一种用于检测中麦895旗叶夹角QTL的CAPS标记及应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测中麦895旗叶夹角qtl的caps标记及应用。

背景技术：

小麦是世界上最主要的粮食作物之一，中国是世界最大的小麦生产国和消费国。面对人口增长和土地减少的双重压力，为保证粮食安全，进一步提高小麦产量是一项迫切和长期的任务。由于土地和水资源的限制，靠扩大种植面积来提高小麦总产量的潜力十分有限，因此只能通过不断提高并维持较高的单产水平来增加小麦产量。

株型是与作物产量有关的植株整体形态及其在空间的排布特点的总称，株型主要包括分蘖数目、分蘖角度、穗型、株高、叶片大小及叶夹角等性状，此外还包括影响群体光能利用效率的生理性状和生态性状。株型影响作物的光合效率、抗倒伏性及对一些病虫害的抗性等，最终影响作物产量。小麦株型一直是育种家极为关注的性状，与作物产量密切相关。小麦的理想株型(idealplanttype)应具有植株矮，株型紧凑，叶片直立，有芒，收获指数高以及茎秆独立强壮等特点。改善株型、构建合理的高光效群体是实现小麦产量突破的有效途径。

叶片是制造光合产物的主要器官。在小麦生长后期，旗叶对籽粒和产量的形成作用最大。旗叶与茎秆的夹角对小麦植株的受光情况有很大影响。旗叶夹角过小会影响自身的受光面积，从而降低植株的光合速率；夹角过大又遮挡下部叶片的受光面积，同样不利于整株叶片的光合效率。因此，研究旗叶夹角调控基因，构建合理的株型对于小麦增产和稳产具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测中麦895旗叶夹角qtl的caps标记及应用。

本发明首先保护特异引物对；所述特异引物对由引物pf和引物pr组成；

所述引物pf为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的dna分子；

所述引物pr为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的dna分子。

所述引物pf和所述引物pr的摩尔比为1:1。

所述特异引物对的用途为如下(b1)-(b8)中的至少一种：

(b1)鉴定或辅助鉴定小麦旗叶夹角性状；

(b2)选育旗叶夹角相对较小的小麦；

(b3)选育旗叶夹角相对较大的小麦；

(b4)检测或辅助检测小麦旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds的基因型；

(b5)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦旗叶夹角性状的试剂盒；

(b6)制备用于选育旗叶夹角相对较小的小麦的试剂盒；

(b7)制备用于选育旗叶夹角相对较大的小麦的试剂盒；

(b8)制备用于检测或辅助检测小麦旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds的基因型的试剂盒。

本发明还保护所述特异引物对的应用，为如下(b1)-(b8)中的至少一种：

(b1)鉴定或辅助鉴定小麦旗叶夹角性状；

(b2)选育旗叶夹角相对较小的小麦；

(b3)选育旗叶夹角相对较大的小麦；

(b4)检测或辅助检测小麦旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds的基因型；

(b5)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦旗叶夹角性状的试剂盒；

(b6)制备用于选育旗叶夹角相对较小的小麦的试剂盒；

(b7)制备用于选育旗叶夹角相对较大的小麦的试剂盒；

(b8)制备用于检测或辅助检测小麦旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds的基因型的试剂盒。

本发明还保护含有所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下(c1)-(c4)中的至少一种：

(c1)鉴定或辅助鉴定小麦旗叶夹角性状；

(c2)选育旗叶夹角相对较小的小麦；

(c3)选育旗叶夹角相对较大的小麦；

(c4)检测或辅助检测小麦旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds的基因型。

本发明还保护鉴定或辅助鉴定小麦旗叶夹角性状的方法，为方法a或方法b。

所述方法a包括如下步骤：以待测小麦的基因组dna为模板，采用所述特异引物对进行pcr扩增，用sfani酶切扩增产物，如果酶切产物中具有400bp的dna片段且不具有265bp的dna片段，则待测小麦旗叶夹角相对较小；如果酶切产物中具有265bp的dna片段且不具有400bp的dna片段，则待测小麦旗叶夹角相对较大。

所述方法b包括如下步骤：检待测小麦基因组dna中是否含有特异dna片段甲和特异dna片段乙，如果所述基因组dna中含有特异dna片段甲且不具有特异dna片段乙，则待测小麦旗叶夹角相对较小；如果所述基因组dna中含有特异dna片段乙且不具有特异dna片段甲，则待测小麦旗叶夹角相对较大；

所述特异dna片段甲为序列4或其反向互补序列；

所述特异dna片段乙为序列5或其反向互补序列。

本发明还保护鉴定或辅助鉴定小麦旗叶夹角性状的方法(方法c)，包括如下步骤：检测待测小麦旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds的基因型，携带旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds显性等位基因的小麦的旗叶夹角相对较小；携带旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds隐性等位基因的小麦的旗叶夹角相对较大。

本发明还保护检测或辅助检测小麦旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds的基因型的方法(方法d)，包括如下步骤：以待测小麦的基因组dna为模板，采用所述特异引物对进行pcr扩增，用sfani酶切扩增产物，如果酶切产物中具有400bp的dna片段且不具有265bp的dna片段，则待测小麦为或候选为携带旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds显性等位基因的小麦；如果酶切产物中具有265bp的dna片段且不具有400bp的dna片段，则待测小麦为或候选为携带旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds隐性等位基因的小麦。

本发明还保护检测或辅助检测小麦旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds的基因型的方法(方法e)，包括如下步骤：检测待测小麦基因组dna中是否含有特异dna片段甲和特异dna片段乙，如果所述基因组dna中含有特异dna片段甲且不具有特异dna片段乙，则待测小麦为或候选为携带旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds显性等位基因的小麦；如果所述基因组dna中含有特异dna片段乙且不具有特异dna片段甲，则待测小麦为或候选为携带旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds隐性等位基因的小麦；

所述特异dna片段甲为序列4或其反向互补序列；

所述特异dna片段乙为序列5或其反向互补序列。

以上任一所述方法中，所述pcr扩增的反应体系具体可为：模板dna(30ng/μl)2μl，引物pf(10μm)0.5μl，引物pr(10μm)0.5μl，2×pcrmix(0.1uμl^-1taq酶、500μmoll^-1dntps、20mmoll^-1tri-hcl、10mmoll^-1kcl、3mmoll^-1mgcl2)10μl，ddh2o7μl。

以上任一所述方法中，所述pcr程序具体可为：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min30s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

本发明还保护以上任一所述的特异dna片段甲和/或特异dna片段乙。

本发明还保护以上任一所述的方法在小麦育种中的应用。

本发明还保护以上任一所述的特异dna片段甲和/或特异dna片段乙在小麦育种中的应用。

本发明还保护小麦育种方法，为方法甲-丁中的任一种；

所述方法甲包括如下步骤：将按照方法a或方法b或方法c筛选得到的旗叶夹角相对较小的小麦作为育种材料；

所述方法乙包括如下步骤：将按照方法e或方法d筛选得到的携带旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds显性等位基因的小麦作为育种材料；

所述方法丙包括如下步骤：将按照方法a或方法b或方法c筛选得到的旗叶夹角相对较大的小麦作为育种材料；

所述方法丁包括如下步骤：将按照方法e或方法d筛选得到的携带旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds隐性等位基因的小麦作为育种材料。

以上任一所述旗叶夹角相对较小是指如下(a)-(c)任一种：

(a)当所比较的小麦中基因组上其他影响旗叶夹角大小的位点的效应相等时，携带旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds显性等位基因的小麦的旗叶夹角相对于携带旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds隐性等位基因的小麦的旗叶夹角更小；

(b)当所比较的小麦中基因组上其他影响旗叶夹角大小的位点的效应相等时，经方法a鉴定酶切产物中具有400bp的dna片段且不具有265bp的dna片段的小麦的旗叶夹角相对于酶切产物中具有265bp的dna片段且不具有400bp的dna片段的小麦的旗叶夹角更小；

(c)当所比较的小麦中基因组上其他影响旗叶夹角大小的位点的效应相等时，经基因组dna中含有特异dna片段甲且不具有特异dna片段乙的小麦的旗叶夹角相对于基因组dna中含有特异dna片段乙且不具有特异dna片段甲的小麦的旗叶夹角更小。

以上任一所述旗叶夹角相对较大是指如下(d)-(f)任一种：

(d)当所比较的小麦中基因组上其他影响旗叶夹角大小的位点的效应相等时，携带旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds隐性等位基因的小麦的旗叶夹角相对于携带旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds显性等位基因的小麦的旗叶夹角更大；

(e)当所比较的小麦中基因组上其他影响旗叶夹角大小的位点的效应相等时，经方法a鉴定酶切产物中具有265bp的dna片段且不具有400bp的dna片段的小麦的旗叶夹角相对于酶切产物中具有400bp的dna片段且不具有265bp的dna片段的小麦的旗叶夹角更大；

(f)当所比较的小麦中基因组上其他影响旗叶夹角大小的位点的效应相等时，经基因组dna中含有特异dna片段乙且不具有特异dna片段甲的小麦的旗叶夹角相对于基因组dna中含有特异dna片段甲且不具有特异dna片段乙的小麦的旗叶夹角更大。

以上任一所述265bp的dna片段为序列6或其反向互补序列。

以上任一所述400bp的dna片段为序列7或其反向互补序列。

以上任一所述小麦可为但不限于如下品种中的任一种或任几种：扬麦16、中麦895、扬麦16/中麦895dh群体，以及实施例部分表2中所示的118份小麦品种。

以上任一所述qtlqfla.caas-1ds位于小麦1ds上，，lod值为3～11，解释表型变异6.1％～9.1％。

本发明2016～2017年度在河南新乡、商丘、2017～2018年度在河南新乡、漯河以及湖北武汉对杨麦16/中麦895dh群体174份家系旗叶夹角进行了田间鉴定，用660ksnp芯片对该群体进行了基因型分析，构建了高密度连锁图谱，qtl定位发现位于1ds上控制旗叶夹角的主效位点，lod值为3.4～10.8，解释表型变异(pve)6.1％～9.1％，该位点记为qfla.caas-1ds。基于其连锁标记ax-94664699开发了caps标记fla-1ds-caps(图1)。通过实验证明：本发明的分子标记fla-1ds-caps可有效用于中麦895qfla.caas-1ds的育种利用。本发明不仅为辅助选择育种提供良好工具，而且为图位克隆该位点的旗叶夹角控制基因创造条件。

附图说明

图1为复合区间作图法在杨麦16×中麦895dh群体中定位的qfla.caas-1ds曲线图。

图2为品种pcr产物及酶切后的电泳检测结果。1:marker；2、3：pcr产物中麦895、杨麦16；4-12：酶切后的中麦895、杨麦16及其它品种。

图3为成熟期杨麦16、中麦895旗叶叶型。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

旗叶夹角(flagleafangle，fls)：旗叶与植株茎秆之间的夹角，旗叶夹角分1-6级，1级：≤30°；2级：30-60°；3级：60-90°；4级：90-120；5级：120-150°；6级：≥150°。

中麦895：中国农业科学院作物科学研究所和中国农业科学院棉花研究所合作选育的高产、抗病、广适性小麦新品种。参考文献：何中虎,阎俊,张勇.高产矮秆抗倒广适小麦新品种中麦895的选育及栽培要点[j].作物杂志,2013(5):154–155.公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。中麦895旗叶夹角为2级。

扬麦16：江苏里下河地区农业科学研究所育成的春性中筋小麦新品种。参考文献：陆成彬,程顺和,张伯桥,等.优质中筋小麦新品种扬麦16特征特性与高产栽培技术[j].江苏农业科学,2006(3):112.公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。扬麦16旗叶夹角为6级。

成熟期杨麦16、中麦895旗叶叶型见图3。

实施例1、小麦旗叶夹角qfla.caas-1ds及其连锁标记的获得

供试材料：中麦895、扬麦16和以扬麦16为母本，中麦895为父本采用小麦玉米杂交技术构建的dh群体(含174个家系)。

旗叶夹角的田间鉴定：2016～2017年度在河南新乡、商丘、2017～2018年度在河南新乡、漯河以及湖北武汉。试验采用完全随机区组设计，3次重复，小区长6m，行距0.25m，共6行。待抽随后15-20d时，调查各家系的旗叶夹角。

田间数据分析：用sas9.2软件proccorr模型计算旗叶的pearson相关系数。相关分析表明，2016～2017年度新乡、商丘重复间相关系数为0.83、0.78(p<0.01)，2017～2018年度新乡、漯河、武汉重复间相关系数为0.79、0.76、0.68(p<0.01)，不同个环境下旗叶夹角相关系数均为0.70(p<0.01)，说明该群体田间表型数据的有效性。

遗传图谱构建：除去标记缺失率高于20％的dh系，除去无多态性、缺失率大于10％及两种基因型比例大于7:3或小于3:7的偏分离标记。用icimappingv4.0的bin-mapping功能对剩余的多态性标记进行优化处理，以用于遗传图谱构建。利用joinmapv4.0和mstmaponline进行遗传图谱的构建。

qtl定位：用qtlicimappingv4.0复合区间作图(cim)对扬麦16/中麦895dh群体旗叶夹角进行qtl定位，选取lod值2.5作为阈值。qtl定位发现位于1ds上控制旗叶夹角的主效位点(图1)，两侧标记为ax-109378629和ax-110977092，lod值为3～11，解释表型变异6.1％～9.1％，该位点记为qfla.caas-1ds。两侧标记分别为39.66cm和45.24cm，在中国春参考基因组(iwgscrefseqv1.0)上的物理位置约为10-103mb。选取该位点附近的多个snp标记，用于qfla.caas-1ds紧密连锁的caps标记开发。

实施例2、fla-1ds-caps标记方法的建立

一、基因组特异引物设计

ax-94664699在连锁图1d上的遗传位置为19.3cm，在中国春参考基因组(iwgscrefseqv1.0)上的物理位置为16.2mb，位于qfla.caas-1ds两侧标记ax-109378629和ax-110977092遗传位置和物理位置均极为接近，可用于标记开发。用snpax-94664699的侧翼序列(序列3)，在ensemblplants数据库(http://plants.ensembl.org)比对，获取其同源序列，设计其1d染色体特异引物p(序列1和序列2)，由北京华大生物科技有限公司合成。

pf：5’-cttgcattgcattgcttct(序列1)；

pr：5’-gcttgcataaatcacggctc(序列2)。

二、检测方法建立

供试材料：中麦895、扬麦16和以扬麦16为母本、中麦895为父本采用小麦玉米杂交技术构建的dh群体(含174个家系)。

1、提取待测小麦的基因组dna，加ddh2o稀释其浓度至30ng/μl。

2、以步骤1得到的基因组dna为模板，采用引物pf和引物pr组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr产物。

pcr体系见表1。

pcr程序:95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min30s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

表1pcr体系

3、用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测步骤2得到的pcr产物并将产物测序。中麦895和扬麦16扩增片段长度均为827bp(图2)，经测序，中麦895序列的扩增片段见序列4，扬麦16的扩增片段见序列5，二者在429bp位点存在一个g/t的snp位点。

4、用sfani内切酶分别对扬麦16和中麦895的pcr产物37℃下酶切1h。酶切反应体系10μl，含pcr产物4μl，10×buffer1μl，sfani0.3μl，ddh2o4.7μl。

5、用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测步骤4的酶切产物并对其进行测序。结果表明：扬麦16pcr产物经sfani酶切后可得到大小为265bp的片段(序列6)、160bp的片段、130bp的片段和100bp的片段，且不含400bp的片段，而中麦895pcr产物经sfani酶切后可得到大小为400bp的片段(序列7)、160bp的片段和100bp的片段，且不含265bp的片段(图2)。酶切产物电泳条带差异可区分扬麦16和中麦895在该位点基因型，该标记记为fla-1ds-caps。

174个家系fla-1ds-caps标记基因型与ax-94664699芯片基因型有6个家系存在差异，放入原图谱位置相近，说明芯片标记ax-94664699成功转化为caps标记。

因此，可以用如下方法判断待测小麦旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds的等位基因：

用引物pf和引物pr组成的引物扩增待测小麦的基因组dna，得到扩增产物，用sfani酶切扩增产物，得到酶切产物，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，根据电泳结果判断待测小麦旗叶夹角qtlqfla.caas-1ds的等位基因：

如果测材料扩增产物被sfani酶切，电泳含有400bp的条带且不含有265bp的条带，则待测材料该位点基因型与中麦895相同，推测含有qfla.caas-1ds显性等位基因，旗叶夹角较小；

如果测材料扩增产物被sfani酶切，电泳含有265bp的条带且不含有400bp的条带，则待测材料该位点基因型与扬麦16相同，推测含有qfla.caas-1ds隐性等位基因，旗叶夹角较大。

实施例3、实际样本检测

供试材料：我国不同省份小麦品种118份(中国农业科学院作物科学研究所种质库)，具体见表2。

1、旗叶夹角表型鉴定

118份小麦品种于2016～2017年度和2017～2018年度种植于新乡、漯河，进行旗叶夹角田间鉴定。试验采用完全随机区组设计，三次重复，双行区，行长1.5m，行距0.25m，每行播种60粒种子。待群体抽随后15-20d时，调查各品种旗叶夹角。两年旗叶夹角平均值用于后续分析。

2、fla-1ds-caps标记检测

按照实施例2中的方法进行检测，以中麦895和扬麦16作为对照。

118份小麦品种标记检测结果和旗叶夹角平均值如表2所示。93份与中麦895基因型相同，推测含qfla.caas-1ds显性等位基因，fls平均值为2.1；25份与扬麦16基因型相同，推测含qfla.caas-1ds隐性等位基因，fls平均值为4.3。含qfla.caas-1ds显性等位基因品种fls平均值比含qfla.caas-1ds隐性等位基因品种低2.2(大约是66°)。用sas9.2统计软件procttest模型进行t检验，其差异在0.05水平显著(p＝0.011)。

表2118份小麦品种fla-1ds-caps标记检测结果

注：1:旗叶夹角分1-6级，1：≤30°；2：30-60°；3：60-90°；4：90-120；5：120-150°；6：150°；2：“+”表示该位点基因型与中麦895相同，推测含qfla.caas-1ds显性旗叶夹角等位基因，可是旗叶夹角变小；“-”表示该位点基因型与扬麦16相同，推测含qfla.caas-1ds阴性旗叶夹角等位基因，不能使旗叶夹角变小。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所

中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种用于检测中麦895旗叶夹角qtl的caps标记及应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cttgcttgcttgcttct17

<210>2

<211>15

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcttgcttccggctc15

<210>3

<211>71

<212>dna

<213>小麦(triticumaestivuml.)

<220>

<221>misc_feature

<222>(36)..(36)

<223>k=gort

<400>3

acgctcacgggatttgaattcttccctgacacagakgctcgcgtgcttggtgagccaacg60

ggaataaaaga71

<210>4

<211>827

<212>dna

<213>小麦(triticumaestivuml.)

<400>4

cttgcattgcattgcttcttcagcttctcttcatcgtttccttcagttgatgacgagtac60

atcattgtcggatctgccaacctcaacgagcggtccatggcggggtacagggacagcgag120

atcgctatcggcgcgtaccagccgcaccgcatcaccagtggcgccgagctcgccaagggg180

cacgtccatggcttccggatgtcgctctggcacgagcacctcggcaagacgcacgatgac240

ttcctgcgcccgggaagcctagagtgcgtgcagagggtcaacaagatggccgatgagtac300

tggagcctctacgtcggcgaccagctgccggaagacctcccaggccacctgctcacctac360

cccgtctcggtagacaaggccggcaatgtctcagcggtcacgggatttgaattcttccct420

gacacagaggctcgcgtgcttggtgagccaacgggaataaaagattattttctgagcaca480

tagctccaggtttgccgctcctagtttgtgttgattaatcctggcacctccgggtttttt540

ttttttgcgcatcgtgttagctatcttagttagaattaaacttatttgcctacaaatatt600

gtcctttttcttgttatgtgtccgctcattttctctaagatgcttatataagtaaggtgt660

gtgtgcatttacatgagtgaattcatgtgcatatgtctgagcgtctacgtatgtactgtg720

ttaaaaaaactattgtatcttcattaggatttactagttttttcctaaacctatttttta780

ttttctgttagcttgttcttttagcgtgagccgtgatttatgcaagc827

<210>5

<211>827

<212>dna

<213>小麦(triticumaestivuml.)

<400>5

cttgcattgcattgcttcttcagcttctcttcatcgtttccttcagttgatgacgagtac60

atcattgtcggatctgccaacctcaacgagcggtccatggcggggtacagggacagcgag120

atcgctatcggcgcgtaccagccgcaccgcatcaccagtggcgccgagctcgccaagggg180

cacgtccatggcttccggatgtcgctctggcacgagcacctcggcaagacgcacgatgac240

ttcctgcgcccgggaagcctagagtgcgtgcagagggtcaacaagatggccgatgagtac300

tggagcctctacgtcggcgaccagctgccggaagacctcccaggccacctgctcacctac360

cccgtctcggtagacaaggccggcaatgtctcagcggtcacgggatttgaattcttccct420

gacacagatgctcgcgtgcttggtgagccaacgggaataaaagattattttctgagcaca480

tagctccaggtttgccgctcctagtttgtgttgattaatcctggcacctccgggtttttt540

ttttttgcgcatcgtgttagctatcttagttagaattaaacttatttgcctacaaatatt600

gtcctttttcttgttatgtgtccgctcattttctctaagatgcttatataagtaaggtgt660

gtgtgcatttacatgagtgaattcatgtgcatatgtctgagcgtctacgtatgtactgtg720

ttaaaaaaactattgtatcttcattaggatttactagttttttcctaaacctatttttta780

ttttctgttagcttgttcttttagcgtgagccgtgatttatgcaagc827

<210>6

<211>265

<212>dna

<213>小麦(triticumaestivuml.)

<400>6

tggcgccgagctcgccaaggggcacgtccatggcttccggatgtcgctctggcacgagca60

cctcggcaagacgcacgatgacttcctgcgcccgggaagcctagagtgcgtgcagagggt120

caacaagatggccgatgagtactggagcctctacgtcggcgaccagctgccggaagacct180

cccaggccacctgctcacctaccccgtctcggtagacaaggccggcaatgtctcagcggt240

cacgggatttgaattcttccctgac265

<210>7

<211>400

<212>dna

<213>小麦(triticumaestivuml.)

<400>7

tggcgccgagctcgccaaggggcacgtccatggcttccggatgtcgctctggcacgagca60

cctcggcaagacgcacgatgacttcctgcgcccgggaagcctagagtgcgtgcagagggt120

caacaagatggccgatgagtactggagcctctacgtcggcgaccagctgccggaagacct180

cccaggccacctgctcacctaccccgtctcggtagacaaggccggcaatgtctcagcggt240

cacgggatttgaattcttccctgacacagaggctcgcgtgcttggtgagccaacgggaat300

aaaagattattttctgagcacatagctccaggtttgccgctcctagtttgtgttgattaa360

tcctggcacctccgggttttttttttttgcgcatcgtgtt400