检测莲草直胸跳甲CCO基因表达特性的引物及方法与流程

本发明涉及检测莲草直胸跳甲cco基因表达特性的引物及方法，属于生物技术领域。

背景技术：

莲草直胸跳甲属鞘翅目，叶甲科，是空心莲子草的主要生防天敌之一。georgevogt于1962年首次发现了莲草直胸跳甲对空心莲子草有很好的控制作用。其后，莲草直胸跳甲在美国、澳大利亚等地被广泛应用于空心莲子草的控制，并取得了较好的防治效果。我国于1986年从美国引进莲草直胸跳甲，并应用于空心莲子草的生物防治，在四川、浙江、福建、广西等地取得一定的成功。

细胞色素氧化酶(cco)做为线粒体内膜上呼吸链和氧化磷酸化系统的关键酶，担当着最终将电子传递给分子氧的重要任务，是电子传递链的最后一个载体n“。atp的产生必须以电子传递为前提和基础，呼吸链只有生成atp才能推动电子的传递，两者之间是相辅相成，互相藕联的，coo做为这一藕联过程的关键电子载体，其含量的多少和活性的高低直接影响着呼吸链电子传递过程的效率，直接影响机体的能量产生。线粒体是细胞呼吸和产生atp的部位，线粒体的内膜含有呼吸链和氧化磷酸化系统的全部酶，包括nadh脱氢酶、cco等多种酶，电子通过呼吸链上的这些酶，最终由cco传递给分子氧，电子传递链的各种成分通过氧化还原反应将nadh提供的电子依次向下传递，最终电子被氧分子接受，还原为水，同时释放出能量供机体需要。在这些酶中，细胞色素氧化酶(cco)是其标志酶，它处于细胞色素系统的末端，是电子传递链的最后一个载体，包括细胞色素a和a3，此酶把呼吸底物的电子经过细胞色素系统直接传递给分子态氧，电子传递和atp的形成在正常组织细胞内是相耦联的，atp的生成必须以电子传递为前提，而呼吸链只有生成atp才能推动电子的传递。需氧细胞内，糖、脂肪以及氨基酸的分解都通过各自的分解途径，但最终都经过一段共同的氧化过程。在这个过程中，糖、脂肪以及氨基酸氧化脱下氢而形成的还原型辅酶nadh和fadh2，沿电子传递链以电子和h+的形式最后传递到氧而形成水，其中所释放的自由能即用于促使adp和pi形成atp。故cco活性的高低及含量的多少直接影响着呼吸链传递电子的效率，决定了机体产生能量部位和产能的多少，也就决定了机体运动时能够达到的最大工作强度及最长持续时间，它直接决定了耐力性运动项目成绩，这在运动中是最重要的，也是整个运动训练所追求的目标。

关涛等（2007）研究得出低氧训练，能使大鼠心肌产生一定的应激反应，使心肌组织中的cco水平得到代偿性的提高。关于莲草直胸跳甲cco基因的表达等研究国内外未见报道，因此采用实时荧光定量pcr研究不同co2浓度处理下莲草直胸跳甲cco基因的表达特性，结果表明，随着co2浓度的升高，雌雄虫cco基因的表达量均升高，这与转录组表达量上调的变化趋势一致，说明co2浓度升高可以影响cco基因的表达调控。

技术实现要素：

本发明的目的是提供检测莲草直胸跳甲cco基因表达特性的引物及方法，为全面了解莲草直胸跳甲cco基因的表达特性而设计的不同处理co2浓度。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

将取食不同co2浓度培育的空心莲子草的莲草直胸跳甲雌雄虫各采9只到eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。

设计一对检测莲草直胸跳甲cco基因表达特性的引物，包括符合荧光定量pcr反应特点的上下游引物：

cco-f：5`-ggtggtgattagtcggttgtt-3`

cco-r：5`-aatctgttcgcttcattcattgc-3`

以及作为内参基因的上下游引物：

tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`

tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`

本发明所述检测莲草直胸跳甲cco基因表达特性的荧光定量pcr法，按如下步骤进行：

（1）cdna第一链合成：提取样本的总rna并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的rna为模板反转录得到的cdna；

（2）对下述引物进行常规pcr检测

该基因的荧光定量上下游引物：

cco-f：5`-ggtggtgattagtcggttgtt-3`

cco-r：5`-aatctgttcgcttcattcattgc-3`

以及作为内参基因的上下游引物：

tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`

tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`

常规pcr扩增体系为25µl：10×buffer2.5µl，dntp1.0µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，100ng/µlcdna模板1.0µl，ex-taqe0.15µl，水19.35µl；

常规pcr反应程序如下：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；

（3）实时荧光定量pcr反应：

以步骤（1）得到的cdna为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量pcr反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值。

实时荧光定量pcr扩增体系为：sybr^®premixextaq^tm12.5µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，100ng/µlcdna1.0µl，补足水至25µl；实时荧光定量pcr反应程序如下：95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火30s，40个循环。

本发明更加详细的试验方法如下：

莲草直胸跳甲cco基因的实时荧光定量pcr检测方法可通过以下步骤实现：

（1）引物设计：根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲cco基因的序列，使用dnaman软件设计适合荧光定量pcr检测的特异性引物，引物序列如下：

cco-f：5`-ggtggtgattagtcggttgtt-3`

cco-r：5`-aatctgttcgcttcattcattgc-3`

同时，根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列，设计用于荧光定量pcr内对照物的引物，引物序列如下：

tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`

tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`

（2）莲草直胸跳甲处理试验：在对照co2浓度（420μl·l^－1）和高co2浓度（750μl·l^－1）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同co2浓度的雌雄虫各采9只到eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样处理后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。

（3）cdna第一链合成：参照全式金公司的transzol^tmupplusrnakit试剂盒说明书提取总rna，按照transscript公司的one-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒说明书，合成cdna第一链。

（4）实时荧光定量pcr反应：实时荧光定量pcr采用tccoara公司的sybr^®premixextaq^tm试剂盒进行。以上述合成的cdna第一链为模板，上述cco-f、cco-r和tubulin-f、tubulin-r为特异性引物，进行荧光定量pcr程序，每个样品设3个平行重复，扩增后取所得平行ct值的平均数。

实时荧光定量pcr扩增体系为：sybr^®premixextaq^tm12.5µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，100ng/µlcdna1.0µl，补足水至25µl；

实时荧光定量pcr反应程序如下：95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火30s，40个循环。

（5）莲草直胸跳甲cco基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为：相对mrna表达=2^-δδct×100%，其中ct值=靶基因ct值-tubulinct值。

（6）图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同co2浓度培育的空心莲子草后cco基因的差异表达。结果表明，随着co2浓度的升高，雌雄虫cco基因的表达量均升高，并与转录组的表达量变化趋势一致，这为我们深入开展莲草直胸跳甲cco基因的研究提供了重要的基础数据。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明中的不同co2浓度处理措施，对昆虫绝大部分细胞色素氧化酶基因都适用，这对全面深入研究基因表达特性具有重要的意义。

（2）本发明所述高效快捷的荧光定量pcr法，包括荧光定量pcr程序等，实际用时50min，相对于现有技术大大缩短了反应时间，具有高效快捷的特性。

（3）本发明所述的荧光定量pcr法，提供常规pcr电泳结果图，可以直观快捷的反映出引物的特异性。

附图说明

附图为莲草直胸跳甲雌雄虫cco基因转录水平的荧光定量pcr检测结果。

图1：莲草直胸跳甲cco基因荧光定量引物常规pcr产物电泳结果：产物长度为126bp，marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。

图2：莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量引物常规pcr产物电泳结果：产物长度为199bp，marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。

图3：莲草直胸跳甲雌虫（f）取食不同co2浓度培育的空心莲子草后cco基因的差异表达，柱形和左边坐标轴为荧光定量的表达量，散点和右边坐标轴为转录组的表达量。

图4：莲草直胸跳甲雄虫（m）取食不同co2浓度培育的空心莲子草后cco基因的差异表达，柱形和左边坐标轴为荧光定量的表达量，散点和右边坐标轴为转录组的表达量。

具体实施方式

以下结合具体实施例及附图说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制发明，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1

试验材料的处理

在对照co2浓度（420μl·l^－1）和高co2浓度（750μl·l^－1）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同co2浓度的雌雄虫各采9只到eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样收集后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。

实施例2

引物的设计

（1）引物设计：根据转录组测序得到的莲草直胸跳甲cco基因的序列，使用dnaman软件设计适合荧光定量pcr检测的特异性引物，引物序列如下：

cco-f：5`-ggtggtgattagtcggttgtt-3`

cco-r：5`-aatctgttcgcttcattcattgc-3`

莲草直胸跳甲cco基因荧光定量pcr产物长度为126bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量pcr检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

（2）同时，根据转录组测序得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列，设计用于荧光定量pcr内对照物的引物，引物序列如下：

tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`

tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`

莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量pcr产物长度为199bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量pcr检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。

实施例3

总rna的提取

参照全式金公司的transzol^tmupplusrnakit试剂盒说明书提取总rna，用液氮将虫体研磨成粉，加入1mltranszol^tmup，转到1.5ml转离心管中，室温静置5min后，加入200μl氯仿/1mltranszol^tmup，剧烈振荡30s，室温孵育3min。4℃10000g离心15min后，移上层水相（一般<80%）于新的离心管中，加入1/3体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀。将rna离心柱套于2ml收集管中，将上步混合物全部转入离心柱中，12000g，30~60s离心，弃流动相，重复使用收集管。加入500μlcb9，室温12000g离心30s，弃流动相，再加入500μlcb9，室温12000g离心30s，弃流动相。加入稀释的500μlwb9，12000g离心30s，弃流动相，再加入稀释的500μlwb9，12000g离心30s，弃流动相。12000g离心2min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。将离心柱放入rnase-freetube中，加50μlrnase-freewater在离心柱的中央，室温静置1min，12000g离心1min，洗脱rna。所得的rna置于-80℃备用。

实施例4

cdna第一链合成：按照transscript公司的one-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒说明书步骤，以实施例3中的rna为模板，反转录生成cdna第一链，具体步骤如下：

（1）反转录体系

（2）42℃温育30min。

（3）85℃加热5min，产物可放在-20℃、-80℃保存。

实施例5

进行荧光定量pcr反应。实时荧光定量pcr采用tccoara公司的sybr^®premixextaq^tm试剂盒进行。以实施例4中的cdna为模板，用实施例2中的引物进行实时荧光定量pcr扩增反应，每个样品设3个平行重复，扩增后取所得平行ct值的平均数。

（1）实时荧光定量pcr扩增体系如下：

sybr^®premixextaq^tm12.5µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，100ng/µlcdna1.0µl，补足水至25µl；

（2）实时荧光定量pcr反应程序如下：95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火30s，40个循环。

（3）实时荧光定量pcr完成后，根据ct值计算不同处理条件下相对表达量的比值2^-δδct。莲草直胸跳甲cco基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为：相对mrna表达=2^-δδct×100%，其中ct值=靶基因ct值-tubulinct值。

表1：莲草直胸跳甲雌虫（f）取食不同co2浓度培育的空心莲子草后cco基因的c(t)值、平均值、标准偏差、荧光定量表达量及转录组的表达量

表2：莲草直胸跳甲雄虫（m）取食不同co2浓度培育的空心莲子草后cco基因的c(t)值、平均值、标准偏差、荧光定量表达量及转录组的表达量

（4）图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同co2浓度培育的空心莲子草后cco基因的差异表达。结果表明，随着co2浓度的升高，雌雄虫cco基因的表达量均升高，与转录组的表达量上调的变化趋势一致。这为我们深入开展莲草直胸跳甲cco基因的研究提供了重要的基础数据。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>检测莲草直胸跳甲cco基因表达特性的引物及方法

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