用于高分辨率地局部成像样品中的结构的方法，以便检测令人感兴趣的对象对变化的周围环境条件的反应与流程
本发明涉及一种用于高分辨率地成像样品中的借助冷光标记物标记的结构的方法。
本发明涉及高分辨率的扫描冷光显微术(rasterlumineszenzlichtmikroskopie)领域，在该领域中，采取如下措施：这些措施允许，从相应样品发射的冷光以比冷光波长情况下的并且比可能的激发光波长情况下的衍射极限更高的位置分辨率配属于样品中的位置，借助可能的激发光将冷光标记物在空间上受限地激发到发射冷光。冷光标记物通常涉及荧光标记物，该荧光标记物在通过激发光激发之后发射作为冷光的荧光。然后谈及荧光显微术。
背景技术
在根据独立权利要求的前序部分的已知方法和扫描冷光显微镜中，为了提高位置分辨率，使对冷光标记物发射冷光产生影响的光对准样品，该光具有如下强度分布：该强度分布具有与强度最大值相邻的零点。这种光通常涉及冷光阻抑光(lumineszenzlicht)，借助该冷光阻抑光，可以阻抑位于除零点位置之外的那些冷光标记物发射冷光。因此，可以将从样品发射的冷光配属于零点的位置，因为只有布置在那里的冷光标记物才能够发射冷光。
因此在sted荧光显微术中，除了处于零点的区域中的那些荧光标记物之外，借助作为荧光阻抑光的刺激光(stimulationslicht)通过受激发射将之前借助激发光所激发的荧光标记物重新抑制(abregen)，使得只有处于零点的区域内的荧光标记物能够发射随后测量到的荧光。因此，该荧光可以配属于样品中的零点的位置。通过以零点扫描样品来确定样品中的荧光标记物的空间分布。以这种方式，可以对样品中的借助荧光标记物所标记的结构的构造和空间分布进行成像。
在gsd荧光显微术中，借助荧光阻抑光将零点的区域之外的那些荧光标记物转换到电子黑暗状态中，因此，这些荧光标记物无法通过激发光被激发到发射荧光。
在resolft荧光显微术中使用荧光阻抑光，该荧光阻抑光将除了零点的区域中的荧光标记物之外的那些光敏(photochrome)荧光标记物从荧光状态转换到非荧光状态中。在随后借助激发光激发荧光标记物时，相应地，只有荧光阻抑光的强度分布的零点的区域中的荧光标记物由激发光激发到发射荧光。因此，在此也能够将由样品中的荧光标记物发射的荧光配属于荧光阻抑光的强度分布的零点的位置。
在目前所描述的所有高分辨率扫描冷光显微术的方法中，存在如下相当大的风险：相应样品中的冷光标记物暂时地或甚至持续地褪色、即失活，使得该冷光标记物不再发射冷光。这种风险基于以下事实：冷光阻抑光的强度必须被调节得很高，以便防止零点的区域之外的所有冷光标记物发射冷光并且同时严格限制零点的区域(冷光标记物仍能从其发射冷光)的空间尺寸。当冷光标记物接近冷光阻抑光的零点的区域时，也就是说，在冷光标记物首次到达零点的区域中并且因此首次记录到由该荧光标记物发射的冷光之前，该冷光阻抑光就已经以其高强度对样品中的荧光标记物产生影响。这可能导致：在所描述的方法中，无法使用易于褪色的冷光标记物，或至少无法使用冷光阻抑光的非常高的强度，该高强度例如对于位置分辨率的最大化是期望的。
为了克服高分辨率扫描冷光显微术中所描述的暂时褪色以及尤其持续褪色的问题，已经采取了不同方法。de102005027896a1说明，在sted荧光显微术中，将荧光阻抑光以具有相对较大的时间间隔的脉冲或以零点快速扫描相应样品时施加到样品上，使得样品的同一区域仅在优化的时间重复间距的情况下承受荧光阻抑光的高强度。以这种方式，提高了能够从样品获得的荧光的强度，因为显著降低了荧光标记物从被激发的中间状态通过进一步激发到达持续或仅缓慢衰减的黑暗状态中的速率。换句话说，以相对较大的重复间距借助荧光阻抑光的强度分布照射样品的每个单个区域，使在确定时间段内能够从整个样品获得的荧光量最大化。这种方法也降低荧光标记物褪色的倾向性，因为避免了对发生荧光标记物的光化学破坏的激发状态的严重占据。
为了也能借助易于褪色的荧光标记物来执行高分辨率荧光显微术，de102011051086a1提出，使扫描条件如此彼此协调，使得荧光以能够单个探测到的光子的形式从荧光阻抑光的强度分布的零点的区域中发射，所述扫描条件除了借助其扫描相应样品的扫描速度以外还包括：荧光阻抑光的强度分布的光强度特性和样品中的荧光标记物的浓度。样品中的借助荧光标记物标记的结构的图像由如下位置组成：这些位置在以零点对样品进行多次重复扫描期间已经配属于所探测到的光子。以这种方式，在荧光标记物由零点首次到达并且因此被检测到之前，降低了荧光标记物褪色的概率。这基于如下事实：褪色的概率与从各个荧光标记物获得的荧光强度相关联。因为荧光被最小化为单个光子，因此也使褪色的风险最小化。原则上，在由de102011051086a1已知的方法中，在单个荧光标记物之前已经承受过邻接的强度最大值区域的高强度之后，单个荧光标记物才由荧光阻抑光的零点所达到。
为了在高分辨率的扫描冷光显微术中也可以使用对于褪色敏感的物质，由wo2011/131591已知，借助测量前端(messfront)经过如下样品：借助冷光标记物标记的令人感兴趣的结构处于该样品中。在此，光学信号的强度在测量前端的深度(该深度比该光学信号波长情况下的衍射极限小)上如此增大，使得冷光标记物的发射冷光的部分通过将冷光标记物转换到发光状态中而从不存在开始增加，并且该部分通过将冷光标记物转换到非发光状态中而重新降低至不存在。检测来自测量前端区域的冷光，并且将该冷光配属于该测量前端在样品中所配属的位置。在此，例如也可以以超出衍射极限的位置分辨率进行沿着测量前段的荧光配属，例如将所记录的光子配属于唯一的冷光标记物，这例如在已知为gsdim的光显微术方法中进行。
在扫描冷光显微术中，提高成像样品的令人感兴趣的结构时的速度的一种可能性是，借助冷光阻抑光的多个零点并行地扫描样品。在此，将从样品发射的冷光独立地配属于冷光阻抑光的各个零点。由de102006009833b4已知，借助零点光栅来成像冷光阻抑光的强度分布，其方式是：将来自冷光阻抑光的两个彼此正交延伸的线条图案在样品中彼此重叠。在此，防止了线条图案之间的干涉，使得这些线条图案的强度分布相加。将冷光阻抑光的强度分布的与强度最大值邻接的期望零点保留在两个线光栅的线状零点的交叉点处。为了在零点的光栅状布置的区域中完全扫描样品，在至两个线条图案方向上最接近的零点的距离上移位每个零点就足够了。在此，在冷光标记物由零点所达到并且因此被初次检测到之前，样品中的大多数冷光标记物承受冷光阻抑光的高的光强度。因此，必须如此选择冷光标记物，使得这些冷光标记物能够承受高的光强度而不褪色。
lid等人的《extended-resolutionstructuredilluminationimagingofendocyticandcytoskeletaldynamics》(science，2015年8月28日，349(6251))公开一种用于对样品中的借助能够激活的荧光标记物标记的结构进行高分辨率成像的方法，其中，借助荧光激活光和荧光激发光的光强度分布的重合的(zusammenfallend)线状零点或面状零点在不同方向上依次扫描样品，并且在此借助摄像机检测从样品发射的荧光。由所检测的光强度的分析处理可以对样品中的令人感兴趣的结构的图像进行重建，通过限制荧光激活光和荧光激发光的相匹配的零点来提高该图像的位置分辨率，从这些零点没有来自样品的荧光。此外，在这种已知的方法中，荧光激活光的零点和同时作为荧光非激活光作用的荧光激发光的零点也与荧光激活光的光强度最大值和荧光激发光的光强度最大值相邻。在冷光标记物进入到荧光激活光和荧光激发光的重合的零点的区域中之前，借助荧光激活光和荧光激发光在该强度最大值范围内的高强度照射样品中的所有冷光标记物。因此，在这种已知方法中，在荧光标记物对重要测量信号作出贡献之前，荧光标记物褪色的风险也非常高。
由wo2014/108455a1已知一种用于在空间上高分辨率地成像样品的借助冷光标记物标记的结构的方法，其中，例如在sted荧光显微术中那样，借助作为冷光阻抑光的激发光和刺激光来照射样品，以便将样品的如下区域限界在刺激光的零点的区域内：该区域可以配属有从样品发射的和探测到的荧光。为了在此保护冷光标记物免受刺激光的在其与零点相邻的强度最大值区域中的高强度影响，附加地借助激发阻抑光照射样品，该激发阻抑光的强度分布具有与刺激光的零点重合的局部最小值。这种激发阻抑光尤其可以是关断光(ausschaltlicht)，该关断光将处于激发阻抑光的最小值之外的可切换的冷光标记物关断到非激活状态中，在该非激活状态中，这些冷光标记物无法借助激发光被激发到发射冷光。具体地，冷光标记物可以涉及可切换的荧光染料，该荧光染料例如在高分辨率resolft荧光显微术中所使用。然而在由wo2014/108455已知的方法中，荧光标记物的可切换性主要不用于提高空间分辨率，而是用于保护冷光标记物免于由刺激光的高强度引起的褪色。
由rahoebe等人的《controlledlight-exposuremicroscopyreducesphotobleachingandphototoxicityinfluorescencelive-cellimaging》(自然生物技术，第25卷，第2期，2007年2月，第249至253页)已知一种共聚焦荧光显微术方法，在该方法中，借助聚焦激发光扫描样品，以便对样品中的借助冷光标记物标记的结构进行成像。在此，一旦由样品中的被激发的冷光标记物发射的并且已经借助探测器记录的光子数量达到相应于期望信噪比的上限值，则在聚焦激发光在样品中的每个位置中关断激发光。如果所发射的并且记录到的光子数量未达到最大像素停留时间的预给定的部分时间段内的下限值，则也关断激发光，因为这表明，在聚焦激发光的相应位置处，没有相关的冷光标记物汇集。以这种方式，与借助相同光量在聚焦激发光的每个位置中照射样品相比，借助激发光显著降低了样品的负荷。
由t.staudt等人的《far-fieldopticalnanoscopywithreducednumberofstatetransitioncycles》(光学快报，第19卷，第6期，2011年3月14日，第5644至5657页)已知一种称为rescue-sted的方法，该方法将由rahoebe等人针对共聚焦荧光显微术所描述的方法转移到sted荧光显微术上。由此，仅在必要时或有意义时才借助刺激光的高强度照射样品。
由de102013100147a1已知一种用于在空间上高分辨率地成像样品的具有磷光体的结构的方法，在该方法中，在测量区域内，借助冷光阻抑光的具有局部最小值的光强度分布照射样品。然后，在测量区域内借助冷光激发光照射样品，该冷光激发光将磷光体从电子基态激发进行发光状态中；并且记录从测量区域发射的冷光。将所记录的冷光配属于样品中的局部最小值的位置。借助冷光阻抑光如此干扰磷光体的电子基态，使得磷光体在受干扰的电子基态下具有用于冷光激发光的减小的吸收截面。附加地，可以在记录冷光之前在测量区域中借助sted光照射样品，该sted光在测量区域的中心中也具有局部最小值。如果这种局部最小值比冷光阻抑光的强度分布的局部最小值小，则由此可以更强地限制冷光的空间配属，由此进一步提高在成像结构时的空间分辨率。在荧光阻抑光的强度分布的局部最小值在样品中的所有位置中，sted光的局部最小值与荧光阻抑光的局部最小值彼此同心地布置。
由de102013114860b3已知一种用于确定样品中的物质的各个分子位置的方法，在该方法中，物质的各个分子处于荧光状态中，在该荧光状态中，这些分子能够借助激发光被激发到发射荧光，并且该物质的各个分子的间距维持最小值。借助激发光将物质的各个分子激发到发射荧光，其中，接近光
由wo2010/069987a1已知一种用于使光射束相对于对射束进行聚焦的光学系统动态移位的方法。该方法可以用于sted显微术。在扫描样品时，可以实现快速自适应的光栅图案(rastermuster)，省略了黑暗背景区域或出于其他原因而省略不感兴趣的对象区域，以便通过减少像素数量来实现更高的帧刷新率(bildwiederholungsrate)。
us2012/0104279a1描述一种具有双折射色度射束成形装置的荧光扫描显微镜。该扫描显微镜尤其是sted显微镜。激发光和sted光均通过双折射色度射束成形装置，其中，该射束成形装置不损害连接在后面的物镜焦点中的激发光的光强度最大值的形成，然而相反地，该射束成形装置导致sted光在激发光的强度最大值的位置处形成具有强度最小值的强度分布。
由ep2317362a1已知一种具有提高的分辨率的显微方法，在该方法中，借助激发光的强度最大值扫描样品两次，以便产生样品的两个图像。在此，使两个图像所基于的扫描点以低于该方法的光学分辨率极限的增量彼此偏移，并且分析处理图像中产生的差异以用于实现空间分辨率的提高。由de102013017468a1也已知一种相应的方法。
由us2013/0201558a1已知一种用于使具有中心零点的射束成形的射束成形装置。该射束成形装置可以用于sted显微术。在射束成形装置中，在借助射束扫描样品时所调节的扫描角度受到限制，因为该扫描角度干扰了射束的为形成中心零点而通过不同延迟板调节的相对延迟。
由us7,679,741b2公开一种用于在空间上高分辨率地检查样品的方法，该方法属于具有可切换的物质的resolft显微术。在一种实施方式中，已知方法得出荧光阻抑光的多个零点的并行图像，以便并行地——即同时在多个部分区域中检查样品。
技术实现要素：
本发明的任务是，提供一种用于高分辨率地成像样品中的借助冷光标记物标记的结构的方法以及一种用于执行这种方法的扫描冷光显微镜，借助该方法和该扫描冷光显微镜，基本上降低了样品中的冷光标记物由高的光强度造成的负荷，从而也可以使用对于高的光强度敏感的冷光标记物，并且可以对相应样品中的结构重复成像，以便检测令人感兴趣的对象对变化的周围环境条件的反应。
本发明的任务通过根据独立权利要求1的方法来解决。从属权利要求涉及根据本发明的方法的优选实施方式。
在根据本发明的用于高分辨率地成像样品中的借助冷光标记物标记的结构的方法中，使对冷光标记物发射冷光产生影响的光对准样品，该光具有如下强度分布：该强度分布具有与强度最大值相邻的零点。以零点扫描样品的待扫描的部分区域，并且记录从零点的区域中发射的冷光，并且将该冷光配属于样品中的零点位置。在此，将令人感兴趣的对象的多个样本分别与样品的待扫描的部分区域中的一个重叠(überschneidend)布置，并且使令人感兴趣的对象的多个样本分别承受改变的周围环境条件，以便检测令人感兴趣的对象对此的反应。在周围环境条件改变期间和/或在周围环境条件改变之前以及在周围环境条件改变之后，借助相应零点扫描样品的各个部分区域。在至少一个方向上，并且优选在零点被强度最大值限界的每个方向上，将样品的待扫描的部分区域的尺寸限制在不大于该方向上的强度最大值的间距的75％内。
就在此提及的冷光标记物而言，尤其可以涉及荧光标记物。但是例如也可以使用其他冷光标记物，这些冷光标记物的发光特性例如基于化学发光或电发光。这意味着：在根据本发明的方法中，激发冷光标记物到发射冷光不限于特定机理。然而，通常通过激发光来实现将冷光标记物激发到发射冷光。
对冷光标记物发射冷光产生影响的光可以涉及冷光阻抑光，该冷光阻抑光阻抑冷光标记物发射冷光，其方式是：例如将冷光标记物转换到黑暗状态中，或通过受激发射使被激发的冷光标记物重新被抑制并且因此阻抑该冷光标记物发射冷光。对冷光标记物发射冷光产生影响的光也可以涉及如下光：该光使冷光标记物从不发光状态转换到另一不发光状态中，在该另一不发光状态中，冷光标记物被特别好地保护免于褪色。此外，对冷光标记物发射冷光产生影响的光也可以涉及如下光：该光并非单独地而是与其他光结合地对冷光标记物发射冷光产生影响，使得仅由光的强度分布的零点的区域中的冷光标记物进行冷光发射。
在另一实施方式中，对冷光标记物发射冷光产生影响的光涉及冷光使能光——即冷光激发光，该冷光使能光能够使冷光标记物发射冷光，其方式是：该冷光使能光将冷光标记物激发进行发光，该冷光使能光将冷光标记物从黑暗状态转换到能够被激发的状态中。
对冷光标记物发射冷光产生影响的光的强度分布的零点至少涉及光的局部强度最小值。该局部强度最小值通常涉及如下强度最小值：在该强度最小值中，光的强度基本上下降到零。在理想情况下，零点中心的光强度实际上会下降到零。但这不是强制性要求。如果该光例如涉及冷光阻抑光，则如果在零点的区域内的冷光阻抑光的强度被保持得如此小，使得这不引起或至少基本上不引起、即至少主要不引起冷光标记物的发光的阻抑就足够了。在此，零点被如下区域限界：在该区域中，冷光阻抑光至少基本上阻抑冷光标记物发射冷光。这些区域之间的所有部分在此称为“零点”或“零点的区域”：在该部分中，冷光阻抑光至少基本上阻抑冷光标记物发射冷光。
如果在此提及的强度最大值是就复数形式而言，该强度最大值与对冷光标记物发射冷光产生影响的光的强度分布的零点相邻，则由此不应排除如下情况：零点例如被环形围绕零点延伸的强度最大值所包围。在对发射冷光产生影响的光的强度分布的每个截面中，都显示出两个强度最大值形式的这种环形强度最大值，截面中的这两个强度最大值在两侧上都与零点相邻。
零点可以在一个、两个或三个方向上与强度最大值相邻。这可以涉及面状零点、线状零点或点状零点。在此，该零点可以如此切割二维或一维样品，使得样品维度中的线状零点或点状零点也在所有侧上与强度最大值相邻。此外，可以在不同方向上借助如下零点扫描样品的待扫描的部分区域，以便使在所有方向上成像情况下的空间分辨率最大化：该零点在样品的所有维度中都不与强度最大值相邻。在根据本发明的方法中，在至少一个方向上、优选在样品中的零点与强度最大值相邻的所有方向上对样品的待扫描的部分区域的尺寸进行限制。
与对冷光标记物发射冷光产生影响的光的直接与零点邻接的强度分布区域相比，该光的与样品中的零点相邻的强度最大值的光强度通常大得多，并且在该强度最大值中，光已经以期望的方式对冷光标记物发射冷光产生影响，其方式是：例如阻抑这种发射。强度最大值区域内的非常高的强度是光的总强度高的结果，而这又是如下情况的前提条件：零点的区域在空间上被强烈限制，在该零点的区域内，光对冷光标记物发射冷光至少基本上不产生影响。其结果是，在直接限界零点的区域与强度分布的强度最大值之间留有一中间区域，在该中间区域中，光强度明显低于强度最大值中的光强度。在根据本发明的方法中，有针对性地使用该中间区域，其方式是：样品的被扫描的部分区域的尺寸不超过强度最大值在该方向上的间距的75％。如果被扫描的部分区域的尺寸在相应方向上保持小于强度最大值在相应方向上的间距的50％，则被扫描的部分区域的点不承受光在强度最大值中的完整强度。然而，即使在限制在间距的75％内的情况下，对发射冷光产生影响的光(借助该光照射样品的待扫描的部分区域)的平均强度也得以被明显限制。可以理解，光(借助该光照射样品的待扫描的部分区域)的平均强度下降得越多，则该光的尺寸越远地保持在强度最大值在相应方向上的间距以下。在绝对意义上，在相应的方向上处于强度最大值之间的待扫描的部分区域尺寸可以是最大300nm、优选最大200nm并且更优选是约100nm。这些绝对数据涉及冷光的波长、对冷光标记物发射冷光产生影响的光的波长、和/或可见范围内的可能激发光的波长。
样品的待扫描的部分区域可以涉及样品的如下部分区域：该部分区域在执行根据本发明的方法时被单独地(即唯一地)扫描，并且该部分区域相应地指向样品的令人感兴趣的区域，该令人感兴趣的区域与令人感兴趣的对象的多个样本重叠。
在根据本发明的方法中，原则上可以使令人感兴趣的对象的所有样本承受相同变化的周围环境条件。然而优选地，使样品中的令人感兴趣的对象的多个样本的不同子集承受不同变化的周围环境条件。这尤其能够实现，检测和彼此比较令人感兴趣的对象对不同变化的周围环境条件的不同反应。在此，这些反应不仅可能在反应结果方面不同，而且可能在反应速度方面不同。在此证明有利的是：根据本发明的方法也能够实现以零点更快速地重复扫描待扫描的部分区域。
在根据本发明的方法中，令人感兴趣的对象的样本所承受的周围环境条件可以涉及不同的物理周围环境条件——例如不同温度、不同电场、磁场和电磁场等。但是，也可以通过添加化学物质来来改变周围环境条件，即周围环境条件包括不同的化学周围环境条件。在一种具体实施方式中，可以借助根据本发明的方法执行药物筛选，在该方法中，寻找在令人感兴趣的对象中引起期望反应的物质。为此，可以将令人感兴趣的对象的许多样本单独地或以更大子集的形式置于不同物质中，在引起期望反应的可能性方面对这些物质进行检查。在此，通过根据本发明的方法的空间高分辨率例如能够实现，基于相应物质的作用来检测令人感兴趣的对象的空间变化，这借助许多其他方法无法检测，或者仅能被间接地检测并且因此伴随相应更大的开销被检测。
为了例如特别高效地执行所述药物筛选，在根据本发明的方法中，可以将令人感兴趣的对象的多个样本布置成相对于样品的固定点定义的图案。然后能够非常高效地实现，以零点相对于样品的固定点接近(anfahren)样品的待扫描的部分区域。这也可以完全自动化地进行。例如可以借助免疫反应等实现将令人感兴趣的对象布置成该图案。
在根据本发明的方法中，通常以零点重复扫描样品的待扫描的部分区域，以便检测令人感兴趣的对象对变化的周围环境条件的反应。在此，优选至少在重复扫描样品的待扫描的部分区域时，将零点布置在每个待扫描的部分区域的不超过3n个、甚至不超过2n个位置处，其中，n是空间方向的数量，在该空间方向中，扫描样品的待扫描的部分区域，以便高分辨率地成像令人感兴趣的对象。如果针对每个待扫描的部分区域记录的冷光可以分别配属于所述冷光标记物中的确定一个，则零点的这几个位置足以检测各个冷光标记物在各个待扫描的部分区域中的位置。如果在每个时间冷光标记物中的仅一个发射冷光——即能够实现时间上的区分，或如果冷光例如可以基于其波长而配属于各个冷光标记物，则能够实现这种配属。根据本发明的方法的这种实施方式使用称为minflux的方法。在minflux方法中，为了确定单个冷光标记物在平面中的位置，将激发光的光强度分布的零点定位在样品的四个不同位置中，并且为此检测冷光标记物的冷光强度。
布置在样品中的多个样本中的令人感兴趣的对象可以涉及分子(例如蛋白质分子、复合物)，但也可以涉及更复杂的生物单元(例如突触、膜、另一细胞组织或整个病毒)。
借助相应零点依次扫描部分区域的序列可以非常快，使得也可以检测令人感兴趣的对象中的快速变化。
本发明注意到：样品的扫描的并且因此成像的部分区域被保持得非常小。通常，这些部分区域在对冷光标记物发射冷光产生影响的光的波长情况下的衍射极限的数量级的距离上延伸。然而，通过明显降低对扫描的部分区域平均产生影响的光强度能够实现：也可以顺利使用相对强烈地易于褪色的冷光标记物，或借助强度分布的零点重复扫描样品的被扫描的部分区域。
借助强度分布的零点在部分区域中快速重复扫描样品的可能性也能够实现：在时间上分辨样品中的令人感兴趣的结构中的动态过程。因为样品中的冷光标记物通过根据本发明的方法特别不容易褪色，也就是说，在样品的每个待扫描的部分区域中从每个单个的荧光标记物获得特别多的光子，所以可以拍摄样品的每个待扫描的部分区域的特别多的图像，并且因此也可以观察样品中的令人感兴趣的结构长期变化。通常，在根据本发明的方法中，借助不超过100×100＝10000个像素点扫描样品的部分区域。这可以在几毫秒内实现。因此，可以实现100hz或更高的帧频。
然而在根据本发明的方法中，也可以以零点在样品中的仅非常少的位置来扫描样品的待扫描的部分区域，以便例如基于变化的周围环境条件来检测单个冷光标记物的移位。
有利地，样品的待扫描的部分区域的尺寸在每个方向上——在该方向上强度最大值与零点在样品中相邻——不大于强度最大值在该方向上的间距的45％、25％或甚至10％。如果样品的待扫描的部分区域的尺寸在每个方向上——在该方向上强度最大值与零点在样品中相邻——不大于如下距离：在该距离上，光的强度从零点出发在相应方向上增大到光在相邻强度最大值中的强度的50％、25％、10％或5％，则在对冷光标记物发射冷光产生影响的光强度方面是有利的。相应地，待扫描区域中的冷光标记物的最大负荷也被限于光在邻接强度最大值中的强度的50％、25％、10％或5％。
在根据本发明的方法中有意义的是，在以零点扫描样品的待扫描的部分区域之前，以不同方式对样品中的令人感兴趣的对象的借助冷光标记物标记的样本进行成像，以便确定样品的待扫描的部分区域的位置。样品的待扫描的部分区域是样品的如下部分区域：该部分区域与令人感兴趣的对象的样本如此重叠，使得在该部分区域中产生对象的特殊细节、或产生对象的由于变化的周围环境条件引起的发展。这种成像可以在局部地或大面积地激发冷光标记物到发射冷光的情况下实现。
在扫描样品的待扫描的部分区域之前，也可以以零点以对发射冷光产生影响的光的至少低50％的强度和/或以至少高50％的扫描速度来扫描样品的更大区域，以便确定样品的待扫描的部分区域的位置。虽然在之前进行的扫描中，借助光在强度最大值区域中的高强度照射样品的更大区域的所有点。然而为此将这种强度有针对性地撤回，和/或该强度仅在更短的时间上作用到冷光标记物上。
在根据本发明的方法的一种实施方式中，为了扫描样品的更大区域，使用与用于扫描样品的各个待扫描的部分区域不同的扫描装置。
在使用不同扫描装置用于扫描样品的更大区域以确定样品的待扫描的部分区域，并且然后用于扫描样品的待扫描的部分区域的情况下，可以使用专门协调的扫描装置来扫描样品的待扫描的各个严格限界的部分区域。由于样品中待扫描的部分区域的尺寸小，所以该扫描装置可以是如下扫描装置：该扫描装置虽然无法实现具有零点的光强度分布的大移位，然而，该扫描装置能够非常快速和/或精确地实现其可满足的移位。因此，可以实现非常快速地重复扫描待扫描的部分区域，以便例如跟踪部分区域中的令人感兴趣的对象的快速变化。
具体地，为了在至少一个方向上扫描样品的更大区域，可以使样品的样品支架相对于物镜(借助该物镜使光对准样品)运动，然而为了在至少一个方向上扫描样品的单个待扫描的部分区域，使用电光扫描仪、声光偏转器或振镜——具有电流计的偏转镜。可以将用于扫描样品的各个待扫描的部分区域的装置可以与附加的电光调制器或声光调制器组合成用于使光强度分布的零点移位的移相器。
如已经提及的那样，对冷光标记物发射冷光产生影响的光尤其涉及如下冷光阻抑光：该冷光阻抑光在零点之外阻抑冷光标记物发射冷光。冷光阻抑光例如使可切换的蛋白质形式的冷光标记物转换到或切换到黑暗状态中，在该黑暗状态中，该冷光标记物无法被激发到发射冷光。尤其可以使该冷光阻抑光与激发光一起对准样品，该激发光将冷光标记物激发到发射冷光，并且该激发光具有如下强度分布：该强度分布在冷光阻抑光的零点的区域内具有强度最大值。除了对样品的待扫描的部分区域的严格限制以外，这相应于sted、resolft或gsd荧光显微术中的常规方法。
在根据本发明的方法的一种优选实施方式中，以变型方式应用由wo2014/108455a1已知的方案，在该方案中：借助可切换的冷光标记物执行sted荧光显微术，以便通过将荧光标记物切换到非激活状态中来保护该荧光标记物免受刺激光的强度最大值区域中的高强度影响。具体地，为此在以零点扫描样品的待扫描的部分区域之前，使具有如此强度分布的附加关断光对准样品，使得该附加关断光将与样品的待扫描的部分区域邻接的部分区域中的可切换的冷光标记物关断到非激活状态中。这些邻接的部分区域在至少一个方向上与待扫描的部分区域邻接，在该至少一个方向上，刺激光的最大值与零点在样品中相邻。因此，冷光标记物在如下位置中切换到非激活状态中：在该位置中产生刺激光的强度最大值，并且在没有保护措施的情况下，冷光标记物会由于刺激光在扫描样品的待扫描部分区域时的高强度而褪色。由于在根据本发明的方法的该实施方式中消除了冷光标记物的褪色，所以也可以对彼此直接邻接布置的或甚至彼此重叠的待扫描的部分区域连续执行该方法。换句话说，可以以待扫描的部分区域扫描样品，其中，在样品中的所有位置处或至少在样品中所选择的位置处在其侧以零点扫描待扫描的区域。
关断光的强度分布可以在接下来分别待扫描的部分区域中具有通过相消干涉形成的局部强度最小值，在该局部强度最小值中，关断光至少基本上不关断冷光标记物，也就是说在该局部最小值中，关断光使冷光标记物至少基本上保留在其激活状态中，在该激活状态中，冷光标记物能够通过激发光被激发。取决于对可切换的冷光标记物的选择，可能需要这种激活状态，或者至少有意义的是，在使关断光对准样品之前或在时间上与其同时地，使接通光分别对准样品的分别待扫描的部分区域，该接通光将可切换的冷光标记物切换到其激活状态中。
在接通和/或关断时，可切换的冷光标记物通常也发射冷光。可以在根据本发明的方法中记录并且分析处理这种冷光。这种分析处理的目的例如可以是如下判定：由分别邻接的部分区域所限界的待扫描的部分区域究竟是否以零点扫描，或者该待扫描的部分区域是否仅在整体上借助激发光照射然后共聚焦地记录所发射的冷光，或者是否根本不借助激发光照射，因为在接通和/或关断时记录的冷光的低强度表明，在相应待扫描的部分区域中不存在冷光标记物的相关浓度。此外，该分析处理可以具有如下目的：确定在哪些条件下，有意义地中断使刺激光在零点的每个位置中对准样品的由邻接部分区域所限界的待扫描的区域中；并且有意义地中断记录从零点的区域发射的冷光。也就是说，例如可以根据分析处理的结果来确定用于在待扫描的部分区域中执行rescue方法的上限值和/或下限值。
在根据本发明的方法的一种特定实施方式中，借助点传感器记录从零点的区域发射的冷光，在扫描样品的相应待扫描的部分区域时，该点传感器的位置相对于样品不改变。也就是说，在借助点传感器记录冷光时，不考虑对冷光标记物发射冷光产生影响的光的光强度分布的零点的位置变化。这是能够实现的，因为待扫描的部分区域的尺寸通常小于点传感器在样品方面的检测范围。这也适用于相对于相应待扫描的部分区域的中点共聚焦布置的点传感器。即使涉及这种点传感器，冷光也有规律地从样品的整个待扫描的部分区域中到达该点传感器，因为该点传感器的尺寸通常低于冷光波长情况下的衍射极限。位置固定的点传感器意味着，用于扫描样品的相应待扫描的部分区域的零点仅通过对如下光的作用而移位：该光对冷光标记物发射冷光产生影响。也不需要将可能的激发光与对冷光标记物发射冷光产生影响的光一起移位，因为该激发光的强度最大值通常也在样品的整个待扫描的部分区域上延伸。
而且如已经提及的那样，对冷光标记物发射冷光产生影响的光可以替代地涉及冷光使能光，该冷光使能光仅在零点以外才允许由冷光标记物发射冷光。这意味着，该光涉及作为对准样品的唯一的光的冷光激发光。这也意味着，该光涉及冷光激活光，该冷光激活光将冷光标记物从黑暗状态中转换、即激活到能够被激发到发光的状态中。对冷光标记物发射冷光产生影响的光也可以具有这两种功能——激活和激发，并且为此也具有两个不同的波长分量。如果借助对冷光标记物发射冷光产生影响的光的强度分布的零点扫描样品的部分区域，则该部分区域能够根据本发明被保持得如此小，以便不借助或至少尽可能少地借助光在与零点邻接的强度最大值区域内的高强度来照射存在于该部分区域中的冷光标记物。在根据本发明的方法的这种实施方式中，通常借助摄像机来检测由样品中的冷光标记物发射的冷光，并且在考虑到零点在样品中的当前位置并且因此考虑到从样品发射的并且借助摄像机检测的冷光的强度分布的相关变化的情况下通过展开所记录的强度分布来实现分析处理。
如果在待扫描的部分区域中，分别只有一个冷光标记物发射从样品中检测到的冷光，则也可以非常简单地由针对零点的不同位置所记录的冷光来求取该冷光标记物在样品中的位置，这例如通过拟合具有局部极值的函数来实现，其中，使拟合函数的极值位置与冷光标记物的所寻求的位置等价。如果对冷光标记物发射冷光产生影响并且其强度分布具有零点的光是冷光阻抑光，或者如果该光涉及冷光使能光或冷光激发光，则能够实现这种方法。在第一种情况下，通过冷光阻抑光的与零点邻接的强度最大值以有利的方式防止：由位于附近的其他冷光标记物发射的冷光干扰位置确定。在第二种情况下，待扫描的部分区域中的相应冷光标记物仅借助最小光量照射并且因此仅受到最小的光化学负荷。
根据本发明的方法的缺点——样品的被扫描的并且因此被成像的部分区域被分别保持得非常小——可以至少部分地通过如下方式补偿：在多个部分区域中同时扫描样品。在此，尤其可以使用对冷光标记物发射冷光产生影响的光的零点光栅，这例如原则上已经已知。然而在此，根据本发明无法将零点光栅移位得如此远，使得样品在整体上被成像，也就是说在整个光栅尺寸上对样品进行成像。更确切地说，即使在根据本发明的方法的这种实施方式中，在其中扫描样品的各个部分区域也保持彼此分离。只有这样，才能根据本发明在样品的被扫描的部分区域中降低冷光标记物的褪色风险。可以理解，如果借助可切换的冷光标记物来执行本发明的这种并行的实施方式，该冷光标记物分别仅在样品的待扫描的部分区域中才处于其荧光状态中，则也可以补充地以待扫描的部分区域来扫描样品，以便完整地成像该样品。
因为在根据本发明的方法中，令人感兴趣的对象的多个样本分别与样品的多个待扫描的部分区域中的一个重叠地布置，所以在扫描每个部分区域时都会获得这些对象的部分图像。如果这些部分图像在该对象上呈统计学分布并且数量足够大，则可以由这些部分图像重建整个令人感兴趣的对象的图像。可以理解的是，前提条件是：令人感兴趣的对象的不同样本至少在一定程度上一致。为了将部分图像配属于令人感兴趣的对象的确定点，可以附加地以其他方式成像样品中的令人感兴趣的对象的样本，以便确定这些样本相对于样品的被扫描的部分区域位置和定向。
用于执行根据本发明的方法的扫描冷光显微镜具有：光源，该光源用于对冷光标记物发射冷光产生影响的光；光成形装置，该光成形装置使具有如下强度分布的光对准样品，该强度分布具有与强度最大值相邻的零点；扫描装置，以便以零点扫描样品的待扫描的部分区域；探测器，该探测器记录从零点的区域发射的冷光；控制装置，该控制装置用于执行根据本发明的方法。
该探测器可以是点探测器，其中，在扫描样品的待扫描的部分区域时，该点探测器相对于样品的位置可以是固定的，也就是说，该点探测器可以检测从样品发射的冷光而不进行扫描，因为待扫描的部分区域通常具有低于衍射极限的尺寸。然后，可以存在其他扫描装置，该其他扫描装置与用于以零点扫描样品的待扫描的部分区域的扫描装置不同，并且该其他扫描装置设置用于扫描样品的更大区域。
在此，用于在至少一个方向上扫描样品的更大区域的扫描装置也可以具有能够相对于光成形装置的物镜运动的样品支架，然而，用于在至少一个方向上扫描样品的待扫描的部分区域的扫描装置可以包括电光扫描仪、声光偏转器或振镜。
然而，该探测器例如也可以是检测样品的扫描的冷光的点探测器，或者是检测来自相对于样品固定的相对位置的未扫描的冷光的面探测器——例如摄像机。
在用于执行根据本发明的sted方法的扫描冷光显微镜中，由光源提供的光是刺激光，并且设置另一用于激发光的光源，其中，光成形装置使具有如下光强度分布的激发光对准样品：该光强度分布在冷光阻抑光的零点的区域内具有最大值。
为了执行根据本发明的方法——该方法使用可切换的冷光标记物，在扫描冷光显微镜中，附加地设置用于关断光的关断光源，其中，光成形装置使具有如此强度分布的关断光对准样品，使得该关断光将样品的与待扫描的部分区域邻接的部分区域中的可切换的冷光标记物关断到非激活状态中。在此，邻接的部分区域在至少一个方向上与待扫描的部分区域邻接，在所述至少一个方向上，刺激光的强度最大值与零点在样品中相邻。此外，可以设置用于接通光的接通光源，该接通光将可切换的冷光标记物接通到其激活状态中，其中，在使关断光对准样品之前和/或在时间上与其同时地，光成形装置使接通光对准样品的包括待扫描的部分区域的部分区域。
在根据本发明的方法的实验测试中，已经实现：样品中的冷光标记物的光子输出以大于100的因子提高。这例如意味着，可以拍摄正在变化的令人感兴趣的结构的100倍以上的图像，以便记录该变化。此外，对于每个单个图像需要更少的时间，因为在每个时间单元内，由样品中的冷光标记物持续发射更多光子。
本发明的有利扩展方案由权利要求、说明书和附图得出。在说明书中提到的特征的优点以及多个特征的组合的优点仅仅是示例性的，并且可以替代地或累积地生效，而这些优点比一定必须由根据本发明的实施方式所实现。在不由此改变所附的权利要求的主题的情况下，在原始的申请材料的公开内容和专利的公开内容方面适用的是：可以从附图——尤其从多个构件相互之间示出的几何形状和相对尺寸、以及它们的相对布置和有效连接——得出其他特征。同样地，可以与权利要求所选择的引用偏离地实现并且借此引起本发明的不同的实施方式的特征的组合或不同的权利要求的特征的组合。这也涉及在独立的附图中示出的或在其描述中提及的特征。所述特征也可以与不同的权利要求的特征组合。同样地，对于本发明的其他实施方式，可以缺少在权利要求中列举的特征。
在权利要求和说明书中提到的特征应该在其数量方面如此理解：存在恰好该数量或大于所提及数量的数量，而不需要明确使用副词“至少”。例如当就一个光源而言时，应如此理解：即存在恰好一个光源、两个光源或多个光源。这些特征可以通过其他特征得以补充或产生相应结果或相应方法所具有的唯一特征。
在权利要求中包含的附图标记不表示对通过权利要求所保护的主题的范围的限制。这些附图标记仅旨在使权利要求便于理解。
附图说明
以下根据附图中示出的优选实施例进一步阐述和描述本发明。
图1示意性示出激发光和荧光阻抑光的强度分布，该激发光和荧光阻抑光作为对布置在样品中的冷光标记物发射冷光产生影响的光的示例，图1还示出由此导致样品中的荧光标记物被有效激发到发射荧光；
图2针对根据图1的荧光阻抑光的强度分布，示出样品的在根据本发明的方法中借助根据图1的强度分布待扫描的部分区域的尺寸；
图3以俯视图示出样品的待扫描的部分区域的示意图，其中，沿着蜿蜒形轨迹进行扫描；
图4以俯视图示出样品的待扫描的部分区域的示意图，其中，沿着螺旋轨迹进行扫描；
图5示意性示出一种荧光显微镜，该荧光显微镜作为用于执行根据本发明的方法的扫描冷光显微镜的示例；
图6示出(a)样品的预先拍摄的共聚焦图像，(b)样品的部分图像，该部分图像在基于共聚焦图像选择出样品的各个待扫描的部分区域之后根据本发明所拍摄；
图7示出能够拍摄的图像的数量与样品的被扫描的部分区域的尺寸之间的相关性；
图8示意性示出一种不同于图5中的荧光显微镜的荧光显微镜，该荧光显微镜作为用于执行根据本发明的方法的扫描冷光显微镜的另一示例；
图9示出样品的待扫描的部分区域的示意图，同时还示出邻接的部分区域，在该邻接的部分区域中，借助扫描荧光显微镜使关断光对准样品；
图10示出样品中的根据图9的多个待扫描的部分区域的一种布置，以便以待扫描的部分区域来扫描样品；
图11示出样品中的待扫描的部分区域的另一布置；
图12示出针对根据本发明的方法的一种实施方式的方框图；
图13示出样品中的待扫描的部分区域在根据图12的根据本发明的方法中的一种布置；
图14示意性示出令人感兴趣的对象对变化的周围环境条件的反应；
图15阐述：在扫描待扫描的部分区域时，仅将零点布置到样品的几个位置处。
具体实施方式
在图1中，在上部示出激发光1的强度分布的截面。激发光1在几何焦点f处具有强度最大值27，该强度最大值具有最大强度i。然而，强度i分布在在所有侧上远超出焦点f延伸的区域，该区域的直径相应于激发光1的波长λ情况下的衍射极限，并且根据λ/na，该区域的直径相应于用于将激发光1聚焦到所使用的物镜的焦点f中的数值孔径na。为了将借助激发光1所实现的对样品中的荧光标记物的激发限制在比激发光1的强度分布的延伸更小的区域内，附加地使荧光阻抑光2对准样品，该荧光阻抑光具有与强度最大值3相邻的零点4。荧光阻抑光2例如通过如下方式来阻抑由激发光1所激发的荧光标记物发射荧光：通过受激发射使荧光标记物重新被抑制。在荧光阻抑光2的零点4区域5以外的任何区域，荧光阻抑光2的强度i如此大，使得完全实现这种抑制，也就是说，布置在那里的荧光标记物不发射荧光。相反，在此借助“零点4”来表示整个区域5，在该区域内，荧光阻抑光2的强度i被保持得如此小，使得该强度不阻抑布置在其中的荧光标记物发射荧光。图1在下部示出有效荧光激发6的空间分布。这种空间分布被限制在零点4区域5内。如果以零点4扫描样品，则从样品发射的荧光始终仅来源于区域5，并且该荧光可以相应地配属于样品的该位置。
如果在扫描样品时，零点4接近借助荧光染料标记的令人感兴趣的结构，则在荧光标记物到达零点4的区域5之前，荧光标记物会首先进入到强度最大值3的区域中，并且进入到激发光1的与此重叠的强度区域中。在首次记录到来自该荧光标记物的荧光之前，尤其在逐行扫描样品时，借助高的光强度重复照射荧光标记物。这可能导致，荧光标记物在首次到达零点4之前就已经褪色。由于这种效应，为观察样品的借助荧光标记物标记的令人感兴趣的结构的时间变化而重复扫描同一样品，也是无法实现的。
然而，当样品的以零点4扫描的区域——如其在图2中示出那样——被限制在强度最大值3的间距d0的至多3/4或75％内时，则扫描区域内的荧光标记物的平均负荷已经降低，该平均负荷通过荧光阻抑光2在强度最大值3区域内的高强度、尤其结合根据图1的激发光1的强度所产生。如果待扫描的区域的尺寸被限制在强度最大值3的间距d0的一半以及更小，则该负荷进一步降低。在将尺寸限制在小于d0/2的情况下，在扫描样品的待扫描的区域时，该部分区域中的任何点都不再会进入到强度最大值3的直接区域中。如果待扫描的区域的尺寸被限制在d0/4内，则荧光阻抑光2(借助其在待扫描的区域内照射样品)的最大强度被限制在约i0/2内，其中，i0是荧光阻抑光2在强度最大值3中的最大强度。
图3示出，以零点4的区域5沿着此处的蜿蜒形轨迹9扫描以截面方式示出的样品8的待扫描的部分区域7。在此示出强度最大值3内的待扫描的部分区域7，其中，该强度最大值3的位置相应于零点4到待扫描的部分区域7的中点10上的定向。相应地，强度最大值、更确切地说此处的环状强度最大值3围绕图3中示出的零点4位置还是延伸通过待扫描的部分区域7，这通过虚线11表明。然而，可以通过进一步将待扫描的部分区域7限制在小于d0/2内来防止这种相交(
图4示出样品8的被限制在d0/2内的待扫描的部分区域7。在此，在零点4处于待扫描的部分区域7中的任何位置情况下，借助虚线11表明的环状强度最大值3的变化过程都不会到达部分区域7。此外，图4示出螺旋轨迹12，沿着该螺旋轨迹，从中点10出发扫描待扫描的部分区域7。与轨迹的形状无关，在扫描待扫描的部分区域7时使零点4在该轨迹上运动，将由样品8发射和记录的荧光配属于零点4在样品中的相应位置。
图5示出扫描荧光显微镜13，该扫描荧光显微镜尤其适用于执行根据本发明的方法。扫描荧光显微镜13具有用于荧光阻抑光2的光源14，该荧光阻抑光的横截面借助扩展光学器件(aufweiteoptik)15所扩展，并且该荧光阻抑光的波前在其横截面上借助相位板16如此调制，使得该荧光阻抑光在借助物镜45聚焦到样品8中之后，形成围绕相应焦点f的具有根据图1和图2的相邻强度最大值3的零点4。对于激发光1，设置具有扩展光学器件18的另一光源17。借助二向色镜19共同引导激发光1和荧光阻抑光2，使得激发光1在荧光阻抑光2的零点4区域5内具有其根据图1的强度最大值27。从样品、具体地从荧光阻抑光2的零点的区域发射的荧光20借助二向色镜26耦合输出并且借助点探测器21记录，并且该荧光被配属于零点在样品中的相应位置。为了以零点扫描样品的相应部分区域，设置用于两个彼此正交的扫描方向的扫描装置22和23，所述扫描装置彼此协调地被操控。扫描装置22和23仅影响激发光1的方向和荧光阻抑光2的方向，所述扫描装置甚至可以仅布置在荧光阻抑光2的射束路径中。因为样品8的待扫描的部分区域7具有低于衍射极限的尺寸，所以即使在点探测器21相对于样品8位置固定地布置的情况下，尽管借助扫描装置22和23使零点移位，从荧光阻抑光2在样品8中的零点的区域发射的荧光20也始终到达点探测器21。为了扫描超出样品8的根据本发明被扫描的待扫描部分区域7的样品8，以便例如首先求取合适的待扫描的部分区域的位置，在样品支架24区域内设置其他的扫描装置，这些扫描装置在此仅通过相应的移位符号25表明。
在目前的描述中尚未明确说明的是，荧光阻抑光2的强度分布的零点4在使荧光阻抑光2对准样品的z方向上也可以受到强度最大值3的限制，以便也在该z方向上提高成像样品8中的令人感兴趣的结构时的位置分辨率。相应地，在该z方向上，待扫描的部分区域7也被限制在光在该方向上的强度最大值的间距的至多75％、优选小于50％内，或者还在z方向上从该部分区域的中点10处开始，并且随着至该中点10的间距的增大，扫描该待扫描的部分区域7。然而，在根据本发明的方法中，也可以通过其他措施——例如通过4pi装置或通过用于发射荧光的荧光标记物的双光子激发或通过荧光显微术领域内已知的其他措施——实现在z方向上成像结构时提高位置分辨率。原则上也适用的是：在此描述的方法可以通过在荧光显微术领域内已知的其他措施所补充。这例如包括：以脉冲施加荧光阻抑光2和/或激发光1、同时连续地施加激发光1或荧光阻抑光2、在相应脉冲之后在限定时间窗口内门控地(gegatet)记录荧光等。
根据图6(a)的共聚焦图像拍摄自如下样品：在该样品中，令人感兴趣的结构借助冷光标记物核孔蛋白gp210标记。该共聚焦图提供关于令人感兴趣的结构的概览。由该概览，已经选择出样品的各个部分区域，在这些部分区域中，根据本发明的方法拍摄sted图像。这些部分区域小于激发光的焦点。在这些部分区域中，同时以高的空间分辨率和高的光输出成像令人感兴趣的结构。为了拍摄图6(b)中示出的、呈现样品的被扫描的部分区域的部分图像，借助20mhz的重复速率以脉冲形式使波长为635nm并且功率为5μw的激发光对准样品。波长为775nm的sted光以脉冲长度为1.2ns、功率为150mw的同步脉冲形式被对准样品。借助1.4na的转化物镜(
图7根据样品的被扫描的部分区域的尺寸示出褪色特性，该样品的部分区域以sted扫描荧光显微术中的核孔蛋白为例。τ1/2表示在荧光信号由于褪色而降低到初始值的一半之前能够拍摄的图像的数量。τ1/2是样品的被扫描的部分区域的以纳米为单位的尺寸的函数。sted功率是160mw，激发功率是2μw。在其他方面，sted条件相应于根据图6的sted条件。在扫描部分区域的尺寸是100×100nm2的情况下，与800×800nm2的尺寸相比，褪色以因子100降低。相应地，例如可以对同一部分区域拍摄100倍以上的图像，以便例如观察动态过程。
图8中示出的扫描荧光显微镜13具有与图5中示出的扫描荧光显微镜的如下区别。点探测器21从样品8看布置在扫描装置22和23后面，使得扫描装置扫描从样品8到点探测器21的荧光20。在此，扫描装置22和23不仅设置用于扫描分别借助荧光阻抑光2的零点待扫描的部分区域，而且原则上也设置用于布置或移位样品8中的待扫描的部分区域。图8还示出用于荧光的探测器28，该探测器从样品8看布置在扫描装置22和23前面。然而，该探测器不涉及点探测器，而是涉及摄像机29——即面探测器。探测器28可以除了点探测器21以外地设置、或替代点探测器28地设置，其中，将荧光20偏转至探测器28的二向色镜30要么暂时地、要么持续地被布置在物镜45与扫描装置22和23之间。
此外，在根据图8的扫描荧光显微镜13中，设置关断光源31，该关断光源配属有扩展光学器件32，以便在借助荧光阻抑光2的零点扫描相应待扫描的部分区域之前，提供关断光34。借助二向色镜43耦合输入关断光34，并且借助射束成形装置33使关断光在样品8中的强度分布如此成形，从而该关断光在与样品8的待扫描的部分区域邻接的部分区域中，将样品8中包含的可切换的荧光标记物切换到非激活状态中。在这种非激活状态中，样品8中的可切换的荧光标记物无法借助激发光1激发到发射荧光20。相应地，对于这些荧光标记物来说，可以认为它们在其非激活状态中没有被刺激光形式的荧光阻抑光2褪色的相关风险。因此，借助根据图8的扫描荧光显微镜13能够实现，借助荧光阻抑光2的零点扫描与样品8的已经被扫描的待扫描的部分区域邻接的部分区域，并且在此记录来自样品8的荧光20，因为位于那里的冷光标记物在扫描之前扫描的待扫描的部分区域时未褪色，这是因为这些冷光标记物处于保护其免于褪色的非激活状态中。
为了可以借助激发光1激发邻接的待扫描的部分区域中的冷光标记物到发射荧光20，这些冷光标记物必须重新存在于激活状态中。为此，可以等待冷光标记物从其非激活状态自发地返回到其激活状态中。然而，根据图8的扫描荧光显微镜13还具有一个附加的接通光源35，该接通光源具有扩展光学器件36，以便使接通光37通过二分色镜44对准样品8，借助该接通光，将下一待扫描的部分区域中的冷光标记物首先切换到其激活状态中。在此，样品8的由接通光37检测的部分区域可以大于下一待扫描的部分区域，因为接下来借助关断光34将下一待扫描的部分区域之外的冷光标记物转换到其非激活状态中。因此，可以借助扫描荧光显微镜13两阶段地扫描样品8，也就是说，以大步长以待扫描的部分区域扫描样品8，并且以小步长借助荧光阻抑光2在每个待扫描的部分区域内的零点扫描样品8。
在借助接通光37接通样品8中的冷光标记物或借助关断光34关断样品8中的冷光标记物时，不同的可切换的冷光标记物也被激发到发射荧光20。因此，这种荧光20已经提供了关于样品8的相应部分区域中的冷光标记物的浓度的信息。该信息可以被相应地分析处理并且用于判定：究竟是否值得借助荧光阻抑光2的零点扫描下一待扫描的部分区域。如果不值得，则也不执行这种扫描，以免不必要地借助荧光阻抑光2照射样品8。此外，也可以使用在接通或关断冷光标记物时所记录的荧光20，以便确定在荧光阻抑光2在待扫描的部分区域中的零点的相应位置处记录的荧光的上限值和/或下限值，在达到或未达到该极限值的情况下，中断在rescue方法的意义上借助荧光阻抑光2和激发光1来照射样品8。
最后，图8示出控制装置38，该控制装置用于光源14和17、接通光源35、关断光源31和扫描荧光显微镜13的扫描装置22和23，以便按照根据本发明的方法来操控所述光源和扫描装置。
图9示出待扫描的部分区域7和围绕其延伸的荧光阻抑光的强度最大值3，此时荧光阻抑光的零点处于待扫描的部分区域7的中点10中。此外，在图9中示出环状邻接的部分区域39，在扫描部分区域7之前，在该环状邻接的部分区域中借助关断光34照射样品8，以便将位于此处的可切换的冷光标记物转换到其非激活状态中。部分区域39将部分区域7刨除(aussparen)，也就是说，在部分区域7中，关断光34的强度是零或至少如此小，使得使关断光不足以在将关断光34对准样品8的时间内关断冷光标记物。为了确保可切换的冷光标记物至少在样品8的待扫描的部分区域7内处于其激活状态中，在关断光34之前和/或与关断光在时间上重叠地，在包括待扫描的部分区域7的圆形部分区域40上，将接通光37对准样品8上。
图10示出，可以如何以待扫描的部分区域7来扫描样品8。在此，图10(a)示出样品8中的根据图9的圆形部分区域7的多个彼此相继的位置，并且在这些部分区域7中的一个中示出轨迹9，沿着该轨迹，在部分区域7内扫描样品8的正方形区域。图10(b)示出，可以如何借助这种正方形部分区域41来完全覆盖样品8，并且相应地可以完全成像该样品。
图11(a)示出以部分区域7扫描样品8的另一形式。在此，圆形部分区域7的彼此相继的位置在样品8中以六边形布置设置。在此，轨迹9在正六边形上延伸，沿着轨迹9，借助荧光阻抑光的零点扫描每个部分区域7。图11(b)示出，如何借助这些正六边形42来检测整个样本8并且相应地成像该样本。
在图12中以方框图示出的根据本发明的方法的实施方式始于：借助冷光标记物标记46多个令人感兴趣的对象。在此虽然借助多个冷光标记物标记每个令人感兴趣的对象。然而，每个对象的冷光标记物的数量可以很小、例如仅两个。具体地，可以借助两个相同的或两个不同的荧光标记物来标记令人感兴趣的对象(例如蛋白质)的两个不同区域，以便在如下方面成像该对象的结构：令人感兴趣的对象的这两个区域彼此当前相距多远。在随后将多个令人感兴趣的对象布置47到样品8的待扫描的部分区域7中时，在部分区域7中的每个中布置有这些对象中的一个。这种将恰好一个令人感兴趣的对象布置47在每个部分区域中可以基于免疫反应来进行，通过免疫反应，分别一个令人感兴趣的对象被附于相应待扫描的部分区域7的中点上。随后，通过借助光的强度分布的零点扫描待扫描的部分区域7，以实现确定48冷光标记物在样品8中的位置，该光对冷光标记物受到冷光激发光作用而发射冷光产生影响。具体地，冷光标记物在样品8中的位置可以由冷光的强度所确定，该强度已经关于每个部分区域7针对零点在样品8中的各个位置而被记录。如果接下来改变49令人感兴趣的对象的周围环境条件，该改变对对象的结构产生影响并且因此对冷光标记物在样品8中的相对位置产生影响，则可以通过重复确定48来检测这种影响。在此，可以多次地重复该确定48，其中，这种重复在改变49期间就已经开始，并且在此之后也可以继续进行，以便检测令人感兴趣的对象对变化的周围环境条件的反应的动态特性。
图13示出样品8，在该样品中，多个待扫描的部分区域7相对于固定点50以图案51定义地布置。在此，图案51涉及正方形图案，部分区域7以行52和列53规则地布置成该正方形图案。在此，待扫描的部分区域7中的每个能够在使用固定点50的情况下被找到，并且该部分区域中的每个能够借助对冷光标记物发射冷光产生影响的光的强度分布的零点被接近(anfahren)。令人感兴趣的对象可以通过已经提及的免疫反应耦合到部分区域7的中点54中，使得与部分区域7中的每个重叠地分别布置有一个令人感兴趣的对象。
图14高度示意性地示出令人感兴趣的对象55，该对象在两个区域中借助在此不同地示出的冷光标记物56和57标记。在此示出：冷光标记物56和57被布置在线状对象55的两个端部上。在此，图14a示出对象55的拉伸结构，而图14b示出对象55的弯曲的或折叠的结构。根据图14a的拉伸结构与根据图14b的折叠结构之间的变化可能是对象55对变化的周围环境条件(例如变化的ph值或确定化学物质的存在)的反应。在此，可以借助根据本发明的方法容易地记录该结构的变化，其方式是：检测两个冷光标记物56与57的间距。为此，如果可以基于不同波长或在时间上分离由两个冷光标记物56和57发射的冷光，则可以同时确定两个冷光标记物56和57在样品中的位置，因为这两个冷光标记物56和57分别仅暂时地发射冷光。即使两个冷光标记物56和57是相同的，也可以通过不同措施实现通过这两个冷光标记物56和57中的各一个暂时地发射冷光，其方式例如是：冷光标记物56和57按照其借助冷光激发光激发的顺序而暂时进入到黑暗状态中，或这些冷光标记物被构造成可切换的冷光标记物，该可切换的冷光标记物可以借助附加的关断光暂时切换到黑暗状态中。
图15示出针对一个待扫描的部分区域7的四个位置58和59，在这些位置处可以布置有对发射冷光产生影响的光的强度分布的零点，以便确定各个进行发射的冷光标记物56、57在部分区域7中的位置。在此，位置58处于该部分区域7的中点54上，位置59处于部分区域7的边缘区域中的圆弧上。为了确定相应冷光标记物56或57在样品平面中的位置，通过仅以零点的四个位置扫描部分区域7，可以非常快速地实现这种确定。此外，如果对发射冷光产生影响并且借助具有零点的强度分布对准样品的光是如下激发光：该激发光仅以低的强度照射到相应的冷光标记物56、57上，则仅需要来自相应冷光标记物56、57的非常少量的光子，以便确定该冷光标记物在部分区域7中的位置。这也允许在敏感的冷光标记物的情况下重复确定位置，以便检测令人感兴趣的对象55对变化的周围环境条件的反应。
附图标记列表
1激发光
2荧光阻抑光
3强度最大值
4零点
5区域
6激发
7待扫描的部分区域
8样品
9轨迹
10中点
11虚线
12螺旋轨迹
13扫描荧光显微镜
14光源
15扩展光学器件
16相位板
17其他光源
18扩展光学器件
19二向色镜
20荧光
21点探测器
22扫描装置
23扫描装置
24样品支架
25移位符号
26二向色镜
27强度最大值
28探测器
29摄像机
30二向色镜
31关断光源
32扩展光学器件
33射束成形装置
34关断光
35接通光源
36扩展光学器件
37接通光
38控制装置
39邻接的部分区域
40部分区域
41正方形
42六边形
43二向色镜
44二向色镜
45物镜
46标记(步骤)
47布置(步骤)
48确定(步骤)
49改变(步骤)
50固定点
51图案
52行
53列
54中点
55对象
56冷光标记物
57冷光标记物
58位置
59位置
f焦点
i强度
d0间距
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