本发明涉及医疗用药品领域的蛋白质。详细而言，涉及参与血液凝固的血管性血友病因子(vonwillebrandfactor：以下有时称作“vwf”)的特异性剪切酶(以下称作“adamts13”)的全长或者部分片段在临床领域的新用途。具体而言，本发明涉及adamts13的全长或者部分片段在肝功能障碍、肝缺血/再灌流障碍和肝移植领域的新用途。
背景技术：
肝脏是负责代谢、解毒(酒精或有害物质的解毒)、生物体防御(免疫)的重要脏器。急性肝炎主要是指因感染肝炎病毒而发生的呈现急性肝功能障碍的疾病，其症状有黄疸、食欲不振、呕气呕吐、全身疲倦感、发热等。迄今为止，作为肝炎病毒，确认有甲、乙、丙、丁、戊型这5种。急性肝炎通常是经过良好的疾病，约1-2%的患者会暴发化，一旦暴发化，则高频率致死的可能性增加，需要肝脏移植治疗。
急性肝炎的前期症状为所谓的感冒样症状(发热、咽喉痛、头痛)，疾病初期经常被诊断为感冒而配以感冒药的例子并不少见。这个时间点的急性肝炎的诊断较为困难。显示发生肝功能障碍的特异性症状是黄疸，通常从出现眼球发黄、皮肤发黄的数天前开始会观察到褐色尿。褐色尿是指呈乌龙茶样的颜色的尿，在黄疸进行的同时尿色变黑呈可乐样的颜色。在出现黄疸的几乎同一时期会出现食欲不振、全身疲倦感、呕气、呕吐等症状。
在急性肝炎的诊断中，除上述自觉症状以外，检查所见有作为肝细胞内的酶的alt(gpt)、ast(got)显著上升、或者作为黄疸指标的胆红素值上升。这些数值的上升显示广泛发生了肝细胞障碍。起因病毒的诊断是对各病毒进行特异性的血液检查，确定原因病毒。即，甲型为igmha抗体阳性；乙型为igmhbc抗体阳性、hbs抗原阳性；丙型为hcv-rna阳性、hcv抗体阳性；非甲乙丙型为igmha抗体阴性、igmhbc抗体阴性、hcv-rna阴性、抗核抗体阴性(自身免疫性肝炎的否定)、已知的病毒感染的否定。
作为重症度的诊断，通过血液检查，根据敏锐地反映肝储备功能的凝血酶原时间、肝促凝血酶原激酶时间的血液凝固功能检查，显示肝功能障碍的重症度。另外，普通的急性肝炎不会显示出意识障碍，但在急性肝炎暴发化而发生广泛的肝细胞障碍时，因肝储备功能显著下降，故肝脏的解毒功能下降。各种中毒物质无法通过肝脏代谢排泄而储留在体内，因此引起脑功能障碍，呈现昼夜颠倒、谵妄、嗜睡倾向、昏睡等症状。因肝储备功能下降而发生的意识障碍称作肝性昏睡。根据凝血酶原时间和意识障碍的程度，将急性肝炎分为普通型、重症肝炎、暴发性肝炎这3个重症度。一旦发生暴发化，则高频率致死的可能性增加，需要肝脏移植治疗。
急性肝炎的经过和重症度根据其原因病毒而不同。甲型肝炎、戊型肝炎是一过性地经过，不会变成慢性。若是在新生儿、儿童期感染乙型肝炎，则常常会变成慢性，但成人例中的感染原则上是一过性感染经过，很少会变成慢性。丙型肝炎与感染时的年龄无关，常常会变成慢性。认为急性肝炎发生重症化、暴发化而死亡的概率如下：在乙型和非甲乙丙型肝炎中为1-2%、在丙型和甲型肝炎中为0.5%以下。甲型肝炎虽然本身的死亡率低，但通过经口感染而在家族内发生二次感染等，有时会呈爆发式流行。另外，最近在50岁以上的高龄者的感染例中重症化病例增加，需要注意。
除丙型肝炎以外，急性肝炎都是一过性地经过、本来是容易自然治愈的疾病。在急性肝炎的治疗上最重要的观察点在于看清是否经过了极期。当怀疑向重症化、暴发化转移时，立即需要专业医生的治疗。在没有发生重症化、暴发化时，急性肝炎的生命预后非常良好，甲型、乙型肝炎会建立终生免疫而不会再感染，而丙型肝炎在经过急性期后，对于迁延化、慢性化需要干扰素治疗。
作为药物治疗，虽然基本上都是不需要特别给药的例子，但在急性期往往会告知食欲不振、全身疲倦感而进行输液。肾上腺皮质类固醇是强效的抗炎药、免疫抑制剂的一种。肾上腺皮质激素抑制作为肝炎病毒的排除机制的免疫应答，有可能导致肝炎的迁延化，因此在普通的急性肝炎中不给予肾上腺皮质激素，但在有可能向重症肝炎、暴发性肝炎转移时，通过在最早期给予药物以进行免疫应答抑制，可以期待治疗效果。另外，在高度的黄疸持续时，肾上腺皮质激素有时也会奏效。但从副作用方面考虑，也不应该随意使用，在开始给予后也要尽量短期给予。
在乙型急性肝炎的重症化例、迁延化例中，给予作为抗病毒药的拉米夫定或恩替卡韦。抗病毒药的给予、中止的判断由专业医生来进行。在丙型急性肝炎的自然经过中约50-90%的病例发生迁延化、慢性化。为了防止丙型急性肝炎的慢性化，给予干扰素(ifn)达2～6个月。ifn给予时的注意事项与慢性肝炎的情形相同，由于会出现各种副作用，所以根据专业医生的管理来进行治疗。
在肝脏中，流经门脉和动脉的血液在网状窦(sinusoid：相当于体循环的毛细血管)中混合，流出到肝静脉。肝脏的门脉终末(终末门脉枝)和肝动脉终末形成窦(sinusoid)，流入中央静脉(终末肝静脉)。如体循环的毛细血管系统一样，窦作为肝脏的微小循环系统参与和肝细胞的各种物质交换(营养素、氨等)。
血栓性微小血管障碍(thromboticmicroangiopathy；tma)是危及生命的疾病之一，以全身的血小板聚集、从而多脏器功能不全为特征。作为tma范畴所包含的有名的综合征，有1924年由moschcowitz最初报道的伴有5个症候(血小板减少、微小血管障碍性溶血性贫血、发热、肾功能障碍、精神神经障碍)的血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthrombocytopenicpurpura:ttp)和伴有3个症候(血小板减少、微小血管障碍性溶血性贫血、急性肾功能不全)的溶血性尿毒症综合征(hemolyticuremicsyndrome:hus)。当未出现这些典型的症候时，两者往往难以区別，因此记作ttp/hus、或者作为包括两者的病态而称作tma的情形也不少见。
tma作为感染症，最多的是在由0157或0111的肠道出血性大肠杆菌引起的肠炎后发生的感染症，此外也因药剂或骨髄移植、肝移植而发生。作为tma的其他病因，认为是adamts13的异常。adamts13是属于金属蛋白酶这一组的蛋白剪切酶，其仅剪切与止血有关的vwf。vwf本来是由血管内皮细胞作为ul-vwfm(超巨大-vwf多聚体)的大块而产生，被adamts13细切而形成适当大小的vwf，从而显示出适当的止血作用。然而，若adamts13的功能大幅下降，则残留大小不适当的vwf，发挥多余的止血作用，在血管内产生血小板血栓。血管越细就越容易由vwf产生血栓，因此认为在微小血管内产生血小板血栓，发生tma。
在因该adamts13的活性降低而发生的tma中，已知(1)肾功能障碍较轻、(2)发热、(3)形成精神障碍强的血栓性血小板减少性紫癜(ttp)。连同(4)血小板减少、(5)溶血性贫血在内，称为ttp的五个症候。但是，据报道凑齐所有症状的几率为30%左右。
作为adamts13的活性大幅降低的原因，有先天的基因异常和后天因素。因adamts13的先天基因异常而发生tma的疾病称作upshaw-schulman综合征。这是一种从刚刚出生时起就发生重症黄疸和血小板减少的罕见疾病。作为adamts13的后天活性降低的原因，抗adamts13的自身抗体(igg型)最为重要。原因不明时称为特发性，由其他疾病引起发病时称作二次性或继发性等。从婴幼儿到高龄者广泛发病，据报道男女比例为1:2，女性略多。据报道发病率为人口100万人中有4人左右，但由于近年的诊断技术的提高，推测最近会更多。
测定adamts13活性对评价tma的病势有用，但还有时adamts13的活性不会降低，仅通过该检查，并不能排除tma，这一点应该注意。以血栓性血小板减少性紫癜(ttp)的名称注册在国家的难治性疾病克服研究事业临床调查研究领域的对象中。
针对典型的tma的标准疗法是初期血浆交换(pe)，日本目前的治癒率达到了90%。然而，现状是肝移植后的tma的致死率依然非常高。
作为ttp的机理，认为其理由如下：由内皮细胞产生的超巨大分子量vwf多聚体(ul-vwfm)在adamts13活性降低时未被剪切，在细小血管等产生高的剪切应力的部分引起过剩的血小板凝集、血栓形成(blood,2008;112:11-18(非专利文献1))。
作为ttp治疗中的问题点，可以列举如下：(1)在临床诊断中，ttp/hus的诊断比较容易，当存在adamts13的重度缺乏(<5%)时也能够排除hus(特异性为90%)，但检查灵敏度不明确；(2)根据ttp/hus的原因，血浆交换有时无效(jclinapher2012;27:112-116(非专利文献2))；(3)aquiredttp的复发率依然高达20～50%。
确立了血浆交换在idiopathicttp中的有效性。虽然ttp的复发率高是一个问题，但近年来暗示通过使用利妥昔单抗有可能减轻复发率(brjhaematol2012;158:323-335(非专利文献3))。另一方面，认为在骨髄干细胞移植后或恶性肿瘤所伴随的ttp中血浆交换不具有有效性(原疾病的治疗)。
缺血再灌流障碍是指，对处于缺血状态的脏器、组织进行血液再灌流时，在该脏器/组织内的微小循环中导致各种毒性物质的产生，由此而发生的障碍。最初的是由mccord报道的缺血/再灌流理论(mccord、nengljmed1985;312:159(非专利文献4))。障碍的程度根据缺血的时间和程度、脏器的种类等而不同。不完全缺血者有时障碍也强。认为通过再灌流引起血管内皮细胞伤害、微小循环障碍，并发展为脏器障碍。认为引起障碍的机理是：超氧化物(o2-)或羟基自由基(ho・)等活性酶或一氧化氮(no)等自由基的产生而带来的障碍；各种细胞因子、内皮素、花生四烯酸等各种化学介质产生而引起的障碍；基于活化嗜中性粒细胞与血管内皮细胞的相互作用的障碍等的机理。不仅是局部、而是二次性地对全身的主要脏器带来障碍(远隔脏器障碍)。特别是脑、肺、肝、肾等成为靶脏器，导致多脏器功能不全。在针对心肌梗塞、脑梗塞、肠系膜血管闭塞症等的再灌流疗法后或脏器移植后往往可见。
肝功能不全是由于肝细胞数减少或功能下降而呈现黄疸、腹水、肝性脑症、出血倾向等症状的疾病组，根据其经过分为急性和慢性肝功能不全。急性肝功能不全(acuteliverfailure，急性肝功能衰竭)是正常肝脏发生坏死、炎症，通常限于直至出现肝功能不全症候为止的期间在6个月以内的病例。暴发性肝炎是其代表性的疾病，在病理组织学上以广泛、亚广泛肝坏死为特征，呈现全身性炎症反应综合征(sirs:systemicinflammatoryresponsesyndrome)的病态，并发多脏器功能不全(mof:multipleorganfailure)，往往预后不良。
由于各种疾病即使通过内科治疗也不见功能恢复的肝功能不全状态的肝脏，若不替换成所提供的健康肝脏，则无法维持身体的基本功能，因此进行肝移植。作为肝脏移植的适应疾病，在成人中可以列举肝硬化(乙型肝硬化、丙型肝硬化、酒精性肝硬化、自身免疫性肝硬化、非乙非丙型肝硬化)、胆汁郁积性疾病(原发性胆汁性肝硬化(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)、byler病、卡罗利病(carolidisease，先天性肝内胆管扩张)、胆道闭锁症(ba))、暴发性肝炎、代谢性疾病(血色病等)、肝脏肿瘤(肝癌(原发性、转移性)、良性肿瘤)等。
另一方面，在儿童中可以列举：胆汁郁积性疾病(胆道闭锁症、alagir综合征、byler病、总胆管扩张症、卡罗利病等)、肝硬化(自身免疫性肝炎等)、代谢性疾病(a-1抗胰蛋白酶缺乏症等)、新生儿肝炎、暴发性肝炎、肝脏肿瘤(肝肉芽肿、肝细胞癌等)等。
肝移植时，从捐献者摘出的移植预定的肝脏在身体外调整形状使其容易移植，之后保存在冷的保存液中直至移植为止。
adamts13(adisintegrin-likeandmetalloproteinasewiththrombospondintype1motifs13)是止血因子vonwillebrand因子(vwf)的特异性剪切酶，于2001年作为属于adamts家族的锌型金属蛋白酶是第13个被发现者。
vwf是由包含2050个氨基酸残基的单一亚单元以n末端之间、以及c末端之间的方式形成二硫键，具有特有的高分子量结构，作为超高分子量vwf多重体(异常大的vwf多聚体;ul-vwfm)而产生。adamts13通过特异性地剪切vwf亚单元的ty842-met843(在cdna表记中为tyr1605-met1606)键，减小vwf的分子量大小，由此防止由ul-vwfm引起的过剩的血小板凝集，具有调节成“适合形成止血血栓、但不会形成病态血栓”的作用。
adamts13本来是被鉴定为作为血液难治性疾病的血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthrombocytopenicpurpura;ttp)的原因的关键酶，明确了在该疾病的病态查明的经过中明确的adamts13/vwf(酶/底物)的均衡破绽所产生的“由血小板血栓引起的微小循环障碍”形成了各种疾病的基础病态。
adamts13基因位于染色体9q34中，cdna由29个外显子构成，从起始密码子到终止密码子为4281bp，以氨基酸计是1427个残基的较大的蛋白。另外，分子内有10个asn结合型糖链，分子量总计为约190kd。一次结构是从n末端起到信号肽(s)、前肽(p)、reprolysin型金属蛋白酶结构域(mp)、解联蛋白样结构域(d)、血小板反应蛋白1型(tsp1)基序(t1～8)、富含半胱氨酸的结构域(c)、间隔结构域(sp)、再次tsp1基序的重复、之后是c末端的2个cub结构域。认为该酶的asn结合型糖链对来自细胞的分泌功能较为重要。adamts13的产生脏器最初确定为肝脏、而其产生细胞确定为肝星细胞(旧伊东细胞)。研究显示肝星细胞通过向成纤维细胞转化，与肝硬化的进展密切相关。由此显示：随着肝硬化的进展，adamts13活性降低(uemuram,fujimuray,matsumotom,等人:comprehensiveanalysisofadamts13inpatientswithlivercirrhosis.thrombhaemost2008;99:1019-1029(非专利文献5))。此外，还报道了该酶存在于血小板、血管内皮细胞、肾脏的足细胞中。
虽然上述各脏器/细胞中的该酶产生的意义尚未明确，但认为对维持血中adamts13浓度最重要的脏器是肝脏(藤村吉博、thejournalofjapanesecollegeofangiology第51卷no.3,2011(非专利文献6))。其根据有以下2点。(1)在因先天性胆道闭锁症而陷入胆汁性肝硬化的末期(晚期)患者中，血中adamts13活性下降至20～30%，显示出溶血性贫血、血小板减少、肾功能障碍等作为血栓性微小血管障碍症(thromboticmicroangiopathy;tma)的病理所见的3个症候，但对患者进行活体肝移植而生长时，上述tma所见消失(matsumotom,chisuwah,nakazaway,等人:livertransplantationrescuesadeficientstateofvonwillebrandfactorcleavingproteaseactivityinpatientswithlivercirrhosisduetocongenitalbiliaryatresia.blood2000:96:636a(abstract))(非专利文献7)；(2)主要由丙型肝炎引起的肝硬化成人患者的临床症状的严重度与血中adamts13活性平行，另外在末期例中其活性下降至20～30%(uemuram,tatsumik,matsumotom,等人:localizationofadamts13tothestellatecellsofhumanliver.blood2005;106:922-924(非专利文献8))。
2008年chauhan等人报道了adamts13向下调节(downregulation，减量调节)血栓和炎症的双反应的成绩(chauhanak,kisuckaj,brilla,等人:adamts13:anewlinkbetweenthrombosisandinflammation.jexpmed2008;205:2065-2074(非专利文献9))。由此显示：adamts13还具有抗血栓和抗炎的双重作用，因此有望成为脑梗塞的治疗药。即，zhao等人(zhaobq,chauhanak,canaultm,等人:vonwillebrandfactor-cleavingproteaseadamts13reducesischemicbraininjuryinexperimentalstroke.blood2009;114:3329-3334(非专利文献10))以及fujioka等人(fujiokam,hayakawak,mishimak,等人:adamts13genedeletionaggravatesischemicbraindamage:apossibleneuroprotectiveroleofadamts13byamelioratingpostischemichypoperfusion.blood2010;115:1650-1653(非专利文献11))利用小鼠中大脑动脉闭塞模型进行脑缺血再灌流实验，人工制作脑梗塞，在计算脑梗塞体积时，与野生型小鼠相比，adamts13敲除小鼠的脑梗塞体积明显增加(非专利文献10)。另外，在脑梗塞部分的组织所见中确认到：在敲除小鼠组中微小血栓多，炎症细胞的浸润多。显示了这些血栓是富含vwf的血栓，作为敲除小鼠中脑梗塞的范围变大的原因，估计是含有许多vwf的血小板血栓和白细胞的过剩浸润。而且，还报道，对于野生型小鼠，在即将再灌流之前给予基因表达人adamts13制剂时，脑梗塞范围明显缩小(非专利文献11)。如上所述，小鼠实验的结果显示了adamts13制剂作为脑梗塞治疗和预防药的可能性。
adamts13活性的丧失与多个状态、例如ttp(moakejl,seminhematol.2004jan;41(1):4-14(非专利文献12))、急性和慢性炎症(chauhan等人,jexpmed.2008sep1;205(9):2065-74(非专利文献13))、以及最近重症热带热疟疾原虫(恶性疟原虫，plasmodiumfalciparum)疟疾(larkin等人,plospathog.2009mar;5(3):e1000349(非专利文献14))有关。
迄今为止，对于与形成和/或存在1个以上的血栓有关的障碍使用adamts13制剂。与形成和/或存在1个以上的血栓有关的障碍的例子有：遗传性血栓性血小板减少性紫癜(ttp)、后天性ttp、动脉血栓症、急性心肌梗塞(ami)、脑中风、败血症和接种性血管内凝固(dic)。
adamts13制剂还用于梗塞的治疗或预防。梗塞的例子有：心肌梗塞(心脏病发作)、肺塞栓症、脑中风这样的脑血管现象；外周动脉闭塞性疾病(坏疽等)、抗磷脂综合征、败血症、巨细胞性动脉炎(gca)、疝气和肠扭转。
在国际公开第2005/062054号小册子(专利文献1)中，给出了以定量adamts13为特征的血栓形成倾向的程度或血栓症的检测方法，作为上述血栓症，可以列举：急性或者慢性骨髄性白血病、急性早幼粒细胞白血病、全身性红斑狼疮、肺塞栓、脑硬塞、肝中央静脉闭塞症、急性淋巴细胞性白血病、血栓性微小血管障碍、血栓性血小板减少性紫癜、溶血性尿毒症综合征和深部静脉血栓症。另外，国际公开第2006/049300号小册子(专利文献2)中公开了dic或全身性炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome；sirs)患者的血小板血栓症或脏器障碍的检测方法，该方法是分析adamts13和/或其分解因子(例如弹性蛋白酶、纤溶酶、凝血酶)。
日本再表2007/088849(专利文献3)公开了弥散性血管内凝血综合征(dic)的病态的掌握方法，该方法是在dic患者中分析adamts13的量和/或酶活性。
日本特表2009-539757(专利文献4)公开了一种药学组合物，该组合物包含药学有效量的具有血栓溶解活性的adamts13。
日本特开2010-280571(专利文献5)公开了：使用adamts13家族蛋白作为细胞辅助剂以提高移植细胞的存活率的方法、含有该蛋白作为有效成分的细胞移植辅助剂、以及包括添加该蛋白的步骤的移植细胞的制造方法。
日本特表2013-505270(专利文献6)公开了一种adamts13制剂，该制剂适合给药，不会失去活性或不会过度凝集而能够长期保管。
迄今为止，关于adamts13与急性/慢性肝功能障碍、肝缺血再灌流障碍、肝移植和急性肝功能不全/暴发性肝炎的关系基本上还未明确，还不知将adamts13用作这些疾病的治疗药。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2005/062054号小册子
专利文献2：国际公开第2006/049300号小册子
专利文献3：日本再表2007/088849
专利文献4：日本特表2009-539757
专利文献5：日本特开2010-280571
专利文献6：日本特表2013-505270
非专利文献
非专利文献1：blood,2008;112:11-18
非专利文献2：jclinapher2012;27:112-116
非专利文献3：brjhaematol2012;158:323-335
非专利文献4：mccord,nengljmed1985;312:159
非专利文献5：uemuram,fujimuray,matsumotom,等人:comprehensiveanalysisofadamts13inpatientswithlivercirrhosis.thrombhaemost2008;99:1019-1029
非专利文献6：藤村吉博,thejournalofjapanesecollegeofangiologyvol.51no.3,2011
非专利文献7：matsumotom,chisuwah,nakazaway,等人:livertransplantationrescuesadeficientstateofvonwillebrandfactorcleavingproteaseactivityinpatientswithlivercirrhosisduetocongenitalbiliaryatresia.blood2000:96:636a(abstract))
非专利文献8：uemuram,tatsumik,matsumotom,等人:localizationofadamts13tothestellatecellsofhumanliver.blood2005;106:922-924
非专利文献9：chauhanak,kisuckaj,brilla,等人:adamts13:anewlinkbetweenthrombosisandinflammation.jexpmed2008;205:2065-2074
非专利文献10：zhaobq,chauhanak,canaultm,等人:vonwillebrandfactor-cleavingproteaseadamts13reducesischemicbraininjuryinexperimentalstroke.blood2009;114:3329-3334
非专利文献11：fujiokam,hayakawak,mishimak,等人:adamts13genedeletionaggravatesischemicbraindamage:apossibleneuroprotectiveroleofadamts13byamelioratingpostischemichypoperfusion.blood2010;115:1650-1653
非专利文献12：moakejl,seminhematol.2004jan;41(1):4-14
非专利文献13：chauhan等人,jexpmed.2008sep1;205(9):2065-74
非专利文献14：larkin等人,plospathog.2009mar;5(3):e1000349。
技术实现要素：
发明所要解决的课题
肝脏是负责人体的重要功能的非常重要的脏器，依然迫切需要作为其障碍的急性/慢性肝功能障碍、肝缺血再灌流障碍、肝移植的肝功能障碍和急性肝功能不全(急性肝衰竭)/暴发性肝炎的有效治疗药或诊断药。
用于解决课题的手段
包括肝切除或肝移植在内的肝脏外科中，规定其术式的最大因素是除肿瘤侧因素以外的(残留)肝功能、肝储备功能，但现代医疗中的肝功能正是指肝细胞功能。肝脏分为实质细胞(肝细胞：约60%)和非实质细胞(构成肝脏的窦壁的肝窦壁细胞；肝细胞以外的血管内皮细胞、kupffer细胞、星细胞等：约40%)，迄今为止，这些肝非实质细胞功能不仅在肝脏外科还在几种急性/慢性肝疾病治疗中进行评价，现状是基本上不会根据其结果来确定治疗方案。
本发明人着眼于迄今为止没有顾及到的肝非实质细胞，发现了通过评价其功能，可以评价急性/慢性肝病，确定其治疗方案。尤其是，着眼于肝非实质细胞之一的星细胞，由作为其产生蛋白的adamts13的功能/表达分析，发现了adamts13作为“肝非实质细胞功能”标志物的诊断意义，另外，在非临床试验中，看到了其基因重组制剂的显著的治疗效果。
本发明人还发现adamts13在肝缺血/再灌流障碍、肝移植后肝功能障碍或急性肝功能不全/暴发性肝炎等各种肝病中发挥显著的治疗效果，从而完成了本发明。
即，本发明包括以下内容。
[1]adamts13作为生物标志物的应用，用于监测以下的(1)～(3)：
(1)肝功能障碍、其中的肝非实质细胞障碍的病态把握；
(2)肝缺血/再灌流障碍；
(3)肝移植后的肝功能、特别是肝非实质细胞功能的指标；或者
(4)急性肝功能不全/暴发性肝炎。
[2]上述[1]所述的应用，其中，肝功能障碍为大肠癌化学疗法(化疗)后的肝功能障碍。
[3]以下的(1)～(3)所述的方法，该方法包括测定或监测由哺乳动物所得的样品中的adamts13活性：
(1)肝功能障碍、其中的肝非实质细胞障碍的检查方法；
(2)肝缺血/再灌流障碍的检查方法；
(3)肝移植后的肝功能、特别是肝非实质细胞功能的检查方法；或者
(4)急性肝功能不全/暴发性肝炎的检查方法。
[4]上述[3]所述的方法，其中，肝功能障碍为大肠癌化学疗法后的肝功能障碍。
[5]以下的(1)～(3)所述的监测用试剂盒，包括测定由哺乳动物所得的样品中的adamts13活性的手段：
(1)肝功能障碍发病监测用试剂盒；
(2)肝缺血/再灌流障碍监测用试剂盒；
(3)肝移植后的肝功能监测用试剂盒；或
(4)急性肝功能不全/暴发性肝炎监测用试剂盒。
[6]上述[5]所述的监测用试剂盒，其中，肝功能障碍为大肠癌化学疗法后的肝功能障碍。
[7]上述[3]～[6]中任一项所述的应用、方法或试剂盒，其中，哺乳动物为人。
[8]药物组合物，其含有adamts13或adamts13的修饰体作为有效成分。
[9]选自肝功能障碍、肝缺血/再灌流障碍、肝移植后的肝功能障碍和急性肝功能不全/暴发性肝炎的疾病的治疗药，该治疗药包含adamts13或adamts13的修饰体。
[10]上述[8]或[9]所述的药物组合物或治疗药，其中adamts13的修饰体是包含作为adamts13的活性表达最小单位的从金属蛋白酶结构域至间隔结构域的分子。
[11]上述[10]所述的药物组合物或治疗药，其中，adamts13的修饰体是adamts13的1427个氨基酸残基中缺失了第689位的氨基酸～c末端侧的c末端缺失修饰体w688x(“adamts13w688x蛋白”)。
[12]选自哺乳动物的肝功能障碍、肝缺血/再灌流障碍、肝移植后的肝功能障碍和急性肝功能不全/暴发性肝炎的疾病的诊断方法，该方法包括筛选哺乳动物的肝非实质细胞中的adamts13活性的降低。
发明效果
本发明涉及adamts13的全长或部分片段在临床领域的新用途，根据本发明，通过使用adamts13，能够快速且准确地诊断急性/慢性肝功能障碍，可以提供肝功能障碍、肝缺血/再灌流障碍、肝移植后的肝功能障碍和急性肝功能不全/暴发性肝炎的有效治疗药。
附图说明
[图1]图1中虽然由肝细胞功能估计肝储备功能充分高，但由于非实质细胞功能极度降低，在肝切除术后还存在陷入肝功能不全的病态。作为一例，图1显示肝移植中的冷保存/热再灌流障碍。在冷保存6、24小时的2组间，血流再通后的肝脏逸脱酶(＝肝细胞障碍)没有显著差异，但adamts13活性非常敏锐地与移植肝的冷保存时间逆相关。这是与肝细胞相比在窦壁细胞中冷缺血再灌流障碍更强的实证(査証)。
[图2]图2是显示大肠癌化学疗法后的肝功能障碍的基本状态为肝非实质细胞障碍的图。虽然肝细胞障碍(ast/alt等)轻微、蛋白合成能力、凝固能力等肝细胞功能也处于正常范围内，但其adamts13活性差不多下降至正常肝的12%。在现代医疗中这是几乎没有评价的肝非实质细胞障碍，是对大肠癌的转移性肝肿瘤进行肝切除后导致肝功能不全的要因之一。nc：正常肝；a24：单猪屎豆碱给予24小时后；a48：单猪屎豆碱给予48小时后；t24：单猪屎豆碱+治疗药的给予24小时后；t48：单猪屎豆碱+治疗药的给予48小时后。
[图3]图3是显示血中adamts13活性与肝功能不全的程度(meld:末期肝病模型(modelforend-stageliverdisease),child-pugh:child分类)逆相关的临床数据的图。
[图4]图4是显示在生物体(活体)肝移植后早期adamts13活性锐减的图。
[图5]图5是显示在儿童和成人中比较肝移植后的adamts13活性的数据的图。
[图6]图6是显示即使在成人例的研究中在相对过小的移植中adamts13活性的恢复也进一步延迟的图。
[图7]图7是显示在肝移植后早期vwf活性骤增和adamts13活性锐减并存的图。
[图8]图8是显示在肝移植后存在vwf/adamts13失衡的图。
[图9]图9是显示用于研究adamts13在肝缺血/再灌流障碍中的作用的实验流程的示意图。
[图10]图10是显示再灌流后的血浆adamts13活性的图。
[图11]图11是显示iri后的血小板数和ldh释放的图。
[图12]图12是显示iri后的转氨酶释放的图。
[图13]图13是显示敲除小鼠中的组织损伤通过重组adamts13而改善的照片。
[图14]图14是显示敲除小鼠中的组织损伤通过重组adamts13而改善的图。
[图15]图15是显示敲除小鼠中的大量的血小板聚集通过给予重组adamts13而显著改善的照片。
[图16]图16是显示敲除小鼠中的大量的血小板聚集通过给予重组adamts13而显著改善的图。
[图17]图17是显示adamts13抑制iri后的炎症性细胞因子表达的图。
[图18]图18是显示adamts13抑制iri后的炎症性细胞因子、趋化因子表达的图。
[图19]图19是显示用于研究adamts13在肝缺血/再灌流障碍中的作用的实验流程的示意图。
[图20]图20是显示通过肝缺血/再灌流，vwf活性骤增和adamts13活性锐减并存的图。
[图21]图21是显示iri后的血小板数和ldh释放的图。
[图22]图22是显示iri后的转氨酶释放的图。
[图23]图23是显示20%部分肝移植后的动物的存活率的图。
[图24]图24是显示20%部分肝移植后的转氨酶释放的图。
[图25]图25是显示20%部分肝移植后的ldh释放和血小板减少症的图。
[图26]图26是显示通过对20%部分肝移植模型给予重组adamts13，即使在病理学上也维持移植肝的健康性的照片。
[图27]图27是显示通过对20%部分肝移植模型给予重组adamts13，即使在病理学上也维持移植肝的健康性的图。
[图28]图28a是显示通过肝缺血再灌流，vwf活性骤增和adamts13活性锐减并存的定量rt-pcr的结果的图。图28b是显示通过70%部分肝缺血再灌流，血中adamts13活性值下降至30%左右，24小时后也未恢复的图。
[图29]图29是显示在实验4组中再灌流后的血浆adamts13活性(a)和iri后的外周血中的血小板数(b)的图。结果证明外周血血小板数与血浆adamts13活性值成正比(血中adamts13活性越高，越能维持外周血血小板数)。
[图30]图30是显示对肝缺血再灌流后的肝组织进行的cd42b荧光免疫染色的照片(肝组织中的血小板被荧光浓染成红色)。与野生型相比，在adamts13敲除小鼠的肝内发生了大量的血小板凝集，但通过给予重组adamts13，无论是敲除小鼠还是野生型小鼠，肝内的血小板凝集均显著改善。
[图31]图31左是使用图像分析软件(image-j、nih、美国)定量图30的血小板荧光免染的图，显示了在敲除小鼠和野生型小鼠中通过给予重组adamts13，大量的血小板聚集显著改善的图。图31右是显示通过laserdopplerflowmeter(o2c、lea公司、德国)测量的肝组织血流(微小循环)的测量结果的图。与肝组织的血小板血栓的形成逆相关，肝组织血流(微小循环)有所改善。
[图32]图32是显示iri后的转氨酶释放(a和b)和ldh释放(c)的图。结果显示：与野生型相比，在adamts13敲除小鼠中肝功能障碍加重，但通过给予重组adamts13，无论是敲除小鼠还是野生型小鼠，肝功能障碍均明显改善。
[图33]图33是显示肝缺血再灌流后的肝组织图像的照片。敲除小鼠和野生型小鼠中的组织损伤均通过重组adamts13而改善。
[图34]图34是显示敲除小鼠和野生型小鼠中的组织损伤通过重组adamts13而改善的图。
[图35]图35是显示adamts13抑制iri后的炎症性细胞因子表达(tnfα、il-1β、il-6、il-10)、趋化因子表达(cxcl-2、-10)的图。
[图36]图36是在免疫组织学上显示敲除小鼠和野生型小鼠中的巨噬细胞(单核细胞)的浸润通过重组adamts13而改善的照片和图。
[图37]图37是在免疫组织学上显示敲除小鼠和野生型小鼠中的嗜中性粒细胞的浸润通过重组adamts13而改善的照片和图。
[图38]图38是在免疫组织学上显示敲除小鼠和野生型小鼠中的由细胞凋亡引起的细胞死亡通过重组adamts13而减少的照片和图。
[图39]图39是大鼠中的20%部分肝移植模型的术中照片。
[图40]图40是显示对20%部分肝移植模型给予重组adamts13(w688x)后的adamts13活性的图。
[图41]图41是显示20%部分肝移植后的ldh释放(a)和血小板减少症(b)的图。在adamts13给予组中两者均有所改善。
[图42]图42是显示20%部分肝移植后的cd42b荧光免疫染色的照片和图(肝组织中的血小板被荧光浓染成红色)。通过对20%部分肝移植模型给予重组adamts13，移植肝内的血小板凝集锐减。
[图43]图43是显示20%部分肝移植后的转氨酶释放的图。通过给予重组adamts13，肝功能障碍被明显抑制。
[图44]图44是显示通过对20%部分肝移植模型给予重组adamts13，即使在病理学上也可维持移植肝的健康性的照片和图。
[图45]图45是显示引起血小板凝集的vwf的移植肝免疫组织染色的照片和图。结果显示：在移植后的肝组织中，(本来未表达的)vwf在窦中过剩表达，另外，通过对20%部分肝移植模型给予重组adamts13，作为血小板凝集的核的vwf的表达锐减。
[图46]图46是显示通过对20%部分肝移植模型给予重组adamts13，细胞因子(il-1β、il-6、tnfα)或血管收缩物质(内皮素-1)锐减的照片和图。
具体实施方式
adamts13在急性/慢性肝功能障碍中的作用～作为各种肝病中的肝非实质细胞功能标志物、以及基因重组adamts13的治疗应用的可能性～
如上所述，本发明人着眼于迄今为止没有顾及到的肝非实质细胞，以评价其功能为特征。由于adamts13是在作为肝非实质细胞的肝星细胞中产生/分泌，所以当肝功能障碍强时adamts13的血中活性值锐减，其结果，无法剪切作为血小板血栓核的vwf-多聚体，而引起血栓性微小血管障碍(thromboticmicroangiopathy；tma)。
而且可知：通过移植肝的冷保存，肝非实质细胞功能也锐减。本发明人在移植肝的冷保存6、24小时的2组间在肝脏逸脱酶值上没有确认到显著差异(即肝细胞障碍指标没有差别)，发现肝组织中的adamts13活性非常敏锐地与移植肝的冷保存时间逆相关。由此暗示：adamts13能够成为显示肝窦壁构成细胞的完整性的指标。
本发明人还发现：大肠癌化学疗法后的肝功能障碍的基本状态为肝非实质细胞障碍。即，可知大肠癌化学疗法后的肝功能障碍(所谓的“蓝色肝”)的基本状态为窦壁细胞破坏所引起的淤血肝。在作为其动物模型的sos(窦阻塞综合征，sinusoidalobstructivesyndrome)模型中，肝组织中和血中的adamts13活性值也是非常敏锐地显示窦壁构成细胞的完整性的指标。需要说明的是，在上述各组中在ast/alt上没有确认到差异。
而且，本发明人发现：血中adamts13活性与肝功能不全的程度逆相关(临床数据)。由此暗示：即使在慢性肝病中adamts13也能够成为肝非实质细胞/窦功能的指标。
而且，本发明人在研究生物体肝移植后早期的adamts13活性时发现：肝移植后早期在所有病例中其活性均锐减，在儿童和成人中比较肝移植后adamts13活性时，与由成人向成人(体重比：0.6～1.5%的移植肝)移植时相比，由成人向儿童移植(体重比:1～5%的移植肝)时adamts13活性的恢复迅速；即使在成人例的研究中，也发现了在相对过小的移植中adamts13活性的恢复进一步延迟。由此暗示：adamts13能够作为肝移植后的肝非实质细胞/窦功能的指标。另外，在肝移植后早期，由于vwf活性骤增与adamts13活性锐减并存，所以存在着vwf/adamts13比失衡的状态，在重症肝功能障碍中潜在地处于pre-tma状态。肝移植后程度有所不同，几乎所有病例都陷入tma病态。在移植肝内的血小板血栓的形成/溶血期间的血小板减少的同时，因微小循环伤害而在脏器移植后引起脏器功能障碍(delayedgraftfunction；dgf)。在肝储备功能不足的部分肝移植中，这是致死性的病态。
由以上结果可知：以肝硬化或肝移植周手术期为代表，在sos或移植肝冷保存等所有急性/慢性病态下确认到adamts13活性降低，这些均与肝窦壁细胞功能有关。在vwf的活性亢进并存这样的病态、例如以肝移植周手术期或暴发性肝炎为代表的急性肝功能不全等中，由于vwf/adamts13的失衡，因血管内血小板血栓的形成而发生tma，这是致命的。而且还暗示：adamts13不仅作为迄今为止未作评价的“肝非实质细胞功能”的标志物有效，还非常有望作为重症肝病的治疗药。
adamts13在肝缺血/再灌流障碍中的作用～使用敲除小鼠、野生型的研究和基因重组adamts13的保护效果～
本发明人使用adamts13敲除小鼠和野生型小鼠，在肝缺血/再灌流障碍模型中研究在adamts13敲除小鼠中缺血/再灌流障碍是否加重和通过给予重组adamts13其加重是否恢复时，发现了：在adamts13敲除小鼠中肝缺血/再灌流障碍显著加重，另外，通过给予重组adamts13，上述障碍的加重完全被抑制。由此暗示：adamts13对肝缺血/再灌流障碍具有显著的保护效果。另外，adamts13还抑制iri后的炎症性细胞因子表达。
接下来，本发明人研究了重组adamts13能否在野生型小鼠中、而不是在adamts13缺失小鼠中发挥保护效果。其结果，在野生型(＝正常人)中，通过肝缺血/再灌流，vwf活性骤增和adamts13活性锐减也并存，vwf/adamts13的失衡显著，另外，通过给予adamts13，肝缺血/再灌流障碍明显减轻，由此暗示：在无基因突变的正常人的各种肝病中，adamts13也可用作治疗药。
adamts13在肝移植中的作用～使用大鼠20%部分肝移植模型的研究和基因重组adamts13的保护效果～
如上所述，通过肝移植中不可避免的冷保存，由肝星细胞产生的adamts13活性锐减、以及移植肝越小术后早期的活性值越降低，因此在肝移植后程度有所不同，在所有例子中均存在vwf/adamts13失衡，在早期死亡例中高度失衡。因此，使用大鼠部分肝移植模型，研究了在成人生物体部分肝移植后给予重组adamts13时的保护效果。在研究20%部分肝移植后的存活率时，第4天的存活率为100%，样本采样性优异，同时7天存活率为60%，还可以评价作为主要终点的治疗效果对存活的影响。其结果可知，通过给予重组adamts13，转氨酶释放得到抑制，20%部分肝移植后的肝细胞障碍明显减轻。另外可知：通过给予重组adamts13，ldh释放得到抑制，血栓性微小血管障碍(tma病态)明显减轻。即使在病理学上也能够维持移植肝的健康性。由此暗示：即使在模拟(成人)生物体肝移植的大鼠20%部分肝移植模型中，重组adamts13也具有移植肝的保护效果，有望成为新的治疗药。
adamts13在急性肝功能不全/暴发性肝炎中的保护效果～在使用硫代乙酰胺|(taa)的大鼠急性肝功能不全模型中的研究
目前，急性肝功能不全/暴发性肝炎的死亡率依然较高，其存活率通过保守(内科)治疗为40%，即使通过肝移植也停留在80%。本发明人发现：在使用硫代乙酰胺|(taa)的大鼠急性肝功能不全模型中，给予重组adamts13时，存活率急剧提高。
adamts13和修饰体
本发明中使用的adamts13是指在残基tyr1605和met1606之间剪切vwf的adamts(具有血小板反应蛋白1型基序的解联蛋白和金属蛋白酶)家族的金属蛋白酶。在与本发明的关联中，adamts13包含任意的adamts13、例如来自哺乳动物、例如灵长类、人(np_620594)、猴、兔、猪、牛(xp_610784)、啮齿类、小鼠(np_001001322)、大鼠(xp_342396)、仓鼠、沙鼠、狗、猫、青蛙(np_001083331)、鸡(xp_415435)等的adamts13及其生物学活性的衍生物。还包括具有活性的突变体和变体adamts13蛋白，同样也包含adamts13蛋白的功能性片段和融合蛋白。而且，本发明的adamts13蛋白还可以包含容易进行纯化、检测或两者均容易进行的标记物。本说明书中记载的adamts13蛋白可以通过治疗部分或者适合体外或体内成像的部分进一步进行修饰。
本发明中使用的“生物学活性的衍生物”用语是指具有与adamts1实质上相同的生物学功能的任意多肽。生物学活性的衍生物的多肽序列可以包含其不存在、存在和/或取代分别对多肽的生物学活性丝毫没有实质性的负面影响的1个以上的氨基酸的缺失、添加和/或取代。上述多肽的生物学活性例如可以通过内皮中的血小板粘附的减少或者延迟、血小板凝集的减少或者延迟、带状血小板(plateletstrings)形成的减少或者延迟、血栓形成的减少或者延迟、血栓生长的减少或者延迟、血管闭塞的减少或者延迟、vwf的蛋白分解性剪切、血栓的崩解、或者通过肽底物、例如frets-vwf73肽(kokame等人、brjhaematol.2005apr;129(1):93-100)或者其变体的剪切来测定。
本发明中使用的adamts13可以使用来自血液的adamts13(以下有时还称作“nadamts13”)和通过基因重组技术获得的重组adamts13(以下有时还称作“radamts13”)的任一种。另外，只要是具有vwf剪切酶活性的adamts13即可，可以是在adamts13的一部分氨基酸中导入了突变的修饰体或者具有该剪切活性的最小单位(以下有时还将如此修饰的adamts13称作madamts13)。因此，在本发明中仅称作adamts13而进行使用时，包括nadamts13、radamts13和madamts13。
作为人adamts13，可以无限制地列举：包含genbank检索号np_620594的氨基酸序列的多肽或其加工过的多肽、例如除去了信号肽(氨基酸1～29)和/或前肽(氨基酸30～74)的多肽。人adamts13的多个天然变体在该技术领域是公知的，并且包含在本发明的制剂中，其一部分多肽包含选自r7w、v88m、h96d、r102c、r193w、t196i、h234q、a250v、r268p、w390c、r398h、q448e、q456h、p457l、p475s、c508y、r528g、p618a、r625h、i673f、r692c、a732v、e740k、a900v、s903l、c908y、c951g、g982r、c1024g、a1033t、r1095w、r1095w、r1123c、c1213y、t1226i、g1239v和r1336w的突变。而且，adamts13例如包含通过非必需氨基酸中的1个以上的保守突变而发生了突变的天然和重组蛋白。adamts13的酶活性所必需的氨基酸优选没有发生突变。它们包含例如已知或者推测对金属键所必须的残基、例如残基83、173、224、228、234、281和284等、以及在酶的活性部位所见的残基、例如残基225。同样，在与本发明的关联中，adamts13包含同工型、例如缺少全长人蛋白的氨基酸275～305和/或1135～1190的同工型。
这些突变可以是自然发生的突变、或者可以是人为诱突的突变。人为诱变法在该领域为人所熟知，例如有使用重组法的部点特异性诱突法、通过化学方法进行的突变多肽的合成、例如固相合成和液相合成、或氨基酸残基的化学修饰等，各自的细节为本领域技术人员所熟知的。另外，所述突变和/或修饰的位置可以是任一个位置。
在如此操作而获得的adamts13基因中导入点突变时，通常是使用位点定向诱变法。实际上，可以使用应用了本技术的takara公司的位点定向诱变系统(mutan-superexpresskm、mutan-expresskm、mutan-k等)、strantagene公司的quickchangemulti位点定向诱变试剂盒或quickchangexlmulti位点定向诱变试剂盒、和invitrogen公司的genetailor位点定向诱变系统等市售试剂盒，按照附带的操作指南进行。
特别是，在真核细胞表达体系中制造本发明的adamts13时，在多肽中的丝氨酸或苏氨酸残基中添加糖链的可能性大，如此地在真核细胞中表达而添加了糖链的adamts13也包含在本发明中。
将adamts13基因或导入了点突变的madamts13基因插入适当的表达载体中，利用该表达载体转化宿主，从而进行重组adamts13(radamts13蛋白)及其修饰体(madamts13蛋白)的表达。作为宿主，可以使用通常用于外来蛋白的表达的细菌、酵母、动物细胞、植物细胞和昆虫细胞等，只要实质上保持与adamts13相同的生物学功能即可，均可使用。由radamts13蛋白或madamts13蛋白产生细胞纯化这些蛋白时，使用蛋白化学中常用的纯化法。另外，上述修饰体还可以通过化学方法来进行。
同样，adamts13例如可以通过翻译后修饰(例如选自人残基142、146、552、579、614、667、707、828、1235、1354的1个以上的氨基酸中的糖基化、或者天然或人工修饰位点)、或者通过糖基化、水溶性聚合物的修饰(例如peg化、唾液酸化、hes化等)、非限定性地包含标签化等的离体的化学或酶的修饰来进一步修饰。
作为氨基酸的修饰例，有乙酰基化、酰基化、酰胺化、糖链添加、核苷酸或核苷酸衍生物的添加、脂质或脂质衍生物的添加、环化、二硫键形成、脱甲基化、交联形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、羟基化、卤化、甲基化、侧链的氧化、蛋白水解酶的处理、磷酸化、硫酸化、消旋化等，在该领域为人所熟知。
本发明中，作为adamts13修饰体，特别优选的是包含作为adamts13的活性表达最小单位的从金属蛋白酶结构域至间隔结构域的分子、尤其是adamts13的1427个氨基酸残基中缺失了第689位氨基酸～c末端侧的c末端缺失修饰体w688x(参照国际公开wo2004/029242小册子;soejima,k.等人:adamts-13cysteine-rich/spacerdomainsarefunctionallyessentialforvonwillebrandfactorcleavage.blood,102:第3232-3237页,2003;以下有时还称作“adamts13w688x蛋白”)。编码adamts13的活性表达最小单位的基因w688x(以下有时还称作“adamts13w688x基因”)例如可以根据soejima等人,blood,102:第3232-3237页,2003或国际公开wo2004/029242小册子中报道的序列设计pcr用引物，以来自产生adamts13的人脏器或细胞的cdna为模板进行pcr而获取。更具体而言，如下调制。首先，由人肝脏细胞提取总rna，从中纯化mrna。将所得的mrna转换成cdna后，使用根据各自的基因序列设计的pcr引物进行pcr反应，将所得的pcr产物插入质粒载体中，再导入大肠杆菌中。从大肠杆菌集落中选择具有编码目标蛋白的cdna的克隆。在上述总rna的提取中，分别使用市售的trizol试剂(gibcobrl公司)、isogen(nippongene公司)等试剂，在mrna的纯化中使用mrna纯化试剂盒(amershambiosciences公司)等市售试剂盒，在向cdna转化时使用cdna合成和质粒克隆用superscript质粒系统(gibcobrl公司)等市售的cdna文库制作试剂盒。实际上在获取adamts13w688x基因时，使用市售的cdna文库、例如humanlivermarathon-readycdna(bcbioscience)。pcr用引物若依赖于dna合成受托机构(例如qiagen公司)等则可以容易地获取。此时，优选在5’侧添加kozak序列(kozakm,j.mol.biol.,196,947(1987))和适当的限制酶剪切部位的序列。pcr反应可以使用市售的advantagehf-2pcr试剂盒(bcbioscience)，按照附带的操作指南来进行。通过pcr所得的dna片段的核苷酸序列在使用ta克隆试剂盒(invitrogen公司)等进行克隆后，通过dna测序仪、例如ceq2000xldna测定系统(beckman公司)来确定。
由本发明的adamts13或修饰体产生细胞纯化该蛋白时，通常采用蛋白质化学中使用的纯化方法、例如将离心分离、盐析、超滤、等电点沉淀、电泳、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水层析、羟基磷灰石层析、cs树脂层析等方法组合的方法。所得蛋白的量使用bca蛋白测定试剂试剂盒(piercebiotechnology,inc)、蛋白测定试剂盒(bio-rad,inc)等蛋白测定试剂来测定。
adamts13蛋白的检测通过sds-page、凝胶过滤等基于分子大小的方法或elisa法、蛋白质印迹法、斑点印迹法等基于抗原抗体反应的方法来进行。均为检测外来蛋白时的普通方法，只要根据目的适当选择即可。另外，所得的adamts13蛋白量可以采用bca蛋白测定试剂试剂盒(piercebiotechnology公司)、蛋白测定试剂盒(bio-rad公司)等蛋白测定试剂来进行测定。
adamts13的酶活性例如可以通过采用sds琼脂糖电泳法的方法(m.furlan等人,blood,us,1997,第89卷,第3097-3103页)、使用作为底物的vwf的a2结构域的重组抗原的elisa法(whitelockjl等人,journalofthrombosisandhemostheres,uk,2004,第2卷,485-491]、或者使用在作为底物的vwf的a2结构域中的相当于asp1596-arg1668的73个残基的合成肽中导入了荧光基[2-(n-甲基氨基)苯甲酰基(nma)]和消光基(2,4-二硝基苯基(dnp))的消光性荧光底物frets-vwf73的方法(kokamek等人,britishjournalofhematology,uk,2005,第129卷,93-100)来测定。另外，还可以通过日本特愿2005-148793号说明书中记载的方法来测定，具体而言，该分析方法包括以下步骤：(1)使有可能含有adamts13的受试样品和在不溶性载体上结合有vwf或其片段的固定化底物在溶液中接触；(2)分离上述溶液和不溶性载体；以及(3)分析残留在不溶性载体上的vwf或其片段和/或从不溶性载体中游离的溶液中的vwf片段。
关于adamts13蛋白的活性，通过使用抗adamts13的抗体、或在添加标记物的情况下使用抗该标记物的抗体的elisa等方法评价adamts13蛋白与来自人血浆的vwf或vwf的部分合成肽的结合性或分解活性。elisa的构建通过常规方法来进行。elisa中使用的来自人血浆的vwf和抗adamts13的抗体分别通过soejima,k.等人(j.biochem.,130:第475-480页,2001)和soejima,k.等人(j.biochem.,139:第147-154页,2006)的方法来获取。vwf的部分合成肽只要使用市售的进行了荧光标记的frets-vwf73(肽研究所)即可。
adamts13组合物和制剂
本发明的adamts13或修饰体可以配方成制剂学的调合剂，以用于治疗、诊断或其他用途。例如，对用于静脉内给予的调合剂，通常是将组合物溶解于包含生理学上能够适合的物质、例如氯化钠、甘氨酸等、并且具有能够适合生理学条件的缓冲的ph的水溶液中。另外，从确保长期稳定性的角度考虑，还可以考虑将最终的剂型制成冷冻干燥制剂的形式。需要说明的是，静脉内给予的组合物的指南根据政府的规则、例如“生物学制剂标准”来确立。作为含有本发明的adamts13或修饰体作为有效成分的药品组合物的具体用途，可以列举：对肝功能障碍、肝缺血/再灌流障碍、肝移植后的肝功能和/或急性肝功能不全/暴发性肝炎等adamts13下降的患者或者作为该酶底物的vwf的血中浓度上升的患者或者因炎症等设想ulvwf出现的患者的补充疗法。
本发明的药物组合物除了含有上述的adamts13或修饰体以外，还可以含有通常药品中使用的药理学上可接受的添加剂(例如载体、赋形剂、稀释剂等)、稳定化剂或制药上所需的成分。作为稳定化剂，可例示：葡萄糖等单糖类、蔗糖、麦芽糖等二糖类、甘露糖醇、山梨糖醇等糖醇、氯化钠等中性盐、甘氨酸等氨基酸、聚乙二醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(pluronic)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(tween)等非离子系表面活性剂、人白蛋白等。而且，本发明的药物组合物还可以包含其他药剂、辅助剂、组织透过促进剂、增溶剂等。这样的物质是无毒、不干涉活性成分的效能的物质。载体或其他物质的严格性质取决于给予途径、例如口、静脉、皮肤或者皮下、鼻、肌肉内、腹腔内途径，可以根据给予途径选择适当的性质。用于给药的组合物和制剂的调制方法为本领域技术人员所熟知。
包含本发明的adamts13或修饰体的药物组合物可以制成制剂，以通过已知的方法、例如静脉内给予(例如作为bolus、或者长时间的持续注入)、肌肉内、腹腔内、脑脊髄内、皮下、关节内、滑液嚢内、髄腔内、经口、局部或吸入途径的方法进行给予。在特定的实施方式中，本发明的adamts13制剂可以进行全身或局部给予。作为全身给予，可以非限定地列举：经口、真皮下、腹腔内、皮下、经鼻、舌下或直肠内途径的给予。作为局部给予和全身给予，可以非限定地列举：局部、皮下、肌肉内和腹腔内途径的给予。
用于口服给予的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形状。片剂可以包含明胶或佐剂等固态载体。液体的药学组合物通常可以是液体的载体、例如水、石油、动物性油、植物性油、矿物性油或合成油。包括生理盐水、葡萄糖或者其他的糖类溶液或二醇、例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
进行静脉、皮肤或者皮下注射或者向疼痛部位注射时，活性成分将制成不含发热性因子、具有适当的ph、等渗性和稳定性、在肠道外能够接受的水溶液的形状。本领域技术人员可以使用例如等渗性的介质、例如氯化钠溶液、林格溶液、乳酸加林格溶液等调制适当的溶液。根据需要可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他的添加剂。
本发明的药物组合物可以通过静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射等以有效量进行给予，可以1次或分为数次进行给予。其给予量根据症状、年龄、体重等而不同，每次为100～700单位/kg体重，优选300～700单位/kg，进一步优选400～700单位/kg。为了维持其血中活性值，进一步优选多次反复给予或者持续给予。
作为生物标志物的adamts13
根据本发明，提供adamts13作为生物标志物的应用，用于监测肝功能障碍的发病、肝缺血/再灌流障碍或肝移植后的肝功能。而且，根据本发明，提供肝功能障碍的检查方法、肝缺血/再灌流障碍的检查方法或肝移植后的肝功能的检查方法，所述检查方法包括测定或监测由哺乳动物所得的肝非实质细胞样品中的adamts13活性。
这样的检查方法使用来自患者的生物学样品来进行。这些样品可以不进行前处理而直接使用，也可以在进行测定前例如通过离心分离或过滤进行除去有可能产生干扰的样品中的物质等处理。作为受试样品，例如优选血浆或血清形态的血液，除此以外，例如还可以使用细胞组织液、淋巴液、胸腺水、腹水、羊水、胃液、尿、胰液、骨髄液或唾液等各种体液。另外，上述血浆优选为枸橼酸血浆或肝素血浆。
本发明的检查方法是测定患者的生物学样品中的adamts13活性，当低于规定的活性时，判定为肝功能障碍、肝缺血/再灌流障碍或肝移植后的肝功能障碍。这种情况下，根据adamts13的活性，通常如下评价。～10%：有可能是严重的血液病/肝病，需要火速进行精密检查；11～30%：有可能是血液病/肝病，需要精密检查；31～80%：需要精査；81%以上：正常。另外，当为肝功能障碍时如下进行评价。～10%：严重的肝功能不全；11～30%：严重的肝功能障碍；31～50%：需要精査；51～80%：希望精査；81%以上：正常。而且，肝移植后的情形如下进行评价。～10%：移植后肝功能不全，需要治疗干预；11～30%：移植后肝功能障碍、要治疗干预或者严格的经过观察；31～50%：严格的经过观察；51～80%(基于术后天数)：经过观察；81%以上(基于术后天数)：经过良好。
在本发明方法中，作为分析adamts13活性的方法，只要能够定量或半定量地确定adamts13活性即可，没有特别限定，例如可以列举：使用抗adamts13抗体或其片段的免疫学方法(例如酶免疫测定法、胶乳凝集免疫测定法、化学发光免疫测定法、荧光抗体法、放射免疫测定法、免疫沉淀法、免疫组织染色、蛋白质印迹等)、生化学方法(例如酶学测定法)、或者测定mrna量的分子生物学方法等。当采用免疫学方法作为adamts13的分析方法时，抗adamts13抗体可以按照公知的方法、例如国际公开第2004/029242号小册子中记载的方法来调制，上述免疫学测定还可以按照例如国际公开第2004/029242号小册子中记载的方法来实施。
作为测定adamts13活性的方法，从灵敏度和简便性方面考虑，优选免疫学方法。作为免疫学方法，例如有标记adamts13的竞争法、识别抗体的夹层法、观察编码抗体的珠粒凝集的胶乳珠粒法、或者使用与金胶体等着色颗粒结合的抗体的方法等各种方法，当为使用抗adamts13的抗体的方法时，也包括在本发明的优选方式中。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。另外，还可以使用抗体片段、例如fab、fab’、f(ab’)2或fv。
在本发明方法中，除样品中的adamts13活性以外，还测定vwf浓度，还可以根据两者的比率监测肝功能障碍、肝缺血/再灌流障碍或肝移植后的肝功能障碍。在血栓性微小血管障碍(tma)中，由于会产生vwf/adamts13比的失衡(vwf活性骤增、adamts13活性锐减)，所以通过测定vwf和adamts13两者，研究测定值之比，可以监测上述疾病。这里，优选事先确定各种判定用阈值、例如adamts13浓度和adamts13活性的判定用阈值、以及adamts13浓度或其活性与vwf之比的判定用阈值。
作为vwf浓度的测定方法，例如可以列举基于人血小板和瑞斯托菌素辅因子的凝集活性的活性测定方法(allainjp等人,jlabclinmed.uas,1975,第85卷,第318-328页)、或者使用抗vwf抗体的免疫测定法(brownje等人,thrombres.usa,1986,第43卷,第303-311页)等，从灵敏度和简便性方面考虑，优选免疫学方法。
试剂盒
本发明还提供肝功能障碍发病监测用试剂盒、肝缺血/再灌流障碍监测用试剂盒、和肝移植后的肝功能监测用试剂盒，其中包括测定由哺乳动物所得的样品中的adamts13活性的手段。
在本发明的试剂盒中，测定样品中的adamts13活性的手段例如可以是抗adamts13抗体或其片段。优选包含不同的2种以上的抗adamts13抗体。上述抗adamts13抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体的任一种。另外，当包含不同的2种以上的抗adamts13抗体时，可以将其中的任一方(第2抗体)作为标记抗体，或者在试剂盒中进一步追加在抗第2抗体的抗体上结合有标记的标记抗体，以代替标记化。
本发明还提供测定由哺乳动物采取的肝非实质细胞中的adamts13活性、筛选adamts13活性降低的方法。这里，哺乳动物的肝非实质细胞中的adamts13活性降低是哺乳动物罹患选自肝功能障碍、肝缺血/再灌流障碍和肝移植后的肝功能障碍的疾病指标。
以下，通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
实施例1
通过移植肝的冷保存，肝非实质细胞功能锐减
由大鼠(wistar大鼠、雄性、250-270g)摘取全肝，之后测定在htk液中单纯冷保存6小时、24小时后肝组织中的adamts13活性值。作为对象，以相对于4例未保存的大鼠正常肝的平均活性值100%的相对比进行作图(图1)。adamts13活性通过fret法(frets-vwf73:肽研究所)进行测定。
其结果，在冷保存6、24小时的2组间肝脏逸脱酶值没有确认到显著差别(肝细胞障碍指标没有差别)，肝组织中adamts13活性非常敏锐地与移植肝的冷保存时间逆相关(图1)。
实施例2
大肠癌化学疗法后的肝功能障碍的基本状态为肝非实质细胞障碍
作为大肠癌化学疗法的关键性药物之一的奥沙利铂会高频率地引起肝功能障碍。其病态的本质是由奥沙利铂引起窦壁细胞破坏而产生的窦阻塞综合征(sinusoidalobstructivesyndrome:sos)。作为该sos的动物模型，使用最通用的单猪屎豆碱给予模型，在治疗药给予/未给予的情况下比较研究给予24、48小时后的adamts13活性值(各组n=5)。与图1的方法一样，在采取肝组织之后，利用fret法进行定量。
nc：正常肝；
a24：单猪屎豆碱给予24小时后；
a48：单猪屎豆碱给予48小时后；
t24：单猪屎豆碱+治疗药给予24小时后；
t48：单猪屎豆碱+治疗药给予48小时后。
其结果，在治疗药给予前锐减的adamts13活性在治疗药给予后显著改善(图2)。由此可知：大肠癌化学疗法后的肝功能障碍的基本状态是由窦壁细胞破坏引起的淤血肝，肝组织中、血中adamts13活性值是非常敏锐地显示窦壁构成细胞的完整性的指标。需要说明的是，上述各组中，在作为肝细胞障碍的指标的ast/alt中没有确认到显著差异。
实施例3
血中adamts13活性与肝功能不全的程度逆相关
2012年11月～2013年3月在京都大学医学部附属医院肝胆胰/移植外科施行的21例成人生物体部分肝移植的捐献者、接受者中，监测术前adamts13活性值、与全世界最通用为肝功能不全的指标的meld(末期肝病用模型)评分和child-pugh评分。其结果，术前adamts13活性值与meld评分和child-pugh评分显示出非常完美的逆相关(图3)。即，认为血中adamts13活性值作为肝功能不全的指标是有效的。
实施例4
生物体肝移植后早期的adamts13活性
2010年10月～2012年3月在京都大学医学部附属医院肝胆胰/移植外科施行的95例生物体部分肝移植中，在接受者的术前～术后2周的每天监测血中adamts13活性值。可知：肝移植后早期在所有病例中血中adamts13活性值均降低。
其结果可知：肝移植后早期在所有病例中adamts13活性均锐减(图4)。以上结果查证：通过定量来自作为非实质细胞之一的星细胞的产生蛋白，证明了移植肝的冷保存对其非实质细胞、窦壁构成细胞的影响。
实施例5
肝移植后adamts13活性(儿童vs成人)
将2010年10月～2012年3月在京都大学医学部附属医院肝胆胰/移植外科施行的95例生物体部分肝移植分为儿童例(n=29)和成人例(n=66)，比较、研究其肝移植后adamts13活性值。
肝脏是相当于体重的约2%(标准肝容积)的最大的实质脏器。在从成人到儿童的移植中往往是移植体重比1～5%的移植肝，而从成人到成人的移植中往往是移植体重比0.6～1.5%的移植肝。在儿童例中，相对的移植肝容量有时较成人例大，其恢复明显好(图5)。
实施例6
在成人例的研究中，在相对过小的移植中adamts13活性的恢复进一步延迟
将现有的66例成人例分为移植肝重量/接受者体重比(grwr)为1.0%以上、不足1.0%的2组，比较、研究其肝移植后adamts13活性的变化。与＞1.0%以上的39例相比，在grwr＜不足1.0%的27例中其恢复趋于延迟。
由以上的结果可知：肝移植后的接受者血中adamts13活性值与grwr、移植肝储备功能密切相关。以上的结果暗示：adamts13能够作为肝移植后的肝非实质细胞/窦功能的指标(图6)。
实施例7
在肝移植后早期，vwf活性骤增和adamts13活性锐减并存
2013年7月～2015年3月在京都大学医学部附属医院肝胆胰/移植外科施行的20例成人生物体部分肝移植中，测定血中的血管性血友病因子(vwf;作为血小板血栓的核，在生理上担负止血机理的起点，但在血管内皮障碍等中还成为引起血小板过剩凝集的病态的起点)和作为血小板血栓的细切化酶的adamts13这两者的活性值，进行了比较研究(图7)。另外，vwf/adamts13的相对比(均以正常人血浆中的活性值为100%时，其正常比为1)在肝移植后的全部患者中均为10倍以上(图8左)、在早期死亡例中为30倍以上(图8右)，判明血小板血栓形成倾向高。
其结果可知：在肝移植后早期，vwf活性骤增和adamts13活性锐减并存(图7)。另外，还显示：在肝移植后，几乎所有例中都存在vwf/adamts13失衡(图8)。由此暗示：在重症肝功能障碍时潜在地处于pre-tma状态。即，结果暗示：在移植肝内的血小板血栓形成/溶血期间的血小板减少的同时，由于微小循环伤害，脏器移植后有可能引起脏器功能障碍(delayedgraftfunction：dgf)。在肝储备功能不足的部分肝移植中，认为这是致死的病态。
实施例8
adamts13在肝缺血/再灌流障碍中的作用～使用敲除小鼠、野生型的研究和基因重组adamts13的保护效果～
从国立心血管病研究中心研究所(大阪)购入雄adamts13ko小鼠26(129/+ter/svjcl-tghncvc；8-12周、25-30g)，对应的野生型小鼠从日本clea(大阪)获取。使用部分温肝iri的小鼠模型。将全部小鼠用异氟烷进行全身麻醉，阻断流向左叶/中叶的血流。缺血90分钟后，对缺血的肝叶进行再灌流。为了研究adamts13的影响，在缺血侵袭(ischemiainsult)之前和再灌流前静注重组adamts13(由化血研提供；adamts13w688x)(分别为20u/只)，然后在再灌流的2、6和24小时后宰杀。对照用pbs进行处理。假手术的小鼠也同样处置，但在血管未闭塞的情况下进行。小鼠分为以下3组(图9)。
1组：野生型小鼠+pbs；
2组：敲除小鼠+pbs；
3组：敲除+重组adamts13。
在敲除小鼠和野生型小鼠中，除adamts13活性以外，外周血和血清转氨酶均未确认到差异。
[表1]
肝酶和血小板数：
通过使用了自动临床测定仪(jca-bm9030,jeolltd.,tokyo,japan)的标准分光光度法测定血清天冬氨酸转氨酶(sast)、丙氨酸转氨酶(salt)和乳酸脱氢酶(ldh)水平。血小板数通过bectondickinsonqbciiplus4452自动血细胞计数仪来定量。
组织学：
将肝脏石蜡包埋切片(厚度为4-μm)用苏木精和曙红(eosin，伊红)进行染色。按照在0-429等级的suzuki标准(suzuki’scriteria铃木的标准)将肝脏iri的严重度(坏死、窦壁充血(sinusoidalcongestion)和空胞化(vacuolization))进行盲目评级(blindgrade)。
肝脏微小循环的定量分析：
使用激光多普勒血流仪(laserdopplerflowmetry;o2c:oxygentosee;leamedizintechnikgmbh,giessen,germany)评价再灌流后的肝脏的微小循环。计算血流相对于缺血前的值的相对变化。
血浆adamts13的测定：
采用fretsvwf73法。简单说明如下：将血浆样品用反应缓冲液(5mmbis-tris、25mmcacl2和0.05%的tween-20、ph6.0)稀释，然后加入4μm的frets-vwf73(peptideinstitute,inc.,osaka,japan)底物溶液和10μl的蛋白酶抑制剂混合物(p8340,sigma-aldrichinc.,stlouis,usa)。培育后，使用幼稚野生型小鼠血浆作为标准，利用在355nm激发和在460nm释放的荧光分光光度法(fluoroskanascentfl,thermolabsystems,helsinki,finland)进行测定。
cd42b的免疫荧光：
在肝脏切片的脱石蜡后，利用枸橼酸缓冲液(10mm、ph6.0)回收抗原。用proteinblockserum-free(x0909,dako,tokyo,japan)封闭30分钟后，将切片和一次兔抗小鼠cd42b(bs-2347r,boston,massachusetts)一起按照1:200的稀释下于4℃下培育。之后，使切片与alexafluor@594结合山羊抗兔igg(h+l)二次抗体反应。利用分析软件(imagej,nih,usa)定量cd42b阳性区。代替一次抗体通过与正常兔igg(sc-2027,santacruz,ca)一起培育，调制阴性对照载玻片。
sybrgreen实时逆转录物pcr(sybrgreenreal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction)：
使用rneasy试剂盒(qiagen,venlo,netherlands)由肝组织提取总rna，利用omniscriptrt试剂盒(qiagen)调制互补的dna。使用具备fastsybrrgreenmastermix的steponeplustm实时pcr系统(appliedbiosystemsr,tokyo,japan)进行定量的pcr。扩增条件如下：进行45个循环的95℃(20秒)、95℃(3秒)、然后95℃(15秒)、60℃(30秒)。靶基因表达根据相对于管家基因gapdh的比率来计算。
统计分析：
数据均用平均±sem表示。关于实验组间的差异，经过双向方差分析后，通过对不对数据进行bonferroni的事后調査(bonferroni’s后检验)或者student的t检验来进行分析。计算均使用graphpadprism5(graphpadsoftwareinc.,lajolla,ca,usa)来进行。根据<0.05的p值，认为所有差异在统计学上均显著。
结果：
(1)adamts13表达通过iri在肝脏中向下调节
在暴露于温缺血达90分钟的野生型小鼠的肝脏中，进行血小板adamts13活性和adamts13的mrna的定量。血浆中的adamts13浓度与生理状态相比于再灌流的初期阶段下降至约36%，该低水平维持至再灌流的24小时后(图10和图29)。通过rt-pcr定量的adamts13的基因表达从缺血的时间点开始下降，然后在iri期间得到抑制(图10和图29)。上述结果显示：来自hscs的adamts13的产生受到缺血的影响；以及hscs因肝脏iri而受到阻碍。
(2)adamts13缺损使肝功能障碍和血小板减少症恶化
利用90分钟的部分肝温缺血和之后的再灌流的模型分析肝功能。与野生型相比，由ir产生的障碍在adamts13-/-小鼠中极度恶化。如图10、图11和图29所示，再灌流后，在24小时的sast、在6小时的salt和在6、24小时的ldh水平明显降低。在adamts13-/-小鼠中再灌流后外周血的血小板数也下降，这与肝功能障碍一致(图10和图29)。
(3)补充adamts13使由ir诱发的组织障碍和血小板数得到改善
为了查明肝ir期间的adamts13的功能，对小鼠iri模型给予重组adamts13。在缺血侵袭前和即将再灌流前对敲除小鼠静注重组adamts13。如图11、图12和图32所示，与未进行重组adamts13处理的敲除小鼠相比，在经重组adamts13处理的敲除小鼠中6和24小时后的sast、salt和ldh水平骤增。因此，adamts13处置在敲除小鼠中改善了暴发性肝细胞障碍。在图13和图33的组织学所见中，进行了pbs处理的敲除小鼠显示出严重的肝叶浮肿、淤血、膨胀(ballooning)和坏死。对照性地，通过补充重组adamts13，敲除小鼠的已加重的肝功能障碍于再灌流的6小时后和24小时后均明显改善。与未进行重组adamts13处理的小鼠相比，外周血的血小板数在6小时后和24小时后通过给予重组adamts13也均显著改善，这与肝酶一致。
(4)窦壁(sinusoidalspace)内的血小板凝集
肝脏的cd42b染色明确了：与野生型小鼠相比，进行了媒介物处理的敲除小鼠在窦壁内显现大量的血小板聚集。如图15、图16、图30和图31所示，通过对敲除小鼠给予重组adamts13，cd42b阳性区明显降低。显示了：在外周血的血小板数下降的同时，cd42b阳性区向上调节(upregulation，增量调节)，在iri期间肝脏内发生了血小板凝集。
(5)adamts13按照依赖于肝用量的方法确定肝微小循环的控制
再灌流的24小时后，未进行重组adamts13处理的敲除小鼠的肝脏的肝血流与野生型小鼠相比下降至约38%。对照性地，重组adamts13的给予在敲除小鼠中在2小时后明显改善了肝脏内微小循环。这暗示与adamts13的血浆活性相关，adamts13确定由微小循环障碍诱发的iri的严重度。
(6)adamts13的参与抑制炎症性细胞因子和趋化因子程序
在再灌流后6和24小时，研究了adamts13缺损和重组adamts13处置对肝组织中的细胞因子和趋化因子的表达产生的效果。通过定量rt-pcr测定细胞因子(tnf-α、il-1β和il-6)和趋化因子配体(cxcl-2)(图17、图18和图35)。再灌流的6小时后，与野生型小鼠相比，adamts13缺损使il-1β和il-6的表达骤增。对照性地，在敲除小鼠中adamts13处理在6小时后tnf-α、il-1β、il-6和cxcl-2的释放明显降低。这些结果显示：adamts13对肝脏iri具有强效的抗炎作用。
实施例9
adamts13在肝缺血/再灌流障碍中的作用～不是在adamts13缺失小鼠中、而是在野生型小鼠中基因重组adamts13是否也能够发挥保护效果
按照与实施例8相同的顺序，通过对野生型小鼠给予重组adamts13，研究其对肝缺血/再灌流障碍是否具有保护效果(图19)。将小鼠分为以下2组。
1组：野生型小鼠+pbs；
2组：野生型小鼠+重组adamts13。
通过肝缺血/再灌流，vwf活性骤增和adamts13活性锐减并存
在上述2组中，在肝缺血再灌流前(之前)、缺血结束时(即将再灌流前：0小时)、再灌流2小时后(2小时)、6小时后(6小时)、24小时后(24小时)采取肝组织，利用定量rt-pcr法定量vwf和adamts13的基因表达。用与作为管家基因的gapdh的相对比表示。
其结果可知：在肝缺血/再灌流障碍中，vwf活性骤增和adamts13活性锐减并存(图20)。如上所述，即使在野生型(＝正常人)中，vwf/adamts13比的失衡也明显，由此大幅期待adamts13填补的治疗意义。
(1)在肝脏内adamts13表达通过iri而向下调节
在暴露于温缺血达90分钟的野生型小鼠的肝脏中，进行adamts13的mrna的定量。其结果显示：adamts13表达在缺血结束时下降至缺血前值的1/4～1/5，该低水平维持至再灌流的24小时后(图20)。以上结果显示：作为adamts13产生细胞的肝/星细胞通过肝缺血再灌流而发生障碍，全身的adamts13活性值锐减。
(2)adamts13缺损使肝功能障碍和血小板减少症恶化
成为血小板血栓的核的vwf的过剩表达和作为其细切化酶的adamts13的锐减使iri后的外周血血小板数明显降低，通过给予radamts13，该血小板减少明显改善。这使得由肝微小血管障碍引起的ldh的上升明显下降(图21)。作为结果，由于肝微小循环的改善，在radamts13给予组中ast、alt等肝脏逸脱酶值明显低值(图22)。
(3)在组织学所见中，进行了pbs处理的野生型小鼠显示出严重的肝叶浮肿、淤血、膨胀(ballooning)和坏死。对照性地，野生型小鼠的已加重的肝功能障碍通过补充重组adamts13而于再灌流的6小时后和24小时后均明显改善。与未进行重组adamts13处理的小鼠相比，在6小时后和24小时后，通过给予重组adamts13，外周血的血小板数也均显著改善，这与肝酶一致。
(4)窦壁(sinusoidalspace)内的血小板凝集
通过对野生型小鼠给予重组adamts13，cd42b阳性区明显减小。cd42b阳性区显示了在iri期间肝脏内发生了血小板凝集。
(5)adamts13按照依赖于肝用量的方法确定肝微小循环的控制
在野生型小鼠中，重组adamts13的给予在2小时后明显改善了肝脏内微小循环。这与adamts13的血浆活性有关，暗示了adamts13确定由微小循环障碍诱发的iri的严重度。
(6)adamts13的参与抑制炎症性细胞因子和趋化因子程序
在再灌流后6和24小时，研究adamts13缺损和重组adamts13处置对肝组织中的细胞因子和趋化因子的表达产生的效果。通过定量rt-pcr测定细胞因子(tnf-α、il-1β和il-6)和趋化因子配体(cxcl-2)。在野生型小鼠中，adamts13处理在6小时后tnf-α、il-1β、il-6和cxcl-2的释放明显降低。这些结果显示：adamts13对肝脏iri具有强效的抗炎作用。
实施例10
adamts13在肝移植中的作用～使用大鼠20%部分肝移植模型的研究和基因重组adamts13的保护效果～
通过肝移植所不可避免的冷保存，由肝星细胞产生的adamts13活性锐减(图1)，另外，移植肝越小术后早期的活性值越降低(图5和6)，因此肝移植后程度有所不同，在全部例子中均存在vwf/adamts13失衡(图7)，在早期死亡例中其失衡较高(图8)。因此，使用大鼠部分肝移植模型，对成人生物体部分肝移植后的重组adamts13给予所产生的保护效果进行验证。作为模仿成人生物体部分肝移植的动物模型，使用lewis大鼠(雄性、250～300g)，仅使用其右叶+尾状叶作为移植肝，制作了大鼠同所性20%部分肝移植模型。
肝移植后第4天的存活率为100%，样本采样性优异，同时7天存活率为60%，还可以评价作为主要终点的治疗效果对存活的影响(图23)。重组adamts13给予明显减轻了20%部分肝移植后的肝细胞障碍(图24和图43)。另外，重组adamts13给予明显减轻了20%部分肝移植后的血栓性微小血管障碍(tma病态)(图25和图41)。而且，在病理学上也维持了移植肝的健康性(图26和图44)。
产业实用性
本发明涉及adamts13的全长或者部分片段在临床领域的新用途，按照本发明，通过使用adamts13，能够快速且准确地诊断急性/慢性肝功能障碍，可以提供肝功能障碍、肝缺血/再灌流障碍、肝移植后的肝功能障碍和急性肝功能不全/暴发性肝炎的有效治疗药。