本发明涉及检测来自受试者的样品中丙型肝炎病毒（hcv）的核心多肽的方法，所述方法包括（a）使所述样品与碱并与包含阳离子去污剂的表面活性剂接触，和（b）检测所述样品中所述hcv的核心多肽。本发明进一步涉及预处理来自受试者的样品以用于检测hcv的方法，包括使所述样品与碱并与包含阳离子去污剂的表面活性剂接触；且涉及用于检测样品中hcv的预处理试剂，包含碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂，其中所述表面活性剂进一步包含非离子型去污剂。此外，本发明进一步涉及与本发明方法有关的试剂盒、用途和设备。
相关技术
丙型肝炎病毒（hcv）是黄病毒科（flaviviridae）丙型肝炎病毒属（hepacivirus）的小的有包膜病毒，包含+-链单链rna作为基因组。在hcv颗粒中，核心蛋白与rna基因组缔合，形成衣壳样结构，其被包含病毒糖蛋白e1和e2的膜包围。hcv包括至少六种或七种基因型，并被鉴定为也称为非甲非乙型肝炎的丙型肝炎的病原体。
hcv感染的诊断通常在血液衍生的样品中进行，一般免疫学检测病毒核心蛋白或检测抗-hcv抗体或两者，或通过pcr检测病毒基因组。用于检测hcv并且特别是用于检测hcv核心多肽的免疫测定中的通常重要的方面是提供高度灵敏且高度特异性的测试，其在感染后的所有阶段可靠地检测感染的样品，同时错误结果例如假阳性的数目应保持尽可能小。此外，对干扰的敏感性也是不期望的，这是因为这经常导致不清楚或错误的结果，这使得进一步昂贵且耗时的调查成为必要。本领域中使用的免疫学方法包括在有去污剂和/或离液剂的情况下的酸性或中性处理的各种组合（ep0967484a1、ep1020727a1、ep1691198a1），或在碱性ph用离液剂处理样品或从其沉淀的病毒（jp1999178174a；ep2327987a2；tanaka等人（1995)，jhepatol23：742），旨在分解病毒颗粒以增加测定的灵敏度。出于相同目的，还使用高盐浓度（ep1083428a2）。然而，酸处理引起可逆变性，这可以允许病毒颗粒的至少部分重装配。此外，来自血液样品的潜在混杂的免疫球蛋白也可能复性，并因此不能有效地除去。
要解决的问题
因此，本发明的目的是提供用于检测hcv的改进的手段和方法，其至少部分地避免了现有技术的缺点，特别是在增加特异性和/或降低对干扰的敏感性方面。
发明概述
通过具有独立权利要求的特征的本发明的手段和方法解决了该问题。在从属权利要求中列出了可以以孤立方式或以任何任意组合实现的优选实施方案。
因此，本发明涉及检测来自受试者的样品中丙型肝炎病毒（hcv）的核心多肽的方法，所述方法包括：
（a）使所述样品与碱并与包含阳离子去污剂的表面活性剂接触，和
（b）检测所述样品中所述hcv的核心多肽。
如下文所使用的，术语“具有”、“包含”或“包括”或其任何任意语法变化形式以非排他的方式使用。因此，这些术语既可以指除了由这些术语引入的特征之外在该上下文中描述的实体中不存在另外的特征的情况，又可以指其中存在一个或多个另外的特征的情况。作为示例，措辞“a具有b”、“a包含b”和“a包括b”可以既指除了b之外，a中不存在其他要素的情况（即，a完全且排他地由b组成的情况），又指除了b之外，在实体a中存在一个或多个另外的要素的情况，例如要素c、要素c和d或甚至另外的要素。
此外，如下文所使用的，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似的术语与任选的特征一起使用，不限制进一步的可能性。因此，由这些术语引入的特征是任选的特征，并不是用来以任何方式限制权利要求的范围。如本领域技术人员将认识到的，本发明可以通过使用可替换的特征来执行。类似地，由“在本发明的实施方案中”或类似措辞引入的特征被确定为任选的特征，对本发明另外的实施方案没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对将以这种方式引入的特征与本发明的其他任选或非任选特征相组合的可能性没有任何限制。此外，如果没有另外说明，术语“约”涉及在相关领域中具有普遍接受的技术精确度的指示值，在一个实施方案中涉及指示值±20％。
在一个实施方案中，本发明的用于检测hcv的核心多肽的方法是体外方法。此外，它可以包括除了上面明确提到的那些之外的步骤。例如，进一步的步骤可以涉及例如获得步骤a）的样品，或者在步骤b）中计算测量值或校正的测量值。此外，所述步骤中的一个或多个可以由自动化设备执行。
因此，在一个实施方案中，用于检测hcv的核心多肽的方法包括以下步骤：
（a）使样品与碱接触，从而产生允许样品与所述碱相互作用的反应混合物，
（b）使所述样品与阳离子去污剂接触，并任选中和所述反应混合物，
（c）添加至少两种特异性结合所述核心多肽的结合化合物，所述至少两种结合化合物的至少一种是捕获化合物，并且所述至少两种结合化合物的至少一种是检测化合物（detectorcompound），
（d）通过将所述反应混合物与所述结合化合物混合形成免疫反应混合物，
（e）维持所述免疫反应混合物一段时间，该时间足以允许所述样品中存在的所述核心多肽与所述至少两种结合化合物发生免疫反应以形成免疫反应产物，和
（f）检测任何所述免疫反应产物的存在和/或浓度。
如本领域技术人员将理解的，检测受试者样品中病毒的核心多肽通常将指示病毒的存在。因此，在一个实施方案中，用于检测hcv的核心多肽的方法是用于检测来自受试者的样品中的hcv的方法，包括
（a）使所述样品与碱并与阳离子去污剂接触，
（b）检测所述样品中所述hcv的核心多肽，且从而，
（c）检测所述hcv。
在一个实施方案中，在前述方法中，通过非尺寸区别的（non-sizediscriminatory）检测方法检测核心多肽，即，在一个实施方案中，检测所述核心多肽的特征而不检测检测到的分析物的分子量的方法。因此，在一个实施方案中，前述方法包括夹心免疫测定，特别是双抗体夹心免疫测定，例如，夹心elisa或夹心eclia。
技术人员理解术语“病毒”。术语“丙型肝炎病毒”或“hcv”涉及本领域技术人员也已知的丙型肝炎病毒属的成员。在一个实施方案中，hcv是smith等人（2014)，hepatology59（1）：318中描述的hcv之一。在进一步的实施方案中，hcv是hcv基因型1，特别是具有genbankaccno.：nc_004102.1gi：22129792中详细说明的基因组；hcv基因型2，特别是具有genbankaccno.：nc_009823.1gi：157781212中详细说明的基因组；hcv基因型3，特别是具有genbankaccno.：nc_009824.1gi：157781216中详细说明的基因组；hcv基因型4，特别是具有genbankaccno.：nc_009825.1gi：157781208中详细说明的基因组；hcv基因型5，特别是具有genbankaccno.：nc009826.1gi：157781210中详细说明的基因组；hcv基因型6，特别是具有genbankaccno.：nc_009827.1gi：157781214中详细说明的基因组，或hcv基因型7，特别是基因型7a，特别是具有genbankaccno.：ef108306.2gi：763907344中详细说明的基因组。在进一步的实施方案中，hcv是hcv基因型1，特别是具有genbankaccno.：nc_004102.1gi：22129792中详细说明的基因组。
本领域技术人员理解，在本发明方法的上下文中使用的术语“接触”。在一个实施方案中，该术语涉及使本发明的化合物，特别是碱，与样品或与另外的化合物物理接触，并从而允许所述化合物和所述另外的化合物相互作用。在一个实施方案中，术语“使样品与碱接触”涉及使如本文所详细说明的样品与碱接触，即，使样品或用稀释剂稀释的样品与碱接触，其中所述稀释剂不包含如本文所详细说明的碱。因此，在一个实施方案中，通过离心从样品获得沉淀，任选地之前是沉淀步骤，并使所述沉淀与碱接触，不是根据本发明的使样品与碱接触。如本文所用的，术语“反应混合物”涉及使第一化合物与第二化合物例如碱与样品接触的任何混合物，从而允许所述第一和第二化合物反应。
如本文所用的，术语“碱”涉及诱导水溶液中ph增加的化合物。在一个实施方案中，碱是brønsted–lowry碱。在进一步的实施方案中，碱是在水溶液中包含或产生氢氧离子的化合物。在进一步的实施方案中，碱是碱金属氢氧化物，例如，lioh、naoh、koh或rboh；或碱土金属氢氧化物，例如，be(oh)2、mg(oh)2或ca(oh)2。在另一个实施方案中，碱的pkb值至多为4，在一个实施方案中至多为3，在进一步的实施方案中至多为2。在进一步的实施方案中，碱是氢氧化钠或氢氧化钾，特别是氢氧化钾。
在一个实施方案中，使样品与碱接触包括将所述样品在至少10.5的ph温育，在进一步的实施方案中在至少11.6的ph，在进一步的实施方案中在至少11.75的ph，在一个实施方案中至少11.9，在进一步的实施方案中至少12，在进一步的实施方案中至少12.1。如本领域技术人员将理解的，在强碱性ph长时间的温育可引起多肽水解，包括核心多肽。因此，在一个实施方案中，将样品在至多14的ph温育，在进一步的实施方案中至多13.2，在进一步的实施方案中至多13。在另一个实施方案中，将样品在11.75至12.75的ph温育，在一个实施方案中为11.9至12.6，在进一步的实施方案中为12至12.5。在一个实施方案中，根据dineniso10523（2012年4月）测定水溶液的ph。在进一步的实施方案中，使样品与碱接触是使样品与具有如上所示的ph的缓冲液接触，在一个实施方案中为包含具有至少一个在如上所示的ph的pkb的缓冲化合物的缓冲液。
在一个实施方案中，使样品与碱接触包括使所述样品与碱溶液接触，在一个实施方案中为碱的水溶液，其中所述溶液中所述碱的浓度为0.1mol/l至1mol/l，在一个实施方案中为0.15mol/l至0.5mol/l，在一个实施方案中为0.2mol/l至0.3mol/l，在一个实施方案中为约0.25mol/l，在一个实施方案中为0.25mol/l。在一个实施方案中，在这种情况下，样品和碱溶液以约2:1（样品:碱溶液）的比例混合，在进一步的实施方案中，以2:1（样品:碱溶液）的比例。因此，在一个实施方案中，使样品与碱接触包括将所述碱添加到所述样品中，直到最终浓度为0.05mol/l至0.17mol/l，在一个实施方案中为0.07mol/l至0.09mol/l。
在一个实施方案中，使样品与碱接触包括在有碱的情况下将样品温育至少5分钟，在进一步的实施方案中至少9分钟。如本领域技术人员将理解的，在强碱性ph长时间的温育可引起多肽水解，包括核心多肽。因此，在一个实施方案中，将样品在有碱的情况下温育少于2小时，在一个实施方案中少于1小时，在进一步的实施方案中少于30分钟。因此，在一个实施方案中，将样品在有碱的情况下温育5分钟至60分钟，在一个实施方案中为6分钟至20分钟，在进一步的实施方案中为9分钟至15分钟。
因此，在一个实施方案中，使样品与碱接触包括将样品在11.75至12.75的ph温育5分钟至60分钟，在一个实施方案中为6分钟至20分钟，在进一步的实施方案中为9分钟到15分钟。在另一个实施方案中，使样品与碱接触包括将样品在ph11.9至12.6温育5分钟至60分钟，在一个实施方案中为6分钟至20分钟，在进一步的实施方案中为7分钟至15分钟。在进一步的实施方案中，使样品与碱接触包括将样品在12至12.5的ph温育5分钟至60分钟，在一个实施方案中为6分钟至20分钟，在进一步的实施方案中为9分钟至15分钟。
本发明的用于检测核心多肽的方法进一步包括，在一个实施方案中，在使所述样品与碱接触之前、之后和/或同时使样品与表面活性剂接触。在一个实施方案中，使样品与所述碱并与所述表面活性剂同时接触。如本领域技术人员将理解的，在一个实施方案中，术语“同时接触”涉及一种方法，其中样品与碱并与表面活性剂以这样的方式接触，从而使得样品、碱和表面活性剂至少在如本文其他地方详细说明的用碱处理样品的时间存在于共同的溶液中。因此，同时处理应包括碱处理后碱被中和并且形式上不再存在的情况。如本文所用的，术语“表面活性剂”涉及具有两亲性质并降低包含它们的液体的表面张力的化合物或化合物的混合物。如本文所用的，术语“去污剂”以广义使用，并涉及具有表面活性剂性质的化合物或混合物。在一个实施方案中，表面活性剂包含阳离子去污剂。阳离子去污剂是本领域已知的，且包括但不限于季铵去污剂。在一个实施方案中，阳离子去污剂是十六碳烷基-三甲铵盐，在一个实施方案中是氯化十六碳烷基-三甲铵（htac，cas编号112-02-7）。在进一步的实施方案中，表面活性剂进一步包含非离子型去污剂，即，表面活性剂是阳离子和非离子型去污剂的混合物。在一个实施方案中，非离子型去污剂是烷基糖苷，在进一步的实施方案中是正烷基糖苷，在进一步的实施方案中是辛基糖苷（正辛基-β-d-葡糖苷，cas编号29836-26-8）。在一个实施方案中，表面活性剂由所述阳离子去污剂和所述非离子型去污剂组成。
在一个实施方案中，使样品与碱接触包括在10℃至50℃的温度温育所述样品，在一个实施方案中为20℃至45℃，在进一步的实施方案中为30℃至40℃，在进一步的实施方案中在37±3℃的温度。
如将理解的，特别取决于所用的结合化合物的特性，在使碱处理的样品与结合化合物接触之前中和碱可能是有利的。因此，在一个实施方案中，该方法包括在步骤b）中检测核心多肽之前中和碱的进一步的步骤。然而，中和也可能是不必要的，例如，在碱处理的样品在碱处理后强有力地稀释的情况下和/或在使用的结合化合物对碱性条件不敏感的情况下。在一个实施方案中，将样品中和至ph为7±2，在一个实施方案中，至ph为7±1.5，在进一步的实施方案中，至ph为7±1。技术人员知道用于中和水溶液中的碱的合适方法。在一个实施方案中，通过添加在适当ph缓冲的缓冲化合物来实现中和，在一个实施方案中，通过向两份样品/碱混合物添加至少一份0.2mol/l缓冲液，在进一步的实施方案中为0.2mol/l磷酸盐缓冲液，在进一步的在实施方案中为0.2mol/l磷酸钾缓冲液。在一个实施方案中，前述0.2mol/l缓冲液的ph为5.5至7.5，在进一步的实施方案中为6至7，在进一步的实施方案中为约6.5，在进一步的实施方案中为6.3至6.5。在一个实施方案中，在样品与本发明的结合化合物接触之前进行中和。在进一步的实施方案中，本发明的结合化合物包含在用于中和的中和溶液中，即，在使所述hcv与结合多肽接触时进行中和。
在一个实施方案中，在用碱处理所述样品之前，不从样品除去样品中存在的多肽。在一个实施方案中，在碱处理后，特别是在中和碱后，不从样品除去变性的多肽。在进一步的实施方案中，变性的多肽不通过添加离液剂而增溶。然而，本发明设想在碱处理之后或期间添加温和的表面活性剂，在一个实施方案中，添加包含一种或多种本文其他地方详细说明的去污剂的表面活性剂。
如本文所用的，术语“检测”是指定性或定量检测待在样品中检测的hcv核心多肽的至少一个特征，在一个实施方案中，免疫学特征。在一个实施方案中，根据本发明的特征是核心多肽的结构特征，其促进样品中核心多肽的检测，例如通过特异性结合所述特征的结合化合物。在一个实施方案中，所述特征促进通过免疫学方法鉴定核心多肽，在进一步的实施方案中为定量。一般的可用特征是促进所述核心多肽与样品中存在的其他化合物区别开的特征。在一个实施方案中，检测核心多肽是确定核心多肽是否以高于所述方法的检出限的滴度存在于样品中或不存在于样品中。确立给定方法的检出限的方法是本领域技术人员已知的，且包括，例如，稀释滴定实验。在进一步的实施方案中，检测是半定量或定量检测样品中核心多肽或hcv的量或滴度。对于定量检测，将检测核心多肽或hcv的绝对或精确量，或将检测核心多肽或hcv的相对量。在可以或应该不检测精确量的情况下，可以检测相对量。在所述情况下，可以检测核心多肽或hcv存在的量相对于第二样品是增加还是减少，所述第二样品包含第二种量的所述核心多肽或hcv，在一个实施方案中为预先确定的量。
如本领域技术人员将理解的，检测核心多肽的方法将取决于所选择的测定形式。在一个实施方案中，该测定是夹心测定，其中分析物，例如，hcv、其壳粒或其核心多肽与结合于固体表面的捕获化合物结合，并且其中捕获的分析物的量通过如下文所详细说明的检测化合物与所述捕获的分析物的结合来检测。在一个实施方案中，捕获和/或检测化合物是抗体，且夹心测定是夹心免疫测定。如本领域技术人员将理解的，在一个实施方案中，分析物的可检测特征可以不止一次存在于分析物上；在这种情况下，捕获化合物和检测化合物都可以识别所述特征；或者捕获化合物识别第一特征，并且检测化合物识别第二特征，即结构上不同的特征。然而，分析物的特定可检测特征可仅存在于分析物上一次；在这种情况下，在一个实施方案中，捕获化合物识别第一特征，并且检测化合物识别第二特征，即结构上上不同的特征。
在一个实施方案中，检测的hcv和/或核心多肽的特征是包含在所述hcv的核心多肽中的表位。在hcv的情况下，技术人员已知术语“核心多肽”涉及与病毒颗粒中的病毒rna结合的多肽；由于这个原因，核心多肽也称为“衣壳多肽”或“衣壳蛋白”，尽管hcv不形成如大多数其他病毒所知的常规衣壳结构。因此，在一个实施方案中，术语核心多肽涉及作为病毒核心的主要结构组分的多肽，其中，在一个实施方案中，核心的结构组分是形成结构上正常的核心和/或形成感染性病毒颗粒所需的组分。在进一步的实施方案中，核心多肽是以每个衣壳或衣壳样结构至少5个拷贝存在于病毒核心中的多肽，在一个实施方案中，每个衣壳或衣壳样结构至少10个拷贝。在进一步的实施方案中，hcv的核心多肽是病毒核心多肽p21或p19，特别地包含seqidno：1或2的氨基酸序列。
本发明的方法包括检测如上所详细说明的hcv的核心多肽；因此，在一个实施方案中，在所述方法中待检测的“分析物”是所述核心多肽。如本领域技术人员将理解的，该方法可以进一步包括检测其他分析物，例如，一种或多种另外的核心多肽。如本领域技术人员还将理解的，在一个实施方案中，检测作为分析物的病毒核心多肽可以包括检测所述核心多肽的寡聚体和/或可以包括检测完整的衣壳。
在一个实施方案中，检测核心多肽包括使样品与结合化合物接触。如本文所用的，术语“结合化合物”涉及与本发明的分析物结合的化学分子，在一个实施方案中，与核心多肽结合。在一个实施方案中，结合化合物是有机分子或其复合体，在进一步的实施方案中，是生物大分子，特别是多肽或其复合体。在一个实施方案中，结合化合物是抗体，特别是单克隆抗体。因此，如本文所用的，术语“免疫反应产物”涉及至少一种抗体与本发明的核心多肽，特别是hcv核心多肽之间的复合体，在一个实施方案中为特异性的复合体。在一个实施方案中，结合化合物以足够的亲和力间接或直接结合本发明的分析物，以允许检测包含分析物和结合化合物的复合体。在一个实施方案中，分析物/结合化合物复合体的解离常数（kd）为至多10-7mol/l，在进一步的实施方案中，为至多10-8mol/l，在进一步的实施方案中，为至多10-9mol/l。在一个实施方案中，结合化合物以足够的亲和力间接或直接结合本发明的核心多肽，以允许检测包含核心多肽和结合化合物的复合体。在一个实施方案中，结合化合物是特异性结合本发明的分析物，特别是核心多肽的化合物。在一个实施方案中，结合化合物特异性结合（i）碱处理的核心多肽或（ii）碱处理的核心多肽和非碱处理的核心多肽；因此，在一个实施方案中，结合化合物结合核心多肽的表位，所述核心多肽的表位未经如本文其他地方所详细说明的碱处理而变性。在进一步的实施方案中，结合化合物结合邻接的（线性）表位，即，由分析物例如核心多肽的氨基酸序列中邻接的氨基酸形成的表位。因此，在一个实施方案中，结合化合物是不结合分析物的构象表位的结合化合物。在一个实施方案中，特异性结合（i）碱处理的核心多肽或（ii）碱处理的核心多肽和非碱处理的核心多肽的结合化合物是通过下文所述方法鉴定的结合化合物。在一个实施方案中，至少一种结合化合物结合对应于hcv核心蛋白的氨基酸157-169的表位，在一个实施方案中，对应于seqidno：1的氨基酸157-169。在进一步的实施方案中，至少一种结合化合物结合对应于hcv核心蛋白的氨基酸102-112的表位，在一个实施方案中，对应于seqidno：1的氨基酸102-112。在一个实施方案中，至少一种结合化合物结合对应于hcv核心蛋白的氨基酸157-169的表位，在一个实施方案中，对应于seqidno：1的氨基酸157-169，并且至少一种另外的结合化合物结合对应于hcv核心蛋白的氨基酸102-112的表位，在一个实施方案中，对应于seqidno：1的氨基酸102-112。
如本领域技术人员将理解的，术语“特异性结合”或其语法变化形式用于表明样品中存在的其他化合物（一般为生物分子）不显著结合本发明的配体，特别是结合化合物；在一个实施方案中，这不排除化合物，例如，干扰化合物，与不参与与分析物相互作用的结合化合物区域的结合。在一个实施方案中，结合化合物与除分析物之外的化合物的结合水平导致的结合亲和力分别为对分析物的亲和力的至多10％或更低、5％或更低、2％或更低或1％或更低。
在一个实施方案中，检测核心多肽包括借助于捕获化合物将核心多肽捕获到固体表面。如本文所用的，术语“捕获化合物”涉及附着或适合于附着于如本文其他地方所详细说明的固体表面的结合化合物。如本领域技术人员将理解的，捕获化合物可在将所述捕获化合物与样品接触之前、同时或之后附着于固体表面。在一个实施方案中，捕获化合物与使所述捕获化合物与样品接触同时附着于固体表面，例如，通过混合所述样品、所述捕获化合物和所述固体表面，在这种情况下所述固体表面可以是珠的形式。如本领域技术人员将理解的，使固体表面结合的捕获化合物与样品接触允许特异性地将由所述捕获化合物结合的分析物（如果存在的话）与包含在所述样品中的其他化合物分离。将结合化合物（例如，生物分子，一般是多肽）附着到固体表面的方法是本领域众所周知的，且包括，例如，通过疏水作用的结合、通过固定化的链霉抗生物素蛋白的生物素化和结合、共价结合、抗体-抗原相互作用等，或这些相互作用的组合。在一个实施方案中，捕获化合物也可以是捕获复合体。在一个实施方案中，捕获化合物是抗体。在进一步的实施方案中，捕获化合物是单克隆抗体。在另一个实施方案中，捕获化合物是抗体，即，捕获抗体，特别是单克隆抗体。在一个实施方案中，捕获抗体与生物素共价偶联。
在一个实施方案中，检测核心多肽包括使所述核心多肽与检测化合物接触。如本文所用的，术语“检测化合物”涉及与如本文其他地方所详细说明的指示剂键合的结合化合物。在一个实施方案中，检测化合物不与固体表面结合并且不适合于与固体表面结合。在一个实施方案中，检测化合物是直接结合本发明分析物的化合物，在一个实施方案中，直接结合核心多肽。在一个实施方案中，检测化合物也可以是检测复合体。技术人员知道如何将结合化合物或结合复合体与指示剂键合，这取决于所选择的指示剂。在一个实施方案中，检测化合物中的结合剂和指示剂之间的键是共价键。在一个实施方案中，检测化合物是抗体，即，检测抗体。在进一步的实施方案中，检测化合物是单克隆抗体。在另一个实施方案中，检测化合物是抗体，特别是单克隆抗体，其与包含钌离子的络合物共价偶联，例如，三(2,2'-联吡啶)钌(ii)-络合物。
在一个实施方案中，捕获化合物的结合化合物和检测化合物的结合化合物是不相同的。在一个实施方案中，至少一种捕获化合物或结合化合物结合对应于hcv核心蛋白的氨基酸157-169的表位，在一个实施方案中，对应于seqidno：1的氨基酸157-169。在进一步的实施方案中，至少一种检测化合物或结合化合物结合对应于hcv核心蛋白的氨基酸102-112的表位，在一个实施方案中，对应于seqidno：1的氨基酸102-112。在一个实施方案中，至少一种捕获化合物结合对应于hcv核心蛋白的氨基酸157-169的表位，在一个实施方案中，对应于seqidno：1的氨基酸157-169。在进一步的实施方案中，至少一种检测化合物结合对应于hcv核心蛋白的氨基酸102-112的表位，在一个实施方案中，对应于seqidno：1的氨基酸102-112。在一个实施方案中，至少一种捕获化合物结合对应于hcv核心蛋白的氨基酸157-169的表位，在一个实施方案中，对应于seqidno：1的氨基酸157-169，并且至少一种检测化合物结合对应于hcv核心蛋白的氨基酸102-112的表位，在一个实施方案中，对应于seqidno：1的氨基酸102-112。
如本文所用的，术语“指示剂”涉及适合于使包含所述指示剂的分子或复合体的存在可检测的化合物。一般，指示剂具有可检测的性质，一般是光学或/和酶性质。然而，还设想所述可检测性质是发射放射性的性质。
如本文所用的，术语“光学性质”涉及可由光学仪器检测的任何性质。具体地，光学可测定的性质可以是或可以包括选自下述的至少一种性质：反射性质、透射性质、发射性质、散射性质、荧光性质、磷光性质、衍射性质和偏振性质。本发明设想的进一步的光学性质是颜色、荧光、发光或折射。在一个实施方案中，本文提及的光学可测定的性质是指可以光学检测的化合物的性质，例如光吸收、光发射、光漫反射（lightremission）或与其相关的性质。将理解的是，检测本文所用的光学可测定的性质包括检测之前不可检测的性质的存在，检测之前已经检测的性质的不存在，以及检测性质的定量变化，即，检测与至少一种光学性质的变化程度有关的信号强度的变化。当然，在一个实施方案中，术语“光学可测定的性质”还涉及电化学发光，其也称为电致化学发光。
如本文所用的，术语“酶性质”涉及通过生物催化从底物产生可检测的产物的指示剂的性质。因此，一般通过在所述指示剂中存在具有所述酶性质的多肽来赋予酶性质。一般，酶性质是至少一种选自下述的酶活性：磷酸酶活性（例如，在碱性磷酸酶中）、过氧化物酶活性（例如，在辣根过氧化物酶中）和糖苷酶活性（例如，在β-半乳糖苷酶中）。用于酶活性的一般底物是本领域众所周知的。一般，所述酶活性产生具有如上文所详细说明的可测定的光学性质的产物，或/和所述酶活性产生可由电子仪器测定的产物。
如本文所用的，术语“固体表面”涉及适合于结合本发明的捕获化合物并适合于例如通过物理方法从样品分离的任何合适的固体表面。在一个实施方案中，所述固体表面是珠的表面，在一个实施方案中，是微珠（microbead），例如，磁性或顺磁性微珠。在一个实施方案中，所述表面适合于改善捕获化合物的结合，例如，通过共价或非共价附着结合捕获化合物的亚结构的分子。结合捕获化合物的亚结构的一般分子是，例如，抗体、链霉抗生物素蛋白、络合的镍离子等。在进一步的实施方案中，固体表面通过共价键和/或非共价键结合所述捕获化合物，例如，通过疏水作用。因此，在一个实施方案中，所述固体表面是多簇板（multi-clusterplate）的表面。在一个实施方案中，预处理多簇板的表面以增加捕获化合物结合的亲和力和/或能力。合适的预处理是本领域已知的。
如本文所用的，术语“样品”涉及怀疑包含本发明的hcv或其组成部分的样品。在一个实施方案中，样品是怀疑包含本发明的核心多肽，特别是hcv核心多肽的样品。在一个实施方案中，样品是或包括体液样品、来自组织或器官的样品或洗涤/冲洗液样品或从外体表面或内体表面获得的拭子或涂片。在一个实施方案中，作为本发明的方法的样品包括粪便、尿、唾液、脑脊液、血液、血清、血浆或泪液的样品。样品可以通过使用刷子、（棉花）拭子、压舌板、冲洗/洗涤液、钻取活组织检查设备、用针或小刀的腔穿刺或通过外科手术器械操作获得。然而，通过众所周知的技术获得的样品，在一个实施方案中包括来自泌尿生殖道、肛周区、肛管、口腔、上呼吸消化道（upperaerodigestivetract）和表皮的刮擦（scrapes）、拭子或活组织检查，也包括在内作为本发明的样品。无细胞液可通过溶解技术（例如匀浆）和/或通过分离技术（例如过滤或离心）从体液或组织或器官获得。在一个实施方案中，样品获自已知包含本发明的hcv和/或hcv核心多肽的体液，即，在一个实施方案中，血液、血浆、血清、唾液等。将理解的是，可以进一步处理样品以实施本发明的方法。特别地，可以通过本领域已知的方法和手段从样品中除去细胞。在一个实施方案中，样品是包含免疫球蛋白的样品，在一个实施方案中，是血液、血清或血浆样品，在进一步的实施方案中，是血清或血浆样品。
如本文所用的，术语“受试者”涉及动物，在一个实施方案中是哺乳动物，在进一步的实施方案中是灵长类动物，在进一步的实施方案中是人。在一个实施方案中，根据本发明的受试者是怀疑感染hcv的受试者；因此，在一个实施方案中，受试者是显示至少一种（在进一步的实施方案中，至少两种）如本领域技术人员已知且如本文其他地方所详细说明的hcv感染的症状的受试者。然而，还设想受试者是被诊断为感染hcv的受试者的性伴侣、家属（familymember）、家庭成员（householdmember）、工友、游伴（playfellow）和/或监护人。
如本文所用的，术语“抗体”包括单克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体（例如，双特异性抗体）和抗体片段，只要它们表现出如本文其他地方所详细说明的所期望的结合活性即可。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体是全长抗体或抗体片段。
依赖其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体（免疫球蛋白）分配到不同的类别。存在五种主要类别的免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，且这些中的几种可以进一步分为亚类（同种型），例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的，并且通常描述于例如abbas等人，cellularandmol.immunology，第4版，w.b.saunders,co.（2000）。抗体可以是通过抗体与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成的较大融合分子的一部分。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指基本上完整形式的抗体，而不是如下文定义的抗体片段。该术语特别指具有含有fc区的重链的抗体。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，在一个实施方案中，包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，纳米抗体（nanobodies）和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，每个片段具有单个抗原结合部位，和残留的“fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生f(ab')2片段，其具有两个抗原结合部位（antigen-combiningsites）并且仍然能够交联抗原。“fv”是含有完整抗原结合部位的最小抗体片段。在一个实施方案中，两链fv种类（two-chainfvspecies）由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链fv（scfv）种类中，一个重链和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，从而使得轻链和重链可以以类似于两链fv种类中的那种的“二聚体”结构缔合。在这种构型中，每个可变结构域的三个高变区（hvrs）相互作用以限定抗原结合部位。总共六个hvrs赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域（或仅包含三个对抗原特异的hvrs的fv的一半）也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合部位。术语“双抗体”是指具有两个抗原结合部位的抗体片段，该片段包含在同一多肽链（vh-vl）中与轻链可变结构域（vl）连接的重链可变结构域（vh）。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，该结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更充分地描述于，例如，ep0404097；wo1993/01161；hudson等人，nat.med.9（2003）129-134；和hollinger等人，pnasusa90（1993）6444-6448。三链抗体和四链抗体（tetrabodies）也在hudson等人，nat.med.9（2003）129-134中描述。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能突变例如天然存在的突变之外，群体中包括的个别抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，这种单克隆抗体一般包括包含结合分析物的多肽序列的抗体，其中分析物结合多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个分析物结合多肽序列的方法获得。例如，选择过程可以是从多个克隆中选择独特的克隆，例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组dna克隆的库。应当理解，可以进一步改变选择的靶结合序列，例如，以提高对靶的亲和力、使靶结合序列人源化、改善其在细胞培养中的产生、降低其在体内的免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体制剂是有利的，因为它们一般不被其他免疫球蛋白污染。
抗体或其片段可以通过使用例如在harlow和lane“antibodies,alaboratorymanual”，cshpress，coldspringharbor，1988中描述的方法获得。单克隆抗体可以通过最初在köhler和milstein，nature256（1975），495和galfré，meth.enzymol.73（1981），3中描述的技术制备，其包括小鼠骨髓瘤细胞与源自免疫接种的哺乳动物的脾细胞的融合。
在一个实施方案中，本发明的用于检测核心多肽的方法进一步包括使所述样品与另外的化合物接触。可以与碱同时用于处理的另外的化合物可以包括但不限于碱金属卤化物，在一个实施方案中，碱金属氯化物，特别是氯化钾，在一个实施方案中，浓度为0.1mol/l至1mol/l，在一个实施方案中，为0.2mol/至0.5mol/l，在进一步的实施方案中为约0.375mol/l，在进一步的实施方案中为0.375mol/l：此外，在一个实施方案中，本发明的用于检测核心多肽的方法进一步包括在用碱处理后使所述样品与通常用于检测测定的另外的化合物接触，特别是免疫学测定，如缓冲液，例如，磷酸钾缓冲液，另外的去污剂，包括阴离子、非离子型和/或两性离子去污剂，防腐剂，多肽或其混合物，例如，牛血清清蛋白、免疫球蛋白等。
在一个实施方案中，本发明的用于检测核心多肽的方法不包括使样品与巯基化合物接触。在进一步的实施方案中，本发明的用于检测核心多肽的方法不包括使样品与还原剂接触。如本文所用的，术语“巯基化合物”涉及包含至少一个-sh基团的化合物，在一个实施方案中为有机化合物，如例如，二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、β-巯基乙胺（β-mercaptoethanamine）、β-巯基乙烷磺酸等。本领域技术人员理解术语“还原剂”。在一个实施方案中，该术语涉及还原多肽的-s-s-基团的试剂。
在进一步的实施方案中，本发明的用于检测核心多肽的方法不包括使样品与离液剂如尿素接触。如本文所用的术语“离液剂”涉及破坏大分子，特别是多肽的三级结构的化合物。在一个实施方案中，根据本发明，阳离子去污剂和非离子型去污剂不是离液剂。
有利地，在构成本发明基础的工作中发现，与大多数其他多肽相反，hcv核心多肽，特别是hcv核心多肽，即使在强碱处理后也保持可溶。因此，发现碱预处理降低了干扰化合物的信号，从而通过消除假阳性结果改善了hcv抗原测定的特异性。
以上所作的定义经适当修改后适用于下文。下文进一步作出的另外的定义和解释经适当修改后也适用于本说明书中所描述的所有实施方案。
本发明进一步涉及预处理来自受试者的样品以用于检测hcv的方法，包括使所述样品与碱并与包含阳离子去污剂的表面活性剂接触。
用于预处理来自受试者的样品的方法还可以包括除了明确提到的那些之外的步骤。此外，该方法在一个实施方案中是体外方法。
本发明还涉及用于检测样品中的hcv的预处理试剂，其包含碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂，其中所述表面活性剂进一步包含非离子型去污剂。
如本文所用的，术语“预处理试剂”涉及在使所述样品与结合化合物接触之前用于预处理样品的所示组分的溶液，在一个实施方案中为水溶液。如本领域技术人员将理解的，术语“预处理”涉及检测方法，例如，本发明的诊断方法中的一般任选的工作步骤，其在实际检测步骤之前进行，且目的在于改善所述检测步骤的结果。因此，进一步的预处理步骤可以，例如，涉及使组织样品匀浆、从血液样品中除去血细胞等。
在一个实施方案中，如上文更详细地说明的，碱是碱金属或碱土金属碱，在一个实施方案中是氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂，在一个实施方案中是氢氧化钠或氢氧化钾，在进一步的实施方案中是氢氧化钾。同样在一个实施方案中，预处理试剂中碱的浓度为0.1mol/l至1mol/l，在一个实施方案中为0.15mol/l至0.5mol/l，在一个实施方案中为0.2mol/l至0.3mol/l，在一个实施方案中为约0.25mol/l，在一个实施方案中为0.25mol/l。其中包含的表面活性剂和去污剂的实施方案已在上文中描述。在一个实施方案中，预处理试剂包含浓度为1.3％（w/v）至2％（w/v）的阳离子去污剂，和浓度为至少0.25％（w/v）的所述非离子型去污剂，在一个实施方案中为0.25％（w/v）至2.5％，在进一步的实施方案中为0.3％（w/v）至1.5％（w/v）。在一个实施方案中，预处理试剂是三倍浓缩的试剂，即，1份预处理试剂用2份非预处理试剂稀释，例如，在一个实施方案中，用2份样品稀释，其中所述样品可以用合适的稀释剂稀释，或者在进一步的实施方案中，是未稀释的样品。在一个实施方案中，预处理试剂不包含如本文其他地方所详细说明的包含巯基（-sh）基团的化合物，在一个实施方案中，不包含还原剂。在一个实施方案中，预处理试剂包含碱金属卤化物，在一个实施方案中是碱金属氯化物，特别是氯化钾。在一个实施方案中，所述碱金属卤化物以0.5mol/l至2mol/l的浓度包含在预处理试剂中，在一个实施方案中为1mol/l至1.5mol/l，在进一步的实施方案中为约1.125mol/l，在进一步的实施方案中为1.125mol/l。
本发明还涉及用于检测样品中hcv的试剂盒，其包含碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂，其中所述表面活性剂进一步包含非离子型去污剂。
如本文所用的，术语“试剂盒”是指本发明的前述化合物、工具或试剂的集合，其可以包装在一起或可以不包装在一起。试剂盒的组分可以由单独的小瓶包含（即，作为单独部分的试剂盒），或者，特别是结合剂，可以在单个小瓶中提供两种或更多种组分。此外，要理解的是，在一个实施方案中，本发明的试剂盒将用于实施本文上文提到的方法。在一个实施方案中，设想所有组分以随时可用的方式提供，以用于实践上文提及的方法。此外，在一个实施方案中，试剂盒含有用于实施所述方法的说明书。说明书可以由纸质或电子形式的用户手册提供。此外，手册可以包括用于解释在使用本发明的试剂盒执行上述方法时获得的结果的说明书。试剂盒包含表面活性剂，在一个实施方案中为本文所详细说明的表面活性剂，特别是包含阳离子去污剂和非离子型去污剂的表面活性剂。在一个实施方案中，碱和表面活性剂包含在相同的容器中，在进一步的实施方案中包含在相同的溶液中。在进一步的实施方案中，试剂盒中包含的碱包含在如上文所详细说明的预处理试剂中。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少两种结合化合物，其中至少一种结合化合物是捕获化合物，并且其中至少一种结合化合物是检测化合物。在一个实施方案中，试剂盒中包含的至少一种捕获化合物包含生物素标记。在另一个实施方案中，试剂盒中包含的至少一种检测化合物包含钌标记。同样在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含中和工具，例如，缓冲液。
此外，本发明涉及包含碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂的组合物用于预处理受试者的样品以用于检测hcv的免疫测定的用途；且本发明涉及包含碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂的组合物用于通过免疫测定检测受试者样品中的hcv的用途。
如本文其他地方所详细说明的，在一个实施方案中，所述用途不包括还原剂和/或离液剂用于预处理样品或用于检测hcv的用途。
此外，本发明还涉及用于检测样品中hcv的核心多肽的分析设备，其包括具有样品处理单元的分析单元，所述分析单元适合于执行以下步骤：
（a）使施加到所述样品处理单元的样品与碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂接触，和
（b）检测所述样品中所述hcv的核心多肽。
在一个实施方案中，分析单元的样品处理单元连接到控制器单元，所述控制器单元适合于指导执行如上文所详细说明的步骤。
如本文所用的，术语“设备”涉及一种工具的系统，所述工具包括至少上述工具，它们可操作地相互连接，以允许获得检测结果。以上连同本发明的方法公开了用于使样品与碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂接触以及用于检测核心多肽的优选工具。如何以操作方式连接所述工具将取决于设备中包括的工具的类型。在一个实施方案中，由单个设备包括所述工具。
在一个实施方案中，样品处理单元包括样品的容器。容器可以直接接触样品，或者可以是接收样品的另外的工具的容器，其中另外的工具可以是例如多孔板，可以向所述多孔板施加样品或多个样品。此外，在一个实施方案中，样品处理单元包含碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂，例如，为干燥形式或在与投配工具如连接到泵的管连接的储存器中。任选地，样品处理单元可包括用于在使样品与所述碱接触后降低样品中的ph的中和工具。在一个实施方案中，样品处理单元包含至少一种检测化合物，例如，为干燥的形式或在与投配工具如连接到泵的管连接的储存器中。在进一步的实施方案中，样品处理单元包括用于混合的工具和用于调节反应混合物温度的工具。
在一个实施方案中，可以通过用户的视觉检查或通过在适当的设备上执行检测测量来获得检测的结果。在一个实施方案中，本发明的设备的分析单元进一步包括用于检测本发明的核心多肽的检测单元，在一个实施方案中，用于检测本发明的核心多肽的量。适合作为根据本发明的检测单元的工具是本领域技术人员已知的，并且包括例如，例如，光度设备。在一个实施方案中，分析设备是用于分析物的电化学检测的分析设备，并且进一步包括至少一个电极，在一个实施方案中为至少一个工作电极。如本领域技术人员将理解的，分析设备可包括附加电极，例如，对电极和/或参比电极；分析设备还可包括组合的对电极/参比电极。合适的电极实施方案是技术人员已知的。在一个实施方案中，至少工作电极包括在如上文所详细说明的设备的样品容器中或用于接收样品的另外的工具中。
在一个实施方案中，本发明的设备进一步包括连接到检测单元的数据输出单元。在一个实施方案中，数据输出单元适合于输出由检测单元获得的数据。合适的数据输出单元是本领域技术人员已知的，并且包括简单的输出单元，例如指示灯或显示器，其指示检测到高于检测阈值的核心多肽。然而，输出单元也可以是评价设备的接口，其中所述接口可以是任何种类的传输数据的工具，包括，例如，诸如usb的电缆连接，诸如无线lan、蓝牙等的无线连接，或诸如通过即时消息、电子邮件等的数据传输的间接连接。
在一个实施方案中，本发明的设备是分析系统的一部分，所述分析系统进一步包括评价设备。如本领域技术人员将理解的，评价设备可以包括在与本发明的设备相同的外壳中，例如，作为评价单元，或者可以是单独的设备。在一个实施方案中，评价设备包括微处理器，该微处理器被编程以从本发明的设备的输出单元接收输出数据，并执行提供所述输出数据的评价的逻辑操作。输出数据的评价可以包括，例如，校正在一个或多个对照检测反应中测量的值的数据，统计学计算，例如两个或更多个并行检测反应的计算工具，校正稀释因子的数据，将输出数据与参考值进行比较，在表中编辑数据等。在一个实施方案中，评价设备进一步包括数据存储单元。在进一步的实施方案中，所述数据存储单元包括参考值，例如，在参考值数据库中。此外，在一个实施方案中，数据存储单元适合于存储从本发明的设备接收的输出数据，如上文所详细说明的。
在一个实施方案中，当应用用于自动检测所述病毒的核心多肽的工具时，由所述自动操作工具获得的数据可以通过例如计算机程序处理以确立诊断（即，鉴定感染了hcv的受试者）。连同涉及上述本发明方法的实施方案公开了用于检测的一般工具。在这种情况下，工具可操作地连接，因为系统的用户由于手册中给出的说明和解释而将量及其诊断值的测定结果汇集在一起。本领域技术人员将认识到如何在没有进一步的创造性技能的情况下连接所述工具。一般的设备是可以在没有专门的临床医生的特定知识的情况下应用的设备，例如，仅需要装载样品的测试条（teststripes）或电子设备。结果可以作为参数诊断原始数据的输出给出，优选地，作为绝对或相对量。要理解的是，这些数据将需要临床医生的解释。然而，还设想了专家系统设备，其中输出包括处理的诊断原始数据，其解释不需要专门的临床医生。设备的进一步的实施方案包括根据本发明的方法在上文提及的分析单元/设备（例如，生物传感器、阵列、与特异性识别多肽的配体偶联的固体支持物、等离振子表面共振设备、nmr光谱仪、质谱仪等）或评价单元/设备。
本发明进一步公开并提出了一种计算机程序，包括计算机可执行的指令，用于在程序在分析设备、计算机或计算机网络上执行时，执行在本文附入的一个或多个实施方案中的根据本发明的方法。具体地，计算机程序可以存储在计算机可读的数据载体上。因此，具体地，可以通过使用计算机或计算机网络，优选地通过使用计算机程序来执行如上所述的一个、多于一个或甚至所有方法步骤。
本发明进一步公开并提出了一种具有程序代码工具（programcodemeans）的计算机程序产品，以当在分析设备、计算机或计算机网络上执行程序时，执行在本文附入的一个或多个实施方案中的根据本发明的方法。具体地，程序代码工具可以存储在计算机可读的数据载体上。
此外，本发明公开并提出了一种数据载体，其上存储有数据结构，在加载到计算机或计算机网络中之后，例如加载到计算机或计算机网络的工作存储器或主存储器中之后，其可以执行根据本文公开的一个或多个实施方案的方法。
本发明还提出并公开了一种计算机程序产品，其具有存储在机器可读的载体上的程序代码工具，以当在计算机或计算机网络上执行程序时，执行根据本文公开的一个或多个实施方案的方法。如本文所用的，计算机程序产品指作为可买卖的产品的程序。产品通常可以以任意形式存在，例如以纸质形式，或者在计算机可读的数据载体上。具体地，计算机程序产品可以分布在数据网络上。
最后，本发明提出并公开了一种调制数据信号，其含有由计算机系统或计算机网络可读的指令，用于执行根据本文公开的一个或多个实施方案的方法。
在一个实施方案中，关于本发明的计算机实现的方面，可以通过使用计算机或者计算机网络执行根据本文公开的一个或多个实施方案的方法中的一个或多个方法步骤或甚至所有方法步骤。因此，通常，可以通过使用计算机或计算机网络来执行包括提供和/或操作数据的任何方法步骤。通常，这些方法步骤可以包括任何方法步骤，一般除了需要手动工作的方法步骤之外，例如提供样品和/或执行实际测量的某些方面。
具体地，本发明进一步公开了：
-包括至少一个处理器的计算机或计算机网络，其中所述处理器适合于执行根据本说明书中描述的实施方案之一的方法，
-一种计算机可加载的数据结构，其适合于在数据结构在计算机上执行时执行根据本说明书中描述的实施方案之一的方法，
-一种计算机程序，其中所述计算机程序适合于在所述程序在计算机上执行时执行根据本说明书中描述的实施方案之一的方法，
-一种计算机程序，包括程序工具（programmeans），用于在计算机程序在计算机或计算机网络上执行时执行根据本说明书中描述的实施方案之一的方法，
-一种根据前述实施方案的计算机程序，包括程序工具，其中程序工具存储在计算机可读的存储介质上，
-一种存储介质，其中数据结构存储在存储介质上，并且其中数据结构适合于在已经加载到计算机或计算机网络的主存储器和/或工作存储器中之后执行根据本说明书中描述的实施方案之一的方法，以及
-一种具有程序代码工具的计算机程序产品，其中程序代码工具可以存储或存储在存储介质上，用于执行根据本说明书中描述的实施方案之一的方法，如果程序代码工具在计算机上或在计算机网络上执行的话。
此外，本发明涉及包含碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂的组合物在制备用于诊断hcv感染受试者的设备、试剂盒或组合物中的用途。
总结本发明的发现，特别设想了以下实施方案：
1.一种检测来自受试者的样品中丙型肝炎病毒（hcv）的核心多肽的方法，包括：
（a）使所述样品与碱并与包含阳离子去污剂的表面活性剂接触，和
（b）检测所述样品中所述hcv的核心多肽。
2.实施方案1的方法，其中所述样品与所述碱并与所述表面活性剂同时接触。
3.实施方案1或2的方法，其中所述方法进一步包括使所述核心多肽与检测化合物接触，在一个实施方案中与检测抗体接触。
4.实施方案1至3中任一项的方法，其中所述检测核心多肽包括借助于捕获化合物将至少一种核心多肽捕获至固体表面，在一个实施方案中借助于捕获抗体。
5.实施方案4的方法，其中所述捕获抗体和/或所述检测抗体是单克隆抗体。
6.实施方案3至5中任一项的方法，其中所述捕获化合物和/或检测化合物是特异性结合（i）碱处理的核心多肽或（ii）碱处理的核心多肽和非碱处理的核心多肽的结合化合物。
7.实施方案1至6中任一项的方法，其中所述检测所述核心多肽包括在夹心免疫测定中检测所述核心多肽。
8.实施方案1至7中任一项的方法，其中所述样品是体液样品，在一个实施方案中是尿、唾液、脑脊液、血液、血清或血浆样品。
9.实施方案1至8中任一项的方法，其中所述样品是包含免疫球蛋白的样品，在一个实施方案中是血液、血清或血浆样品。
10.实施方案1至9中任一项的方法，其中所述碱是brønsted–lowry碱，在一个实施方案中是在水溶液中包含或产生另外的氢氧离子的化合物，在进一步的实施方案中，是碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物。
11.实施方案1至10中任一项的方法，其中所述碱具有至多4的pkb值，在一个实施方案中至多3，在进一步的实施方案中至多2。
12.实施方案1至11中任一项的方法，其中所述碱是氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂，在一个实施方案中是氢氧化钠或氢氧化钾，在进一步的实施方案中是氢氧化钾。
13.实施方案1至12中任一项的方法，其中所述使所述样品与碱接触包括向2份所述样品添加1份0.25mol/l所述碱的溶液。
14.实施方案1至13中任一项的方法，其中所述使所述样品与碱接触包括在有所述碱的情况下将所述样品温育至少5分钟，在一个实施方案中至少9分钟。
15.实施方案1至14中任一项的方法，其中所述使所述样品与碱接触包括在至少11.75的ph温育所述样品，在一个实施方案中至少11.9，在进一步的实施方案中至少12，在进一步的实施方案中至少12.1。
16.实施方案1至16中任一项的方法，其中所述使所述样品与碱接触包括在11.75至12.75的ph温育所述样品，在一个实施方案中11.9至12.6，在进一步的实施方案中12至12.5。
17.实施方案1至16中任一项的方法，其中所述使所述样品与碱接触包括在所述ph将所述样品温育至少5分钟，在一个实施方案中至少9分钟。
18.实施方案1至17中任一项的方法，其中所述使所述样品与碱接触包括在10℃至50℃的温度温育所述样品，在一个实施方案中为20℃至45℃，在进一步的实施方案中为30℃至40℃，在进一步的实施方案中在37±3℃的温度。
19.实施方案1至18中任一项的方法，其中所述方法包括在步骤b）中检测所述病毒之前中和所述碱的进一步的步骤。
20.实施方案1至19中任一项的方法，其中所述中和包括向两份样品/碱混合物添加至少一份0.2mol/l缓冲液，在一个实施方案中为0.2mol/l磷酸盐缓冲液。
21.实施方案3至20中任一项的方法，其中所述方法包括在使所述核心多肽与检测化合物接触之前或期间中和所述碱的进一步的步骤。
22.实施方案1至21中任一项的方法，其中所述阳离子去污剂是季铵去污剂。
23.实施方案22的方法，其中所述季铵去污剂是十六碳烷基三甲铵盐，在一个实施方案中是氯化十六碳烷基-三甲铵（htac，cas编号112-02-7）。
24.实施方案22或23的方法，其中所述表面活性剂进一步包含非离子型去污剂，在一个实施方案中为烷基糖苷，在进一步的实施方案中为辛基糖苷（正辛基-β-d-葡糖苷，cas编号29836-26-8）。
25.实施方案22至24中任一项的方法，其中所述使所述样品与碱接触和所述使所述样品与表面活性剂接触同时进行。
26.实施方案1至25中任一项的方法，其中在所述中和所述碱的进一步的步骤后，不从样品除去变性的多肽。
27.实施方案1至26中任一项的方法，其中所述受试者是哺乳动物，在一个实施方案中是灵长类动物，在进一步的实施方案中是人。
28.实施方案1至27中任一项的方法，其中所述受试者是怀疑感染hcv的受试者。
29.实施方案1至28中任一项的方法，其中所述方法不包括向样品添加具有巯基的化合物，在一个实施方案中，不包括还原所述样品的成分。
30.实施方案1至29中任一项的方法，其中所述方法不包括使所述样品与离液剂接触。
31.一种用于预处理来自受试者的样品以用于检测hcv的方法，包括使所述样品与碱并与包含阳离子去污剂的表面活性剂接触。
32.一种用于检测样品中hcv的预处理试剂，其包含碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂，其中所述表面活性剂进一步包含非离子型去污剂。
33.实施方案32的预处理试剂，其中所述碱是氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂，在一个实施方案中是氢氧化钠或氢氧化钾，在进一步的实施方案中是氢氧化钾。
34.实施方案32或33的预处理试剂，其中所述预处理试剂中所述碱的浓度为0.1mol/l至1mol/l，在一个实施方案中为0.15mol/l至0.5mol/l，在一个实施方案中为0.2mol/l至0.3mol/l，在一个实施方案中为约0.25mol/l，在一个实施方案中为0.25mol/l。
35.实施方案32至34中任一项的预处理试剂，其中所述预处理试剂包含浓度为1.3％（w/v）至2％（w/v）的所述阳离子去污剂，和浓度为至少0.25％（w/v）的所述非离子型去污剂，在一个实施方案中为0.25％（w/v）至2.5％，在进一步的实施方案中为0.3％（w/v）至1.5％（w/v）。
36.实施方案32至35中任一项的预处理试剂，其中所述阳离子去污剂是季铵去污剂，在一个实施方案中是十六碳烷基-三甲铵盐，在一个实施方案中是氯化十六碳烷基-三甲铵（htac，cas编号112-02-7）。
37.实施方案32至36中任一项的预处理试剂，其中所述非离子型去污剂是烷基糖苷，在进一步的实施方案中是辛基糖苷（正辛基-β-d-葡糖苷，cas编号29836-26-8）。
38.实施方案32至37中任一项的预处理试剂，其中所述预处理试剂包含碱金属卤化物，在一个实施方案中为kcl或nacl，在进一步的实施方案中为kcl。
39.实施方案38的预处理试剂，其中所述预处理试剂包含浓度为0.5mol/l至2mol/l的所述碱金属卤化物，在一个实施方案中为0.75至1.75mol/l，在进一步的实施方案中为1mol/l至1.25mol/l，在进一步的实施方案中为约1.125mol/l，在进一步的实施方案中为1.125mol/l。
40.实施方案32至39中任一项的预处理试剂，其中所述预处理试剂是三倍浓缩的试剂。
41.实施方案32至40中任一项的预处理试剂，其中所述预处理试剂不包含包含巯基的化合物，在一个实施方案中不包含还原剂。
42.一种用于检测样品中hcv的试剂盒，包含碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂，其中所述表面活性剂进一步包含非离子型去污剂。
43.实施方案42的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含至少一种，在一个实施方案中至少两种，特异性结合所述病毒的结合化合物。
44.实施方案43的试剂盒，其中所述碱和所述表面活性剂包含在相同的溶液中。
45.实施方案42或43的试剂盒，其中所述碱包含在根据实施方案32至41中任一项的预处理试剂中。
46.实施方案42至45中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少两种所述结合化合物，并且其中至少一种结合化合物是捕获化合物，并且其中至少一种结合化合物是检测化合物。
47.实施方案42至46中任一项的试剂盒，其中所述至少一种捕获化合物包含生物素标记。
48.实施方案42至47中任一项的试剂盒，其中所述至少一种检测化合物包含钌标记。
49.实施方案42至48中任一项的试剂盒，其中至少一种结合化合物是抗体，在一个实施方案中是单克隆抗体。
50.实施方案42至49中任一项的试剂盒，其中至少一种所述捕获化合物和至少一种所述检测化合物是抗体，在一个实施方案中是单克隆抗体。
51.实施方案42至50中任一项的试剂盒，其中至少一种所述捕获化合物结合对应于hcv核心蛋白的氨基酸157-169的表位，在一个实施方案中，对应于seqidno：1的氨基酸157-169，且其中至少一种所述检测化合物结合对应于hcv核心蛋白的氨基酸102-112的表位，在一个实施方案中，对应于seqidno：1的氨基酸102-112。
52.实施方案42至51中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含中和溶液。
53.实施方案42至52中任一项的试剂盒，其中所述捕获化合物和检测化合物中的至少一种包含在所述中和溶液中。
54.包含碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂的组合物用于预处理受试者的样品以用于检测hcv的免疫测定的用途。
55.包含碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂的组合物用于通过免疫测定检测受试者样品中的hcv的用途。
56.一种用于检测样品中hcv的核心多肽的分析设备，包括具有样品处理单元的分析单元，所述分析单元适合于执行以下步骤：
（a）使施加到所述样品处理单元的样品与碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂接触，和
（b）检测所述样品中所述hcv的核心多肽。
57.一种用于检测样品中hcv的核心多肽的分析设备，包括具有样品处理单元的分析单元，所述分析单元连接到控制器单元，所述控制器单元适合于指导执行以下步骤：
（a）使施加到所述样品处理单元的样品与碱和包含阳离子去污剂的表面活性剂接触，和
（b）检测所述样品中所述病毒的核心多肽。
58.一种分析系统，包括实施方案56或57的分析设备和评价设备。
本发明另外的任选特征和实施方案将在实例实施方案的后续描述中更详细地公开，特别是连同从属权利要求。其中，如技术人员将认识到的，各个任选特征可以以孤立的方式以及以任何任意的可行组合来实现。本发明的范围不受所提供的实施例的限制。
实施例
实施例1：方法
重组dna技术
如sambrook,j.等人，molecularcloning:alaboratorymanual;coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989中所述，使用标准方法操作dna。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。
基因和寡核苷酸合成
通过geneartgmbh（regensburg，德国）的化学合成制备所期望的基因区段。将合成的基因片段克隆到大肠杆菌（e.coli）质粒中用于繁殖/扩增。通过dna测序验证亚克隆的基因片段的dna序列。或者，通过将化学合成的寡核苷酸退火或通过pcr组装短的合成dna片段。各个寡核苷酸由metabiongmbh（planegg-martinsried，德国）制备。
基本/标准哺乳动物表达质粒的描述
为了表达所期望的基因/蛋白质（例如全长抗体重链、全长抗体轻链或在其n-末端含有寡甘氨酸的fc链），使用包含以下功能元件的转录单位：
-来自人巨细胞病毒（p-cmv）的立即早期增强子和启动子，包括内含子a，
-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区（5'utr），
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-待表达的基因/蛋白质（例如，全长抗体重链），和
-牛生长素聚腺苷酸化序列（bghpa）。
除了包括待表达的所期望的基因的表达单位/盒之外，基本/标准哺乳动物表达质粒含有
-来自载体puc18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，和
-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。
蛋白质测定
通过使用根据多肽的氨基酸序列计算的摩尔消光系数或使用比色bca方法测定280nm处的光密度（od）来确定纯化的多肽的蛋白质浓度。
单克隆抗体
已经通过技术人员已知的标准杂交瘤技术或通过重组核酸技术制备了单克隆抗体。
所选择的单克隆抗体之一在下面的实施例中用作捕获化合物，并与hcv核心蛋白质的表位aa157-169结合。ep1308507中已经公开了非常相似的表位。作为检测化合物，选择能够结合表位aa102-112的单克隆抗体，一种与也在ep0967484和ep1308507中描述的表位相关的表位。对于小鼠的免疫接种，使用根据genbankacc.no：p26664.3gi：130455的基因型1a的hcv核心抗原序列，其公开了由hcv基因型1编码的完整多蛋白。特别地，使用作为遵循wo03/000878a2、us2009/0291892a1、wo2013/107633a1中公开的程序的与大肠杆菌slyd的重组融合蛋白质的都来自氨基酸110-171的肽进行免疫接种。在另外的方法中，根据已知方法将来自与klh（匙孔䗩血蓝蛋白）偶联的氨基酸82-117的多个肽用于免疫接种。
实施例2：抗体的标记
生物素和钌部分分别与抗体的偶联：
根据本领域技术人员完全熟悉的现有技术程序获得并纯化抗体。
在其标记之前，仅精制检测抗体。它被胃蛋白酶切割以获得f(ab’)2片段并消除易干扰的fc片段（该方法由a.johnstone和r.thorpe在immunochemistryinpractice，blackwellscientific1987中描述）。将纯化的f(ab’)2片段用同双功能交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯（dss）进一步聚合，并应用于s400凝胶过滤层析以收集f(ab’)2聚合物的最佳尺寸（原理被描述在de3640412中）。
对于偶联，通常抗体的赖氨酸ε-氨基被n-羟基-琥珀酰亚胺活化的化合物靶向。在10mg/ml的蛋白质浓度，抗体分别与n-羟基-琥珀酰亚胺活化的生物素化试剂和n-羟基-琥珀酰亚胺活化的钌标记试剂反应。生物素化或钌标记试剂的标记/蛋白质比分别为5:1或15:1。反应缓冲液是50mm磷酸钾（ph8.5），150mmkcl。反应在室温进行15分钟，并通过添加l-赖氨酸至10mm的终浓度来终止。为了避免标记的水解失活，在无水（dried）dmso（sigma-aldrich，德国）中制备各自的储备溶液。偶联反应后，通过使粗抗体缀合物通过凝胶过滤柱（superdex200hiload）或通过透析除去未反应的游离生物素/标记。
实施例3：
原型elecsyshcv核心抗原测定
对于约2500名供血者，在自动化cobas®e601分析仪（rochediagnosticsgmbh）上评估elecsyshcv核心抗原原型测定的特异性。
测量以夹心测定形式进行。cobas®e601分析仪中的信号检测基于电化学发光。在该夹心测定中，将生物素-缀合物（即，捕获抗体）固定化在链霉抗生物素蛋白包被的磁珠的表面上。检测抗体携带络合的钌阳离子作为信号传导部分。在有分析物的情况下，钌络合物桥接到固相，并在cobas®e601分析仪测量池中包含的铂电极激发后发射620nm的光。信号输出为以任意光单位。用从几个来源购买的hcv核心抗原阳性和阴性的人血清和血浆样品进行测量。
实验性hcv核心抗原测定如下进行。50μl正常人血清、hcv抗原阳性样品或供血者样品和25μl含有去污剂的预处理试剂pt（200mm磷酸钾，ph5.0，1.125mkcl，1.5％氯化十六碳烷基三甲铵（htac），0.5％辛基糖苷）一起温育9分钟以释放抗原，随后在相同的测定缓冲液r1和r2（100mm磷酸钾，ph7.0，225mmkcl，0.5％牛磺脱氧胆酸钠，0.3％两性离子去污剂3-14（zwittergent3-14），0.1％2-羟基吡啶-n-氧化物（oxypyrion），0.01％甲基异噻唑啉酮，0.2％牛血清清蛋白，0.2％牛igg，50μg/mlmak33-igg1，50μg/mlmak33-f(ab’)2-poly，50μg/mlmakigg2b/fab2a-poly）中添加35μl的2μg/ml捕获抗体-生物素缀合物和40μl的1μg/ml检测抗体钌标记缀合物。另外的9分钟温育时间后，添加50μl链霉抗生物素蛋白包被的顺磁性微粒，并进一步温育9分钟。然后，检测hcv核心抗原（通过这些实验中产生的电化学发光信号）。
表1中的数据显示了hcv抗原阳性样品和正常样品的区别。此外，所有信号高于1000计数的供血者样品都被认为是干扰样品。
表1
实施例4：
具有碱预处理的elecsyshcv核心抗原原型测定
通过使用不同的koh浓度代替如实施例3中所述的pt的磷酸钾来评估具有不同碱性ph的样品预温育的效果。为了最优化免疫学反应，另外还改变了r1和r2的缓冲液盐浓度和缓冲液ph。如实施例3中所述进行测量。结果示于表2a和b中。
0.15m或更低的koh浓度不足以抑制所有非特异性交叉干扰样品信号。0.5m或更高的koh浓度倾向于增加背景信号和基质效应（matrixeffects）并且降低测定灵敏度，这是因为那时的碱性ph很难通过r1和r2中升高的缓冲液盐浓度来抵消。因此，样品预处理期间的ph可以特别是至少11.6或高于11.6。低背景信号对于实现hcv抗原阳性样品中的高信噪（s/n）比和保护测定灵敏度非常重要。根据表2a/b的数据，含有ph6.5或ph6.3的200mm磷酸钾的r1和r2的缓冲液和含有0.25mkoh的pt显示出最佳结果。
实施例5：
碱预处理后不同种类血浆样品的所得ph
为了研究抗凝剂对碱预处理后人血浆样品的ph的影响，使用了10种含有人样品的不同种类的血浆管。如上文实施例中所述的，将样品和pt（1.125mkcl，1.5％htac，0.5％辛基葡糖苷，0.25mkoh）以2:1的相同比例混合，并测定所得ph（表3）。所有种类的血浆的所得ph值都可在ph11.9至12.3范围内发现。
表3
实施例6：
预处理试剂的贮存稳定性
诊断试剂或试剂盒的长期贮存通常在2-8℃进行。对于实施例3中所示的初步最优pt在这个温度贮存几天后，观察到沉淀。
预处理组合物的最优化示于表4中。改变koh、辛基糖苷和氯化十六碳烷基三甲铵（htac）的浓度，并在hcvag原型测定中评估，其中r1和r2的初步最优缓冲液含有实施例3中所示的ph6.5的200mm磷酸钾。仅仅具有增加的辛基糖苷浓度（0.75％和1％）的条件导致沉淀消除。
实施例6：
样品预处理期间的还原剂对hcvag检测的影响
专利申请ep2327987a2公开了在用于检测hcv核心抗原的两步样品预处理反应的第二步骤中使用还原剂。第一步用由碱性试剂、离液剂和非离子型去污剂组成的试剂进行。
通过在cobas®e601分析仪上的elecsyshcv核心抗原原型测定的pt中使用50mmdtt（导致如ep2327987a2中所公开的最终预处理的样品中的类似dtt浓度），分析灵敏度大大降低（表5）。用于本实验的r1和r2中使用的测定缓冲液含有200mm磷酸钾，ph6.5，225mmkcl，0.5％牛磺脱氧胆酸钠，0.3％两性离子去污剂3-14，0.1％2-羟基吡啶-n-氧化物，0.01％甲基异噻唑啉酮，0.2％牛血清清蛋白，0.2％牛igg。pt由0.25mkoh，1.125mkcl，1.5％htac，0.75％辛基-葡糖苷组成。
表5
实施例7：
表面活性剂对hcvag检测的影响
使用在有1.5％htac和0.75％辛基糖苷的情况下以及在没有去污剂的情况下的预处理进行根据实施例4的实验。确定代表性样品的信号强度和回收率（retrievalrates）。如从表6可以得出的，在没有去污剂的情况下，仅可以回收根据实施例4的碱/去污剂处理获得的信号的一小部分。
表6：在有和没有去污剂的情况下碱处理后的信号回收；回收率=没有去污剂的信号/有去污剂的信号
实施例8：
elecsyshcvag原型的血清转变敏感性
测试一组商业血清转变实验对象以进一步评估和比较对于碱性pt（r1/r2缓冲液和pt，参见实施例4）、对于实施例3中描述的pt（r1/r2缓冲液和pt参见实施例3）和对于elecsys抗-hcvii的elecsyshcvag原型的敏感性。elecsys抗-hcvii是一种免疫测定，其不检测病毒蛋白质，但检测hcv感染后由于身体的免疫应答而产生的抗-hcv抗体。对于两种hcvag测定，都选择初步工作截止指数（cut-offindex）（coi）定义为样品信号除以正常阴性样品的信号的三倍。
两种elecsyshcvag原型变体都能够以非常类似的方式在hcv感染的窗口期（windowphase）检测hcv核心抗原，即，在感染后当患者的免疫系统尚未产生针对hcv的抗体时的时间点。
表7；*coi=样品信号/3·正常样品的信号
序列表
<110>rochediagnosticgmbh
f.hoffmann-larocheag
rochediagnosticsoperations,inc.
<120>rd33382pc
<130>用于病毒抗原的血清学检测的方法
<150>ep16172144.4
<151>2016-05-31
<160>2
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>191
<212>prt
<213>丙型肝炎病毒
<400>1
metserthrasnprolysproglnlyslysasnlysargasnthrasn
151015
argargproglnaspvallyspheproglyglyglyglnilevalgly
202530
glyvaltyrleuleuproargargglyproargleuglyvalargala
354045
thrarglysthrsergluargserglnproargglyargargglnpro
505560
ileprolysalaargargprogluglyargthrtrpalaglnprogly
65707580
tyrprotrpproleutyrglyasngluglycysglytrpalaglytrp
859095
leuleuserproargglyserargprosertrpglyprothrasppro
100105110
argargargserargasnleuglylysvalileaspthrleuthrcys
115120125
glyphealaaspleumetglytyrileproleuvalglyalaproleu
130135140
glyglyalaalaargalaleualahisglyvalargvalleugluasp
145150155160
glyvalasntyralathrglyasnleuproglycysserpheserile
165170175
pheleuleualaleuleusercysleuthrvalproalaserala
180185190
<210>2
<211>177
<212>prt
<213>丙型肝炎病毒
<400>2
metserthrasnprolysproglnlyslysasnlysargasnthrasn
151015
argargproglnaspvallyspheproglyglyglyglnilevalgly
202530
glyvaltyrleuleuproargargglyproargleuglyvalargala
354045
thrarglysthrsergluargserglnproargglyargargglnpro
505560
ileprolysalaargargprogluglyargthrtrpalaglnprogly
65707580
tyrprotrpproleutyrglyasngluglycysglytrpalaglytrp
859095
leuleuserproargglyserargprosertrpglyprothrasppro
100105110
argargargserargasnleuglylysvalileaspthrleuthrcys
115120125
glyphealaaspleumetglytyrileproleuvalglyalaproleu
130135140
glyglyalaalaargalaleualahisglyvalargvalleugluasp
145150155160
glyvalasntyralathrglyasnleuproglycysserpheserile
165170175
phe