高分辨率扫描显微术的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于对样本进行高分辨率扫描显微术的显微镜，具有:用于对样本进行照明的照明装置;成像装置，用于在样本上扫描至少一个点光斑或线光斑并且用于在考虑成像比例的条件下在探测层面内将点光斑或线光斑成像为衍射受限的、静止的单个图像;探测器装置，用于对于不同的扫描位置以位置分辨率采集探测层面内的单个图像，所述位置分辨率在考虑成像比例的情况下至少是衍射受限的单个图像的半值宽度的两倍;分析装置，用于根据探测器装置的数据对于扫描位置分析单个图像的衍射结构并且用于产生样本的图像，所述图像的分辨率超过衍射极限。本发明还涉及一种用于对样本进行高分辨率扫描显微术的方法，其中:对样本进行照明；将在样本上以扫描方式导引的至少一个点光斑或线光斑成像为单个图像，其中，点光斑或线光斑在考虑成像比例的条件下衍射受限地成像为单个图像并且单个图像静止地处于探测层面内；对于不同的扫描位置以位置分辨率采集单个图像，所述位置分辨率在考虑成像比例的情况下至少是衍射受限的单个图像的半值宽度的两倍，从而采集单个图像的衍射结构;对于每个扫描位置分析单个图像的衍射结构并且产生样本的图像，所述图像的分辨率超过衍射极限。
【背景技术】
[0002]这种显微镜或显微术方法例如由C.Mill Ier和J.Ender Ie in的公开出版物PhysicalReview Letters，104，198101 (2010)，或者由专利文献EP 2317362 Al已知，其也提及了关于现有技术的其它说明。
[0003]这种方式实现了分辨率的提高，方法是将光斑衍射受限地成像在探测层面上。衍射受限的成像将点光斑成像为艾里斑(Airy-Scheibe)。在探测层面内这样采集衍射斑，使得能够分辨出其结构。因此，在显微镜的成像效率方面，探测器进行过采样。在成像点光斑时，分辨出艾里斑的形状。通过适当的衍射结构分析，实现了将分辨率提高为衍射极限的2倍，这种分析在所述文献中进行了描述并且其与之相关的公开内容在此完全包含在本发明中。
[0004]然而在此在探测方面不可避免的是，对于每个在样本上以这种方式被扫描的点来说，与传统的激光扫描显微镜(以下也称为LSM)相比，必须记录具有多倍图像信息的单个图像。如果例如以16像素采集光斑的单个图像的结构，则不只是每个光斑包含16倍的数据量，而且单个像素平均只包含在通常的针孔探测中照射到LSM探测器上的射线强度的1/16。因为射线强度必然不均匀地分布在单个图像的结构、例如艾里斑上，所以在结构边缘上的射线强度实际上甚至还明显小于在η个像素时为I/η的平均值。
[0005]所要解决的问题是，能够在探测器侧以高分辨率采集射线量。通常在显微镜中使用的传统的CCD阵列不能实现足够的信噪比，因此即使延长图像记录时长也无济于事，而延长图像记录时长本身在应用中已经被视为是不利的。AH)阵列也与过高的暗噪声相关，因此即使延长测量时长所得到的信噪比也不够。对于CMOS探测器同理，其还在探测器元件的尺寸方面是不利的，因为光斑的衍射受限的单个图像会落在过少的像素上。PMT阵列带来了类似的结构空间问题;在该处的像素同样过大。因此，结构空间问题尤其在于，用于高分辨率的显微镜在诸如准备设备的研发开销方面只在能够集成到现有的LSM结构中的情况下是可能的。然而在此预先给出了单个图像的特定尺寸。只在附加地设有再次将图像显著地、也就是以多个量级扩展的光学器件时，才能安装面积较大的探测器。这种光学器件使得想在没有其它成像误差的情况下得到衍射受限的结构是非常耗费的。
[0006]在现有技术中已知其它方法，它们避免所描绘的在高分辨率情况下探测方面的问题。例如在EP 1157297 BI中提到一种方法，其中借助结构化的照明充分利用非线性过程。结构化的照明在多个旋转和地点位置中在样本上推移并且在这些不同的状态下将样本成像在广视场探测器上，对于这些探测器不存在所述的限制。
[0007]在没有所述探测器限制的情况下同样达到高分辨率(也就是超过衍射极限的样本图像分辨率)的方法由WO 2006127692和DE 102006021317已知。简称为PALM的方法使用标记物质，其可以借助光学激活信号被激活。标记物质只能在激活状态下被激励辐射激励以发出某种焚光福射;未激活的分子即使在有激励福射入射的情况下也不会发出焚光福射。激活射线使激活物质进入一种状态，在该状态下其能够被激励以发光。因此其通常称为变换信号。这样施加所述变换信号，使得至少一定比例的被激活的标记分子与相邻的同样被激活的标记分子相间隔为使得在被激活的标记分子在被以显微术的光学分辨率测量的情况下是分隔开的或者可事后分隔开。这称为激活的分子的隔离。对于这些被隔离的分子，能够简单地确定其在分辨率受限的情况下得到的射线分布的中心并且因此通过计算以比光学成像本来允许的精度更高的精度确定分子的位置。为了使整个样本成像，PALM方法利用了这个事实，即标记分子在给定的变化信号强度下通过变换信号被激活的概率对于所有标记分子来说是相同的。将变换信号的强度施加为使得实现期望的隔离。一直重复这些方法步骤，直至以一次一个子集被激励为发荧光的方式包含了尽可能所有的标记分子。
[0008]在本发明中，在样本上被扫描的光斑静止地在探测层面内成像。来自探测层面的射线以不成像的方式被再分配并且被引到探测器阵列上。在此，术语“以不成像的方式”是相对于探测层面内现有的单个图像而言的。单个图像的各个面区域当然仍可以按照成像定理成像。因此在探测器阵列与再分配元件之间完全可以存在成像的光学器件。然而，处于探测层面内的单个图像在再分配时不是保持不变的。
[0009]术语“衍射受限”不局限于按照阿贝原理的衍射极限，而是也包括这些情况，其中理论最大值由于实际的不可实现性或限制而变小20%。单个图像在这时也具有在此称为衍射结构的结构。该结构被过采样。
[0010]这种原理实现了应用一种尺寸不与单个图像匹配的探测器阵列。探测器阵列优选在至少一个延伸上大于或小于待采集的单个图像。不同几何设计的概念既包括探测器阵列的不同延伸也包括相对于探测层面内的单个图像的延伸的高度和宽度而言纵横比不同的布置。探测器阵列的像素还可以对于所需要的分辨率是过大的。这也允许了，探测器阵列的像素布置的轮廓与探测层面内的单个图像的轮廓是不同的。最后，按照本发明，探测器阵列具有与探测层面中的单个图像不同的大小。所述方法中的再分配或显微镜中的再分配元件实现了选择探测器阵列，而不需要考虑由于单个图像和其大小形成的整体尺寸限制和像素尺寸限制。尤其是可以将探测器排用作探测器阵列。
[0011]在LSM中样本的图像通常通过以光斑扫描样本的方式由大量的单个图像形成，所述单个图像分别对应于不同的扫描位置。
[0012]按照本发明的方案也能以并行化的形式对于多个光斑同时进行，如对于激光扫描显微镜已知的那样。由此多个光斑在样本上扫描式地被探测，并且多个光斑的单个图像静止地并排处于探测层面内。它们随即由面积上大小对应的共同的再分配元件或者由多个单个再分配元件进行再分配并且随即被引到相应更大的单独的或者多个单个探测器阵列上。
[0013]以下示例性地重点描述以一个单独点光斑进行的扫描。然而这不应理解为限制，并且所阐述的特征和原理实质上也适用于多个点光斑的并行扫描并且也适用于应用线光斑的情况。后者当然只是横向于线延伸地受到衍射限制，因此本说明书的与之相关的特征只适用于一个方向(横向于线延伸)。
[0014]通过按照本发明的方式，可以在令人满意的速度下并且以可忍受的设备耗费实施ISM方法。本发明为高分辨率显微术原理开启了广阔的、迄今未形成的应用领域。
[0015]实现再分配或再分配元件的可能性在于，使用由光导纤维组成的束。所述光导纤维优选可以设计为多模式的光导纤维。所述束具有入口，其布置在探测层面内并且在其轮廓中满足衍射受限的单个图像在探测层面内的延伸。而光导纤维在出口处以由探测器阵列预先给出的几何布局布置，并且这种布局与入口的布局不同。在此，光导纤维的出口侧端部可以直接导引到探测器阵列的像素上。特别有利的是，将束的出口联合在插头中，所述插头可以方便地插在探测器排、例如Aro或PMT排上。
[0016]对于理解本发明重要的是，区分探测器阵列的像素和探测层面内的单个图像的用以被分辨的图像像素。每个图像像素通常正好对应于一个探测器阵列像素，但是两者在其布局方面是不同的。本发明的主要特征在于，在探测层面内记录在其尺寸和布局方面引起单个图像的过采样的图像像素的射线。以此方式分辨单个图像的结构，其由于单个图像的衍射受限的产生而是衍射结构。再分配元件具有入口侧，该图像像素设置在入口侧。入口侧处于探测层面内。再分配元件将每个图像像素上的射线导引至探测器阵列的像素之一。图像像素与探测器阵列的像素的对应并不保持图像结构，因此再分配相对于单个图像而言是不成像的。本发明的特征也可以在于，在按照本发明所述类型的显微镜中，探测器装置具有不成像的再分配元件，其具有处于探测层面内的入口侧，在所述入口侧以图像像素记录射线。再分配元件还有出口侧，在出口侧将在图像像素处