一体，具有磁性导航、实时精准定位、高富集性能，可实现多层次复杂信号转导过程中信号分子的高效混合模式定位定量分析。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种微萃取/微电极双功能探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供碳纳米纤维/碳纤维材料，所述碳纳米纤维生长在碳纤维表面，具有仿生毛毛虫空间立体三维结构；
(2)对所述步骤(1)得到的碳纳米纤维/碳纤维材料中碳纤维的一端进行表面化学活化处理，得到活化碳纳米纤维/碳纤维；
(3)将Fe3O4纳米颗粒分散液涂覆到所述步骤(2)得到的活化碳纳米纤维/碳纤维上，得到Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维；
(4)将一根所述步骤(1)得到的碳纳米纤维/碳纤维和一根所述步骤(3)得到的Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维装入透析膜内，得到微萃取/微电极双功能探针。
优选地，所述步骤(1)中碳纤维的直径为5～8μm，所述碳纳米纤维的直径为20～70nm。
优选地，所述步骤(2)中表面化学活化处理为氧化或酰胺化。
优选地，所述步骤(2)中进行表面化学活化处理的一端的长度为0.5～2cm。
优选地，所述步骤(3)中Fe3O4纳米颗粒的直径小于50nm。
优选地，所述步骤(3)中涂覆为喷涂或浸渍。
优选地，所述步骤(3)中Fe3O4纳米颗粒分散液的浓度为0.05～0.1mg/mL。
优选地，所述Fe3O4纳米颗粒分散液的涂覆量为0.05～0.1mg/cm2。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制得的微萃取/微电极双功能探针，所述微萃取/微电极双功能探针包括碳纳米纤维/碳纤维和Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维，所述碳纳米纤维/碳纤维具有仿生毛毛虫结构，所述Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维具有仿生眼镜蛇结构。
本发明还提供了上述技术方案所述微萃取/微电极双功能探针在细胞内多通路痕量信号分子检测中的应用。
本发明提供了一种微萃取/微电极双功能探针的制备方法，包括以下步骤：提供碳纳米纤维/碳纤维材料，所述碳纳米纤维生长在碳纤维表面，具有仿生毛毛虫空间立体三维结构，对所述碳纳米纤维/碳纤维材料中碳纤维的一端进行表面化学活化处理后将Fe3O4纳米颗粒分散液涂覆到活化碳纳米纤维/碳纤维上，得到Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维，最后将一根碳纳米纤维/碳纤维和一根Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维装入透析膜内，得到微萃取/微电极双功能探针。本发明制得的微萃取/微电极双功能探针中碳纳米纤维(CNFs)/碳纤维(CF)具有高吸附活性和电化学性能，能够实现微萃取和微电极双功能，将磁性纳米颗粒Fe3O4修饰于CNFs表面不仅克服了磁性纳米颗粒Fe3O4容易团聚的缺点，而且提高了CF的磁响应能力，通过CNFs和Fe3O4的双向调控，制备Fe3O4/CNFs/CF复微萃取/微电极双功能探针，应用于细胞多通路痕量信号分子的高灵敏度、高富集、同步检测，实现多通路信号分子的同步检测，为细胞信号分子定位定量分析提供新型的检测方法，同时可为后续设计新型高效细胞分析仪提供必要的理论实验指导。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明实施例1制得的碳纳米纤维/碳纤维的结构示意图；
图2为本发明实施例1制备Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维的流程图；
图3为本发明实施例1制得的微萃取/微电极双功能探针的结构示意图；
图4为本发明实施例1制得的微萃取/微电极双功能探针用于豚鼠纹状体中信号分子检测示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种微萃取/微电极双功能探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供碳纳米纤维/碳纤维材料，所述碳纳米纤维生长在碳纤维表面，具有仿生毛毛虫空间立体三维结构；
(2)对所述步骤(1)得到的碳纳米纤维/碳纤维材料中碳纤维的一端进行表面化学活化处理，得到活化碳纳米纤维/碳纤维；
(3)将Fe3O4纳米颗粒分散液涂覆到所述步骤(2)得到的活化碳纳米纤维/碳纤维上，得到Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维；
(4)将一根所述步骤(1)得到的碳纳米纤维/碳纤维和一根所述步骤(3)得到的Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维装入透析膜内，得到微萃取/微电极双功能探针。
本发明提供碳纳米纤维/碳纤维材料，所述碳纳米纤维修饰在碳纤维表面，具有仿生毛毛虫空间立体三维结构。本发明对所述碳纳米纤维/碳纤维材料的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的制备方法制得即可，具体的，参考CN106353439A中公开的制备方法制得即可。
在本发明中，所述碳纤维的直径优选为5～8μm，更优选为6～7μm；所述碳纳米纤维的直径优选为20～70nm，更优选为30～50nm。
得到碳纳米纤维/碳纤维材料后，本发明对所述碳纳米纤维/碳纤维材料中碳纤维的一端进行表面化学活化处理，得到活化碳纳米纤维/碳纤维。在本发明中，所述表面化学活化处理能够在碳纳米纤维表面引入不同的含氧和/或含氮官能团，提高碳纳米纤维的表面能，增加磁性纳米粒子颗粒的结合位点，有利于将磁性纳米粒子颗粒结合到碳纳米纤维表面，同时能够防止碳纳米纤维的脱落，维持碳纳米纤维的碳纤维上的原始形貌。在本发明中，所述表面化学活化处理优选为氧化或酰胺化。本发明对所述氧化或酰胺化的具体过程没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的氧化或酰胺化常规方式即可，具体的如采用二氧化碳气体氧化、羧酸与胺的直接缩合反应，具体的，如将碳纳米纤维/碳纤维材料装入石英毛细管中，碳纳米纤维/碳纤维的一端暴露在石英毛细管外端。对裸露在毛细管外侧的碳纳米纤维/碳纤维尖端进行表面化学活化处理。
在本发明中，所述进行表面化学活化处理的碳纤维的一端的长度优选为0.5～2cm，更优选为1～1.5cm。
得到活化碳纳米纤维/碳纤维后，本发明将Fe3O4纳米颗粒分散液涂覆到所述活化碳纳米纤维/碳纤维上，得到Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维。在本发明中，所述Fe3O4纳米颗粒的直径优选小于50nm，更优选为小于20nm。本发明对所述Fe3O4纳米颗粒的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的制备方法制得即可，如采用化学沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒，具体的，将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O和浓盐酸溶解于预先经N2脱氧的去离子水中；在80℃水浴及机械搅拌条件下，将以上溶液逐滴滴加到N2保护的碱性水溶液中，滴加完后继续通入N2，同时保温搅拌；反应结束后，利用外加磁场将制得的氧化铁性纳米颗粒分离出来；将得到的四氧化三铁磁性纳米颗粒用无水乙醇清洗两遍，再用甲苯清洗两遍。
在本发明中，所述涂覆优选为喷涂或浸渍。本发明对所述喷涂或浸渍的具体方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可，具体的，如将Fe3O4纳米颗粒分散液涂覆到活化碳纳米纤维/碳纤维上或将活化碳纳米纤维/碳纤维上浸渍在Fe3O4纳米颗粒分散液中。
在本发明中，所述Fe3O4纳米颗粒分散液的浓度优选为0.05～0.1mg/mL，更优选为0.05～0.07mg/mL。
在本发明中，所述Fe3O4纳米颗粒分散液的涂覆量优选为0.05～0.1mg/cm2，更优选为0.05～0.8mg/cm2。在本发明中，所述涂覆的位置为经过表面化学活化处理的部位。
得到碳纳米纤维/碳纤维材料和Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维后，本发明将一根所述碳纳米纤维/碳纤维和一根所述Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维装入透析膜内，得到微萃取/微电极双功能探针。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制得的微萃取/微电极双功能探针，所述微萃取/微电极双功能探针包括碳纳米纤维/碳纤维和Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维，所述碳纳米纤维/碳纤维具有仿生毛毛虫结构，所述Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维具有仿生眼镜蛇结构。
在本发明中，所述碳纳米纤维/碳纤维和Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维的数量比1:1。
在本发明中，所述具有仿生眼镜蛇结构的Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维中Fe3O4为仿生眼镜蛇的两个眼睛。
本发明还提供了上述技术方案所述微萃取/微电极双功能探针在细胞内多通路痕量信号分子检测中的应用。
本发明提供了上述技术方案用于检测豚鼠纹状体中神经递质细胞信号通路研究。
下面结合实施例对本发明提供的微萃取/微电极双功能探针及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
碳纳米纤维/碳纤维的制备
采用CN106353439A中公开的化学气相沉积法制备碳纳米纤维/碳纤维，碳纳米纤维的直径为20nm，碳纤维的直径为5μm，制得的碳纳米纤维/碳纤维的结构示意图为图1，由图1可以看出，制得的碳纳米纤维/碳纤维中碳纳米纤维修饰在碳纤维上，具有仿生毛毛虫空间立体三维结构。
Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维(Fe3O4/CNFs/CF)的制备
图2为制备Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维的流程图。先用铁前驱体制备Fe3O4磁性纳米颗粒：将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O和浓盐酸溶解于预先经N2脱氧的去离子水中；在80℃水浴及机械搅拌条件下，将以上溶液逐滴滴加到N2保护的碱性水溶液中，滴加完后继续通入N2，同时保温搅拌；反应结束后，利用外加磁场将制得的氧化铁性纳米颗粒(直径小于50nm)分离出来；将得到的四氧化三铁磁性纳米颗粒用无水乙醇清洗两遍，再用甲苯清洗两遍。
将5厘米的碳纳米纤维/碳纤维装入石英毛细管(直径10μm)中，1厘米暴露在石英毛细管外端。对裸露在毛细管外侧的碳纳米纤维/碳纤维尖端进行二氧化碳氧化处理，通过将活化的碳纳米纤维/碳纤维浸渍到Fe3O4磁性纳米颗粒分散液(浓度0.07mg/mL)中，使Fe3O4磁性纳米颗粒结合到碳纳米纤维的表面，在60℃的温度下热处理，去除石英毛细管，最终得到本发明中眼镜蛇结构式Fe3O4/CNFs/CF。
微萃取/微电极双功能探针的制备
微萃取/微电极双功能探针装置改进于CMA微透析探针(透析长度：4mm；直径：0.24mm)。透析膜内装入两根功能化的碳纤维，其中一根为仿生毛毛虫结构式碳纳米纤维/碳纤维，另一根为仿生眼镜蛇结构式Fe3O4/CNFs/CF。图3为微萃取/微电极双功能探针的结构示意图，微萃取/微电极双功能探针包括一根为仿生毛毛虫结构式碳纳米纤维/碳纤维，另一根为仿生眼镜蛇结构式Fe3O4/CNFs/CF。
信号分子精准定位富集
成年雄性豚鼠在室温和自然光照周期环境中饲养。豚鼠经10％的水合氯酸腹腔注射麻醉后，置于精密立体定位仪上并用恒温垫维持正常体温。豚鼠经开颅和去除软脑膜后，利用微透析导轨(CMA,透析长度：4mm，直径：0.24mm)用标准立体定位程序将微萃取/微电极双功能探针植入豚鼠纹状体(AP＝0mm,L＝3mm from bregma,V＝4.5mm from dura)，然后用骨钉和牙科水泥固定。通过立体定位程序实现豚鼠纹状体的精准定位，仿生毛毛虫结构式碳纳米纤维/碳纤维同时作为微电极响应纹状体的电化学信号和微萃取头进行信号分子全富集(见图4)；豚鼠头脑施加磁场，通过调控磁场进而控制眼镜蛇结构式Fe3O4/CNFs/CF运动路径，扫描纹状体周边的脑脊液，利用眼镜蛇结构式Fe3O4/CNFs/CF微电极的电化学信号变化，定位信号分子释放位点，利用眼镜蛇结构式Fe3O4/CNFs/CF材料的高富集性能实现信号分子释放位点化合物的全富集。
仿生毛毛虫结构式碳纳米纤维/碳纤维和仿生眼镜蛇结构式Fe3O4/CNFs/CF首先作为微电极同时检测纹状体和纹状体周边脑脊液中电信号变化；给予豚鼠吹风等外界刺激，观察两个微电极的电信号变化；碳纳米纤维/碳纤维微电极在豚鼠纹状体原位捕获电信号，Fe3O4/CNFs/CF微电极在外磁场辅助下扫描纹状体周边脑脊液，同时观察电信号。通过两个微电极的电信号变化确定外界刺激下豚鼠纹状体周边脑脊液中信号分子释放位点，并记录外加磁场运动轨迹及施加磁场大小；实现信号分子释放位点定位后，撤掉电源，仿生毛毛虫结构式碳纳米纤维/碳纤维和眼镜蛇结构式Fe3O4/CNFs/CF作为微萃取探针使用，保持外加磁场不变，碳纳米纤维/碳纤维和Fe3O4/CNFs/CF微萃取探针进行原位全富集信号分子；
通过碳纳米纤维/碳纤维和Fe3O4/CNFs/CF两个微电极电信号变化情况可以判定纹状体和纹状体周边脑脊液中信号分子释放先后顺序及释放位点。通过碳纳米纤维/碳纤维和Fe3O4/CNFs/CF两个微萃取探针富集的信号分子可以探究信号分子间的协同作用，为研究细胞信号通路提供指引。
实施例2
碳纳米纤维/碳纤维的制备
采用CN106353439A中公开的化学气相沉积法制备碳纳米纤维/碳纤维，碳纳米纤维的直径为50nm，碳纤维的直径为7μm，制得的碳纳米纤维/碳纤维中碳纳米纤维修饰在碳纤维上，具有仿生毛毛虫空间立体三维结构。
Fe3O4/碳纳米纤维/碳纤维(Fe3O4/CNFs/CF)的制备
将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O和浓盐酸溶解于预先经N2脱氧的去离子水中；在80℃水浴及机械搅拌条件下，将以上溶液逐滴滴加到N2保护的碱性水溶液中，滴加完后继续通入N2，同时保温搅拌；反应结束后，利用外加磁场将制得的氧化铁性纳米颗粒(直径小于20nm)分离出来；将得到的四氧化三铁磁性纳米颗粒用无水乙醇清洗两遍，再用甲苯清洗两遍。
将5厘米的碳纳米纤维/碳纤维装入10μm的石英毛细管中，2厘米暴露在石英毛细管外端。对裸露在毛细管外侧的碳纳米纤维/碳纤维尖端进行羧酸与胺的直接缩合反应，通过将活化的碳纳米纤维/碳纤维浸渍到Fe3O4磁性纳米颗粒分散液(浓度0.05mg/mL)中，使Fe3O4磁性纳米颗粒结合到碳纳米纤维的表面，在60℃的温度下热处理，去除石英毛细管，最终得到本发明中眼镜蛇结构式Fe3O4/CNFs/CF。
微萃取/微电极双功能探针的制备
微萃取/微电极双功能探针装置改进于CMA微透析探针(透析长度：4mm；直径：0.24mm)。透析膜内装入两根功能化的碳纤维，其中一根为仿生毛毛虫结构式碳纳米纤维/碳纤维，另一根为仿生眼镜蛇结构式Fe3O4/CNFs/CF。图3为微萃取/微电极双功能探针的结构示意图，微萃取/微电极双功能探针包括一根为仿生毛毛虫结构式碳纳米纤维/碳纤维，另一根为仿生眼镜蛇结构式Fe3O4/CNFs/CF。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。