位于白菜A04染色体上的抗霜霉病基因BrRLP48及与其相连锁的SNP标记的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及位于白菜a04染色体上的抗霜霉病基因brrlp48及与其相连锁的snp标记。
背景技术：
：大白菜原产我国，是我国栽培面积最大的蔬菜作物，目前已逐渐成为世界性的蔬菜作物。据农业部统计，我国大白菜年种植面积近4000万亩，占全国蔬菜总播种面积的15％左右，可见大白菜在我国菜篮子工程中举足轻重。植物病害是影响植物正常生长重大威胁之一。尤其在农业生产中，病害会直接影响农作物的产量和质量。霜霉病是由专性寄生霜霉菌(hyaloperonosporaparasitica)引起的真菌病害，是危害大白菜的三大病害(病毒病、霜霉病和软腐病)之一，该病流行范围广、发病速度快，对白菜的产量和品质造成严重影响，流行年份发病率高达80-90％，减产30-50％。生产中通常使用杀菌剂进行霜霉病防治，不仅增加了生产成本，造成环境污染，还可能引起霜霉菌生理小种的变异及病原菌的抗药性。因此，霜霉病抗性品种的培育成为降低病害损失的最安全高效的方法之一。遗传学研究表明，白菜霜霉病抗性是一个复杂的数量性状，涉及多种抗病基因，依靠传统的育种方法获得抗病白菜的周期较长。随着分子生物学的发展，分子辅助育种技术可以在早世代进行准确、稳定的选择，从而加速育种进程，提高育种效率，但该技术的基础是必须具有优良的目标基因及与其紧密连锁的分子标记。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供检测白菜基因组中a04_5326733位点的多态性或基因型的物质或a04_5326733位点的新用途。本发明提供了检测白菜基因组中a04_5326733位点的多态性或基因型的物质或a04_5326733位点在如下(1)-(6)任一中的应用：(1)鉴定或辅助鉴定白菜霜霉病抗性；(2)筛选或辅助筛选抗霜霉病的白菜品种；(3)白菜育种；(4)制备鉴定或辅助鉴定白菜霜霉病抗性的产品；(5)制备筛选或辅助筛选抗霜霉病的白菜品种的产品；(6)制备白菜育种的产品；所述a04_5326733位点为白菜基因组中序列1自5’端起第101位核苷酸，a04_5326733位点为t/a多态。上述应用中，所述检测白菜基因组中a04_5326733位点的多态性或基因型的物质包括由引物1、引物2和引物3所组成的引物组；所述引物1为如下a1)或a2)：a1)序列2所示的单链dna分子；a2)将a1)限定的单链dna分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的与a1)限定的单链dna分子具有相同功能的单链dna分子；所述引物2为如下b1)或b2)：b1)序列3所示的单链dna分子；b2)将b1)限定的单链dna分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的与b1)限定的单链dna分子具有相同功能的单链dna分子；所述引物3为如下c1)或c2)：c1)序列4所示的单链dna分子；c2)将c1)限定的单链dna分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的与c1)限定的单链dna分子具有相同功能的单链dna分子。本发明的第二个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测白菜霜霉病抗性的方法。本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测白菜霜霉病抗性的方法包括如下步骤：检测待测白菜a04_5326733位点的多态性或基因型，若所述待测白菜a04_5326733位点的基因型为at或aa，则所述待测白菜抗霜霉病或候选抗霜霉病；若所述待测白菜a04_5326733位点的基因型为tt，则所述待测白菜感霜霉病或候选感霜霉病；所述a04_5326733位点为白菜基因组中序列1自5’端起第101位核苷酸，a04_5326733位点为t/a多态。上述方法中，所述检测待测白菜a04_5326733位点的多态性或基因型的方法为如下(1)或(2)：(1)测序；(2)用上述引物组对待测白菜进行等位基因特异性pcr。本发明的第三个目的是提供一种筛选或辅助筛选抗霜霉病的白菜品种的方法。本发明提供的筛选或辅助筛选抗霜霉病的白菜品种的方法包括如下步骤：选择a04_5326733位点的多态性或基因型为at或aa的白菜进行育种。本发明的第四个目的是提供上述引物组或含有上述引物组的pcr试剂或试剂盒。上述引物组或含有上述引物组的pcr试剂或试剂盒在如下(1)-(6)中任一中的应用也属于本发明的保护范围：(1)鉴定或辅助鉴定白菜霜霉病抗性；(2)筛选或辅助筛选抗霜霉病的白菜品种；(3)白菜育种；(4)制备鉴定或辅助鉴定白菜霜霉病抗性的产品；(5)制备筛选或辅助筛选抗霜霉病的白菜品种的产品；(6)制备白菜育种的产品。上述应用或方法中，所述抗霜霉病的白菜品种是指发病级别为0级、1级或3级的白菜品种；所述感霜霉病的白菜品种是指发病级别为5级、7级或9级的白菜品种。所述发病级别的判定标准具体如表1所示。本发明的第五个目的是提供一种蛋白质。本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列5所示的蛋白质；b)在序列5所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列5所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质；其中，序列5由797个氨基酸残基组成。为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列5所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列7所示的cds序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。本发明的第六个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料；所述生物材料为下述a1)至a12)中的任一种：a1)编码上述蛋白质的核酸分子；a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物；a9)含有a1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；a10)含有a2)所述表达盒的转基因植物细胞系；a11)含有a3)所述重组载体的转基因植物细胞系；a12)含有a4)所述重组载体的转基因植物细胞系。上述生物材料中，a1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)其编码序列是序列7所示的cdna分子或序列6所示的基因组dna分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cdna分子或基因组dna分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cdna分子或基因组dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。上述材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。上述材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。本发明的第七个目的是提供上述蛋白质或上述生物材料的新用途。本发明提供了上述蛋白质或上述生物材料在调控植物霜霉病抗性中的应用。上述应用中，所述调控为提高。本发明还提供了上述蛋白质或上述生物材料在培育霜霉病抗性提高的植物中的应用。本发明还提供了上述蛋白质或上述生物材料在白菜育种中应用。本发明的最后一个目的是提供一种培育霜霉病抗性提高的植物的方法。本发明提供的培育霜霉病抗性提高的植物的方法包括如下步骤：提高受体植物中上述蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的霜霉病抗性高于所述受体植物。上述方法中，所述转基因植物的霜霉病抗性高于所述受体植物具体体现在转基因植物接种霜霉病孢子后的生长霉层的子叶百分比低于所述受体植物。上述方法中，所述提高受体植物中上述蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中瞬时表达编码上述蛋白质的核酸分子。进一步的，编码上述蛋白质的核酸分子为序列7所示的dna分子。更进一步的，所述在受体植物中瞬时表达编码上述蛋白质的核酸分子的方法为将编码上述蛋白质的核酸分子导入受体植物中。在本发明中，编码上述蛋白质的核酸分子通过重组载体pcambiasuper1300-brrlp48导入受体植物中；所述重组载体pcambiasuper1300-brrlp48为将序列7所示的dna分子构建到pcambiasuper1300载体中得到的。上述方法中，所述受体植物为白菜，所述白菜的品种具体为“白阳”。本发明利用白菜抗病自交系“mm”和感病自交系“白阳”的dh群体和f2群体在白菜第4号染色体上成功定位到与白菜霜霉病抗性相关的qtl位点br-dm04，可以解释22.3％的表型变异，并获得抗霜霉病基因brrlp48及与其连锁的snp分子标记a04_5326733。通过实验证明：基于kasp(kompetitiveallelespecificpcr)技术的分子标记a04_5326733可快速、准确的鉴定白菜霜霉病抗性，可用于抗霜霉病白菜品种鉴定及白菜分子育种。附图说明图1为基于kasp技术对f2群体植株在snpa04_5326733标记上进行基因分型。其中，a:a和a:t为抗病基因型，t:t为感病基因型，“？”为未检测到值。图2为瞬时表达体系鉴定抗病候选基因。(a)瞬时表达后的抗病表型和体系中蛋白表达情况；(b)瞬时表达接病后的霜霉抗病表型统计；(c)瞬时表达后的基因表达情况。图3为抗病候选基因接病后的基因表达分析和抗感亲本中启动子序列差异分析。(a)在霜霉菌侵染的0h，2h，6h，12h，24h和48h，brrlp48在抗感亲本中的表达情况；(b)brrlp48的启动子序列在抗感亲本之间的差异分析，由于序列差异造成了brrlp48的启动子序列中增加了两个茉莉酸响应元件和一个水杨酸响应元件。“-s”，感病基因型；“-r”，抗病基因型；“-r”，参考序列。图4为抗感亲本接病处理后的水杨酸和茉莉酸含量以及brrlp48在水杨酸和茉莉酸处理后的表达量。(a)抗感亲本接病处理后的水杨酸含量；(b)抗感亲本接病处理后的茉莉酸含量；(c)brrlp48在茉莉酸处理后的表达量；(d)brrlp48在水杨酸处理后的表达量。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的培养基甲是将浓度为10mmmes(2-(n-morpholine)-ethanesulfonicacid，ph5.6)溶液、浓度为40mm的乙酰丁香酮(acetosyringone)溶液与lb培养基混匀得到的，其中，mes溶液和乙酰丁香酮溶液均按照1:100体积比加入lb培养基中。下述实施例中的p19质粒记载于文献“anefficientsystemtodetectproteinubiquitinationbyagroinfiltrationinnicotianabenthamiana”中，公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的来自西欧的白菜抗病自交系“mm”与来自台湾的白菜感病自交系“白阳”均记载于文献“yushuancang,zhangfenglan,zhaoxiang,yuyangjun,zhangdeshuang,zhaoxiuyun,wangweihong.animprovedbrassicarapageneticlinkagemapandlocus-specificvariationsinadoubledhaploidpopulation.plantmolbiolrep,2013,31:558-568.”中，公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的表达载体pcambiasuper1300是以pcambia1300载体(购自invitrogen公司)作为瞬时转化的骨架载体进行改造后得到的载体。改造方法具体如下：将pcambia1300载体的35spromoter替换为甘露醇合成酶启动子(甘露醇合成酶启动子的核苷酸序列如序列表中的序列8)，且在pcambia1300载体的kpnⅰ和sacⅰ位点间连入gfp基因序列(gfp基因核苷酸序列如序列表中的序列9)，得到pcambiasuper1300。下述实施例中的霜霉致病孢子记载于文献“gao,t.,yu,s.,zhang,f.,chen,x.,yu,y.,&zhang,d.,etal.(2014).expressionanalysisofmajorgenesinvolvedinsignalingpathwaysduringinfectionofchinesecabbagewithhyaloperonosporabrassicae.scientiahorticulturae,167(167),27-35.”中，公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例1、snp标记a04_5326733的获得一、供试材料以来自西欧的白菜抗病自交系“mm”为母本，以与来自台湾的白菜感病自交系“白阳”为父本进行杂交，得到f1代群体，取其小孢子进行染色体加倍处理，最终得到单倍体加倍群体(dh，doubledhaploidpopulation)，dh群体包含80个单株。以来自西欧的白菜抗病自交系“mm”为母本，以与来自台湾的白菜感病自交系“白阳”为父本进行杂交，得到f1代群体，将f1代群体中的各单株自交，得到f2群体，f2群体包含1056个单株。选用由80个株系组成的dh群体和由1056个株系组成的f2群体作为定位群体。二、基因型鉴定在温室中种植两个亲本材料抗病亲本“mm”和感病亲本“白阳”，f1代群体、f2群体和dh群体植株材料。取幼嫩叶片，按照doyle和dickson(1987)并略有改进的十六烷基三乙基溴化铵法(ctab)进行全基因组dna的提取。用筛选出的亲本间具有多态性、分型效果好、且均匀分布于10个连锁群的974个snp标记用于定位群体的基因型鉴定。三、霜霉病抗性鉴定温室中种植两个亲本材料抗病亲本“mm”和感病亲本“白阳”，f1代群体、f2群体、dh群体植株材料。双亲及各个群体种植10株作为重复。种植后的第16天，大部分植株两片真叶完全展开并有新的真叶露出(即两叶一心期)时进行霜霉病的接种。接种方法如下：将每毫升含有1×104或1×105霜霉致病孢子的悬浮液，利用喷雾法均匀的喷施到叶片背面。将接种后的植株在黑暗，100％湿度，18-20℃的环境中放置24小时。随后，移入16小时光照/8小时黑暗的光周期的生长环境中，并继续保持一定湿度维持4-5天。调查病情的前一天再进行黑暗加湿处理16-24小时，促进感病植株的霉层生长。调查病情的分级标准按照表1进行。将发病级别为0级、1级和3级的植株定义为抗病植株；将发病级别为5级、7级和9级的植株定义为感病植株。表1、病情分级标准发病级别叶片表型抗病性0叶健康极强1叶基本健康，有少量小斑极强3叶基本健康，有一些小斑或少量中型斑块强5叶基本健康，有少量斑块上有少量霉层弱7叶片出现大块黄斑，并伴有生长大量霉层极弱9叶片轻微萎蔫，出现大片连接在一起的黄斑，有大量霉层极弱四、连锁图谱的构建及qtl定位利用joinmap4.0软件进行重组自交系群体遗传连锁图谱的构建，标记间的遗传距离采用kosambi函数进行估算(kosambietal，1944)。qtl检测选用mapqtl4.0软件，以lod值3.1作为qtl检测的阈值。“mm”和“白阳”的dh群体的定位结果表明：bra-dm04位于大白菜基因组染色体a04上76.06cm的位置，lod值4.42，能够解释22.3％的表型变异。五、snp标记a04_5326733的获得利用1056个株系组成的f2群体和14对snp引物，基于kasp技术将bra-dm04缩小到160kb的区间内，并发现在序列表中序列1第101位核苷酸有一个snp位点，为t/a多态，将该snp位点命名为a04_5326733位点，snp标记a04_5326733信息如表2所示。表2为snp标记a04_5326733针对a04_5326733位点，设计引物如下：a04_5326733_a1：gaaggtgaccaagttcatgctcctcagtgttttaagaatttcaatactact(序列2)；a04_5326733_a2：gaaggtcggagtcaacggattcctcagtgttttaagaatttcaatactaca(序列3)；a04_5326733_c：ctgttattctgaagatgcaagaccgaaat(序列4)。委托北京生工生物工程有限公司合成上述各条引物。实施例2、a04_5326733位点在鉴定白菜霜霉病抗性中的应用一、供试材料以实施例1中的由1056个株系组成的f2群体、抗病自交系“mm”、感病自交系“白阳”作为供试材料。二、霜霉病抗性鉴定对供试材料进行霜霉病抗性鉴定。具体步骤如下：在温室中种植供试材料，种植的第16天，大部分植株两片真叶完全展开并有新的真叶露出(即两叶一心期)时进行霜霉病的接种。将每毫升含有1×104或1×105霜霉致病孢子的悬浮液，利用喷雾法均匀得喷施到叶片背面。将接种后的植株在黑暗，100％湿度，18-20℃的环境中放置24小时。随后，移入16小时光照8小时黑暗的光周期的生长环境中，并继续保持一定湿度维持4-5天。调查病情的前一天再进行黑暗加湿处理16-24小时，促进感病植株的霉层生长。调查病情的分级标准按照表1进行。将发病级别为0级、1级和3级的植株定义为抗病植株；将发病级别为5级、7级和9级的植株定义为感病植株。鉴定结果表明：1056个株系组成的f2群体中，834个株系为抗病株系，222个株系为感病株系。三、基因型鉴定基于kasp技术对f2群体植株在snpa04_5326733标记上进行基因分型。具体步骤如下：取供试材料的幼嫩叶片，按照doyle和dickson(1987)并略有改进的十六烷基三乙基溴化铵法(ctab)进行全基因组的dna提取。1、引物的合成和引物预混液的配制将实施例1中的a04_5326733_a1、a04_5326733_a2和a04_5326733_c引物均稀释成10μmol，并按照体积比为6:6:15的比例混匀，得到540μl引物预混液。2、基因分型snp基因分型过程按照lgc公司提供的kasp技术的实验流程进行，以下使用的试剂、耗材和仪器没有特殊说明的均由lgc公司提供，包括试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照lgc公司的操作指南kaspuserguideandmanual(l(www.lgcgenomics.com))进行，反应在384孔板(partno.kbs-0750-001)或1536微孔板(partno.kbs-0751-001)中进行，反应体系为3ul或1ul。具体步骤如下：首先利用k-pette分液工作站将稀释好的待测dna模板(4-10ng/μl)1.5ul和空白对照(notemplatecontrol，ntc)分别加入384孔或者1536孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，lgc公司)，dna变成干粉备用。然后在kraken操作系统下利用meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入2xmastermix(384孔板货号partno.kbs-1016-002或1536微孔板货号partno.kbs-1016-011)与引物混合液，mix分装完毕立即将微孔板依次放在kube热封仪和fusion激光封膜仪上封膜，利用hydrocyler进行高通量水浴pcr扩增。每一轮最多进行14块pcr反应板(384和1536)，384孔板或1536孔板的反应体系如表3所示。表3、384孔板或1536孔板的反应体系注：meridian在分液过程中为排气泡每加1对引物时需损失230μl的反应液，即2xmastermix和ddh2o各115μl。pcr反应在高通量水浴系统hydrocycler中进行，具体程序为94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸：以touchdown程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。扩增结束后，利用bmgpherastar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全，从kraken软件中导出实验结果。若待测植株在a04_5326733位点的核苷酸为a和t，则该植株的基因型为at基因型；若待测植株在a04_5326733位点的核苷酸均为t，则该植株的基因型为tt基因型；若待测植株在a04_5326733位点的核苷酸均为a，则该植株的基因型为aa基因型。结果如表4、表5和图1所示，图1中每个圆点代表一份待测材料，其中红色圆点表示该位点是纯合基因型“a:a”；蓝色圆点表示该位点是纯合基因型“t:t”；绿色圆点表示该位点是杂合基因型“a:t”或“t:a”；粉色圆点表示该位点基因型不确定，为“？”黑色圆点表示ntc，即为水对照。从表4、表5和图1中可以看出：834个抗病株系的基因型均为at基因型或aa基因型，222个感病株系的基因型均为tt基因型。基因分型结果显示，本发明的分子标记对待测大白菜的分型效果均很好。说明a04_5326733位点与霜霉病抗性紧密连锁，可用于鉴定霜霉病抗性。表4、f2群体植株感病级别与a04_5326733标记连锁情况标记名称标记基因型植株抗病等级植株数目a04_5326733a:a或a:t0级，1级和3级834a04_5326733t:t5级，7级和9级222表5、亲本材料、f2群体植株感病级别与a04_5326733标记连锁情况因此，在实际应用中，可按照如下方法鉴定待测白菜的霜霉病抗性：检测待测白菜a04_5326733位点的多态性或基因型，若待测白菜a04_5326733位点的基因型为at或aa，则待测白菜抗霜霉病或候选抗霜霉病；若待测白菜a04_5326733位点的基因型为tt，则所述待测白菜感霜霉病或候选感霜霉病；a04_5326733位点为白菜基因组中序列1自5’端第101位核苷酸，a04_5326733位点为t/a多态。实施例3、抗病基因brrlp48及其功能分析一、抗病基因brrlp48的瞬时表达实验160kb的bra-dm04区间内有16个功能注释基因，根据注释有四个可能的抗病候选基因，这些候选基因编码的蛋白都含有亮氨酸富集重复(lrr，leucine-richrepeat)结构域，由于标记a04_5326733在抗病候选基因brrlp48内部，其编码一个含有7个lrr(leucine-richrepeat)结构域的跨膜蛋白，属于受体类蛋白(rlp,receptor-likeprotein)家族。因此，将brrlp48候选基因应用到白菜子叶的瞬时表达实验中验证其抗病功能。brrlp48候选基因序列如序列6所示，cds序列如序列7所示，cds序列编码的蛋白质的氨基酸序列如序列5所示。在白菜子叶中瞬时表达brrlp48基因，瞬时表达后三天对瞬时表达brrlp48的植株子叶按照实施例1步骤三中的接种方法进行霜霉菌的接病处理。接种7天后观察抗病表型并统计霜霉抗病表型。瞬时表达实验的具体步骤如下：(1)用于白菜瞬时转化的表达载体的构建将序列7所示的brrlp48的cds序列构建到pcambiasuper1300载体中，得到重组载体pcambiasuper1300-brrlp48，该重组载体中，brrlp48基因的下游融合了gfp荧光蛋白标签。同时以只表达gfp荧光蛋白的pcambiasuper1300空载体作为对照载体。(2)注射菌液的制备分别将步骤(1)中构建的重组载体pcambiasuper1300-brrlp480和空载体pcambiasuper1300转化到农杆菌菌株gv3101中，得到重组菌。挑取阳性重组菌单菌落置于5mllb培养基中28℃中震荡培养48小时。将培养后产物转移至培养基甲中，28℃中震荡培养16小时。当菌液培养至od600大约为2.0-2.5时，3200g离心10分钟，弃上清液，收集菌体沉淀。将重组载体pcambiasuper1300-brrlp480和空载体pcambiasuper1300的菌体沉淀用浓度为10mm的mgcl2溶液重悬至od600为0.4；将含有p19质粒的菌体沉淀用浓度为10mm的mgcl2溶液重悬至od600为0.2。向重悬后菌液中加入乙酰丁香酮，使其终浓度为200μm，将od600为0.4的pcambiasuper1300-brrlp480或pcambiasuper1300空载体菌液分别与od600为0.2的p19菌液等体积混匀，使菌液终浓度分别为od600＝0.2和od600＝0.1，并在室温静置3小时，分别得到注射菌液。(3)瞬时转化选择感病亲本“白阳”子叶(真叶刚长出时即子叶长到最大时)作为外植体进行注射。用1ml无针头的注射器将注射菌液注射到外植体中。注射后将其置于光照16小时25℃，黑暗8小时20℃，湿度50-60％的条件下生长，3天后，通过在荧光共聚焦显微镜下的观察方法检测目的基因的表达情况。霜霉抗病表型的观察结果如图2a所示。结果表明：注射空载体的子叶在接病后生长出明显的白色霉层，而注射了brrlp48的子叶接病后出现了明显的抗病性，产生了明显的抗病能力，说明brrlp48瞬时表达后可以增强感病亲本子叶的抗病能力。霜霉抗病表型的统计结果如图2b所示，从图中可以看出：注射空载体的子叶在接病后生长霉层的子叶百分比高达81.6％，绝大部分是感霜霉病的，而注射了brrlp48的子叶接病后只有约18.7％的子叶生长出了霉层，其抗病能力显著增强。brrlp48基因相对表达量的检测结果如2c所示，从图中可以看出：注射brrlp48和空载体之后的brrlp48基因相对表达量上调倍数相似，都大概在25-27倍左右，但抗病表型有显著差异，因此，brrlp48具有关键的抗病功能。综上所述，brrlp48基因与大白霜霉病抗性相关，可提高白菜的霜霉病抗性。二、rt-pcr检测brrlp48基因表达量按照实施例1步骤三中的接种方法分别对抗感亲本“mm”和“白阳”进行霜霉菌的接病处理。通过rt-pcr检测brrlp48基因在抗感亲本“mm”和感病亲本“白阳”接病处理后的0h，2h，6h，12h，24h和48h的表达量。结果如图3a所示，在抗病亲本“mm”中，brrlp48在接病后2h到6h表达量上调了30-35倍，而在感病亲本“白阳”中的表达量仅上调了2.5倍左右。三、抗病基因brrlp48启动子序列及功能分析1、抗病基因brrlp48启动子序列分析为了探究brrlp48的表达在接病后大量诱导的原因，通过pcr获得了brrlp48在抗感亲本中atg上游约2kb的启动子序列。通过对序列的转录元件的预测(plantcarehttp://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)发现由于序列变异，抗病材料中增加了两个茉莉酸响应元件和一个水杨酸响应元件(图3b)。茉莉酸与水杨酸在抗病免疫反应中起着非常重要的作用。因此，抗病激素响应元件的增加很有可能是brrlp48在接病后大量诱导的原因，从而最终决定了其抗病表型。2、抗病基因brrlp48启动子功能分析为了进一步验证抗病基因型中增加的转录元件的功能，分别检测了抗病亲本“mm”和感病亲本“白阳”在接病处理后的水杨酸(sa)和茉莉酸(ja)含量。结果如图4a和图4b所示，从图中可以看出：水杨酸含量在抗病亲本“mm”接病后4h和12h大幅提高，上升幅度大大高于感病亲本，而茉莉酸含量在抗感亲本接病处理后中都有显著的下降趋势。由此可以看出：水杨酸参与了白菜霜霉病的抗病反应中。用1.5mm水杨酸和1mm茉莉酸向抗感亲本的叶片背面进行喷施，在喷施处理后不同时间点对brrlp48的表达量进行检测。结果如图4c和图4d所示，只有水杨酸可以显著诱导抗病亲本中brrlp48的表达量。因此，水杨酸含量在白菜霜霉病侵染后大量升高。在抗病材料“mm”中，由于序列变异，抗病基因brrlp48启动子序列中增加了水杨酸响应元件，因此，其表达被大量诱导，从而导致了抗病材料的抗病表型。因此，brrlp48为白菜霜霉病关键的抗病基因。序列表<110>北京市农林科学院<120>位于白菜a04染色体上的抗霜霉病基因brrlp48及与其相连锁的snp标记<160>9<170>patentinversion3.5<210>1<211>201<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1acctattgtgaccaacatcaagtgatctcaaccgaccaccgatagattcctgaggaaaag60caccagagagactgttattctgaagatgcaagaccgaaattgtagtattgaaattcttaa120aacactgaggtatgaaaccgctgaagttattgttagataatacaagtgtctgaagattaa180ccagttcacatatcattcttg201<210>2<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gaaggtgaccaagttcatgctcctcagtgttttaagaatttcaatactact51<210>3<211>51<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gaaggtcggagtcaacggattcctcagtgttttaagaatttcaatactaca51<210>4<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ctgttattctgaagatgcaagaccgaaat29<210>5<211>797<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5metilehissercysserglyarglysmetilethrtrpserleucys151015leuvalpheserleusertyrservalleuvalphealaserproala202530lysasnleucyshisproaspglnargaspalaleutrpaspphelys354045asnglupheilevalglnlysaspaspargleusertyrserasnpro505560lysthrgluphetrpargasnasnthraspcyscyssertrpaspgly65707580valargcystyrleuglnthrglyasnvalvalgluleuasnleutrp859095glyserpheleuserglyproleuargserasnserserleuphearg100105110leuglnhisleugluileleuasnleuglyserasnproasnleutyr115120125glyasnileproserserleuglyasnleusertyrleuthraspleu130135140valleuseraspcysglyphethrglygluleuproaspsermetgly145150155160asnleuasnargleuileaspleuargleutyrasnasnlysleuarg165170175glyasnpheproleupheleuleuasnleuseraspilethrglnile180185190serleuserserasnasnpheileglyserileproserserleuphe195200205leuserserserleuvalvalleugluleuserglyasnasnpheser210215220glyproleuaspileglyasnvalserserproserlysleuargasn225230235240leuglyleuglyargasnasnpheserglyproileleuglyserthr245250255serlysleuvalserleulysaspleuaspleuserphetrpargasp260265270serleuasnpheserilepheleuhisleuthrserleugluargleu275280285aspleusertyrproasnthrargilemetvalaspleuaspleuphe290295300serhisphelysserleutrpaspleuasnleuserglyasnasnleu305310315320lysileserserthrleuhispheproserproiletyrmetleulys325330335leusersercysasnileserhispheprolyspheleuglncyslys340345350thrserleusertyrleuaspileseralaasnglnilegluxaagln355360365valproglutrpleutrpargleuargtyrvalaspileserglnasn370375380serpheserserphegluglyproseraspvalpheglnargsergly385390395400argglnproasnserthrmetphepheleuglyserglyasnleuphe405410415thrglygluileproargmetilecysgluleuvalasnleuglnthr420425430leuvalleuserasnasnasnpheserglypheileproglncysphe435440445lysasnpheasnthrthrileservalleuhisleuglnasnasnser450455460leuserglyalapheproglngluserileglyglyargleuargser465470475480leuaspvalglyhisasnargleuserglylysleuprolysserleu485490495valasncysthrglnleuglupheleuasnvalgluaspasnargphe500505510asnaspthrph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